Box-Behnken響應面法優化野菊花多糖的提取工藝及其抗氧化活性研究△

梁艷妮，李歡歡，唐志書，張東博，雷莉妍，王征

陜西中醫藥大學 陜西省中藥資源產業化協同創新中心/陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712083

野菊花為菊科植物野菊GhrysanthemumindicumL.的干燥頭狀花序，清熱解毒、瀉火平肝，臨床用于疔瘡癰腫、目赤腫痛、頭痛眩暈[1]。野菊花含萜類成分較多，主要存在于揮發油中；黃酮類化合物是其重要的藥效成分[2-3]，具有廣譜抗菌、抗病毒、降壓、增加冠脈血流量、抑制血小板聚集、抗炎、抗氧化等作用[4]。中藥多糖具有抗氧化、抗腫瘤、促進免疫等藥理活性[4-5]。目前國內對野菊花、野菊莖葉多糖的提取分離純化工藝[6-9]、含量測定[10]、脫色工藝、結構鑒定及活性[11]均有研究。李厚兵等[8]優化了野菊花多糖的大孔吸附樹脂純化工藝，陸穎等[9]采用大孔吸附樹脂LSA-21脫色處理，再經DEAE-52 纖維素柱和Sephadex G75 凝膠色譜分離純化得3個均一野菊花多糖。膜分離技術以選擇性透過膜為分離介質，以電位差、濃度差或壓差為推動力，從而實現對特定組分的分離、提純和濃縮。膜分離技術以其高效、節能、無二次污染、低成本、高選擇性等優點被廣泛應用于各個領域，可用于中藥提取液的除雜、分離純化、濃縮等方面[12-15]。目前已經應用膜分離技術對枸杞多糖[16]、六味地黃糖類[17]、沙棗多糖[18]、馬尾藻多糖[19]等多糖類成分進行了分離純化，效果良好。與均勻設計與正交設計相比，Box-Behnken響應面法采用多元二次回歸方程擬合各因素與響應值之間的函數關系，具有試驗次數少，精度高，預測性好的優點[20-22]。本文采用水提醇沉法，選取料液比、提取時間及提取溫度3個因素，在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken Design(BBD)優化野菊花多糖的提取工藝，采用膜分離純化后評價野菊花多糖的體外抗氧化活性，為野菊花多糖開發利用提供參考。

1 材料

1.1儀器

HH-2恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；KQ-300DE數控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；GB204 電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；FA2004B萬分之一電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；VaCo5低溫冷凍干燥儀(智拓科技控股有限公司)；FE-1000AD固體粉碎機(天津鑫博得儀器有限公司)；UV-2600紫外分光光度計(日本島津制作所)；LNG-CM-101膜分離設備(上海朗級膜分離設備工程有限公司)。

1.2 試藥

無水D-葡萄糖對照品(批號：110833-201205，純度：95%～98%)，購自中國食品藥品檢定研究院；所用試劑均為分析純。

野菊花(批號：110801，產地陜西)為菊科植物野菊GhrysanthemumindicumL.的干燥頭狀花序，購自陜西興盛德藥業，由陜西中醫藥大學王繼濤高級實驗師鑒定。

2 方法與結果

2.1 多糖的測定

參照鄧寒霜等[20]的多糖含量測定方法，采用苯酚-硫酸法測定野菊花中多糖的含量。精密稱取無水葡萄糖對照品適量于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容制得200 μg mL-1的葡萄糖對照品溶液。依次精密量取此對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL于10 mL容量瓶中，加水定容。分別精密量取各質量濃度對照品溶液0.6 mL，加入5%苯酚溶液1.2 mL，并迅速加入4 mL濃硫酸，搖勻后置于沸水浴中保溫30 min，取出后冷卻至室溫，以蒸餾水為空白對照，測定490 nm處吸光度。以多糖濃度為橫坐標(X)，吸光度值為縱坐標(Y)制作標準曲線，得線性方程Y=6.43X+0.035 7(r=0.998 7)，線性范圍為20～120 μg mL-1。

2.2 多糖的提取

2.2.1 工藝流程 將野菊花干品粉碎成粗粉，用10倍體積石油醚回流脫脂3次，每次1.5 h，常溫干燥。稱取10 g脫脂野菊花置于圓底燒瓶中，按一定料液比，浸提溫度和浸提時間熱水提取2次，冷卻濾過，合并上清并濃縮后加入4倍量80%乙醇靜置過夜，所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮洗滌后加適量蒸餾水復溶，冷凍干燥得野菊花多糖。

2.2.2 多糖提取率的計算 將水提醇沉得到的多糖冷凍干燥，精確稱取樣品多糖 10 mg，定容至100 mL，搖勻，即得樣品供試液；精確吸取供試液 1 mL置于10 mL試管中，根據2.1項下操作于490 nm 處測定 A 值，通過回歸方程計算樣品中多糖濃度。按式(1)計算多糖提取率。

提取率=[(多糖濃度×樣品體積×定容體積)]/原料干質量×100%

(1)

2.3 單因素試驗

參照2.2.1項工藝流程，每次稱取10 g脫脂野菊花干燥粉末，進行單因素試驗，分別考察料液比(1∶16、1∶20、1∶24、1∶28、1∶32 g mL-1)、提取時間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)和提取溫度(60、70、80、90、100 ℃)對野菊花多糖提取率的影響。

2.3.1 料液比對野菊花多糖提取率的影響 在固定提取溫度90 ℃，提取時間3.0 h時，考察不同料液比1∶16、1∶20、1∶24、1∶28、1∶32 g mL-1對野菊花多糖提取率的影響，結果見圖1。從圖1可以看出，野菊花多糖提取率呈先升高后降低的趨勢，當料液比為1∶24時，野菊花多糖提取率最大，此時野菊花多糖提取率為2.91%，在溶劑量較小時多糖溶解不完全，而在溶劑量較大時會導致其他雜質的溶解。因此將料液比為1∶20、1∶24、1∶28 g mL-1作為響應面優化試驗的水平。

圖1 料液比對多糖提取率的影響

2.3.2 提取時間對野菊花多糖提取率的影響 在固定提取溫度90 ℃，料液比1∶24 g mL-1時，分別考察提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h對野菊花多糖提取率的影響(見圖2)。圖2中野菊花多糖提取率呈先升高后降低的趨勢，當提取時間為2.5 h時，野菊花多糖提取率最大，此時野菊花多糖提取率為3.01%，提取時間較短時多糖溶解可能不完全，而在提取時間較長時多糖的結構被破壞。因此提取時間為2.0、2.5、3.0 h作為響應面優化試驗的水平。

圖2 提取時間對多糖提取率的影響

2.3.3 提取溫度對野菊花多糖提取率的影響 在固定料液比1∶24 g mL-1，提取時間2.5 h時，分別考察60、70、80、90、100 ℃對野菊花多糖得率的影響(見圖3)。圖3中野菊花多糖提取率呈先升高后降低的趨勢，當提取溫度為90 ℃時，野菊花多糖提取率最大，此時野菊花多糖提取率為3.01%，在提取溫度的過低時可能導致多糖溶解不完全，而在提取溫度較高時導致多糖的結構被破壞和部分多糖被水解。因此提取溫度為80、90、100 ℃作為響應面優化試驗的水平。

圖3 提取溫度對多糖提取率的影響

2.4 響應面優化試驗

2.4.1 Box-Behnken設計與分析 根據單因素試驗結果分別以料液比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)為自變量，以多糖提取率為響應值，利用Design-Expert.V8.0.6中Box-Behnken模型設計試驗組作響應面分析。Box-Behnken試驗設計因素水平表見表1，試驗設計與結果見表2，方差分析見表3。

通過Design-Expert.V8.0.6得到3個因素：料液比、提取溫度和提取時間對野菊花多糖得率影響的二次多項回歸方程為Y=3.22+0.12A+0.064B+0.31C-0.21AB-0.40AC+0.074BC-0.29A2-0.79B2-0.68C2。表3中該回歸模型P=0.003 8<0.01差異有統計學意義，失擬項P=0.906 1>0.05，差異無統計學意義，表明該模型擬合度好，試驗誤差小，能夠準確反映3個因素對野菊花多糖提取率的影響。表3中一次項C和交互項AC的P<0.05，表明提取溫度和料液比的交互作用對多糖得率的影響差異有統計學意義；二次項B2和C2的P<0.01，表明提取溫度和提取時間的平方項對多糖得率的影響差異有統計學意義。比較各項F值可知各因素對響應值的影響大小為C>A>B，即提取溫度>料液比>提取時間。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平表

表2 Box-Behnken試驗設計與結果

表3 響應面回歸模型方差分析

注：**P<0.01；*P<0.05。

2.4.2 響應面圖分析與優化 通過多元回歸方程作三維效應曲面圖和二維平面等高線圖，從圖4～6可以直觀分析3個因素之間的交互作用以及對多糖提取率的影響。由等高線可知，AB、AC交互作用顯著(等高線橢圓狀)，BC交互作用不顯著(等高線圓形)。由響應面可看出，提取溫度對多糖的提取率的影響顯著，響應面陡峭；而料液比與提取時間對多糖的提取率的影響不顯著，響應面較平緩。

圖4 料液比與提取時間對野菊花多糖提取率的交互影響

圖5 料液比與提取溫度對野菊花多糖提取率的交互影響

圖6 提取時間與提取溫度對野菊花多糖提取率的交互影響

2.4.3 驗證實驗 根據響應面分析優選得到水提醇沉野菊花多糖的最佳工藝：料液比為1∶25 g mL-1，92.3 ℃下提取2.5 h，野菊花多糖的理論提取率為3.25%。驗證上述工藝條件得到野菊花多糖提取率為(3.18±0.07)%，n=3，表明本文優化得到的野菊花多糖最佳提取條件穩定，工藝可靠。

2.5 野菊花多糖的分離純化

2.5.1 Sevage法脫蛋白試驗 取1 g多糖粗粉，溶解成100 mL多糖溶液，在多糖溶液中加入三氯甲烷20 mL，然后加入正丁醇4 mL，置于水浴恒溫振蕩器，37 ℃，240 r min-1劇烈振搖20 min，離心，取上清液。醇沉，抽濾，冷凍干燥得野菊花多糖。

采用考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質含量：精密稱取牛血清蛋白10 mg，用水定容至10 mL容量瓶中，即為對照品溶液。精密移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 mL的蛋白質對照品溶液于8只試管中，加水補至1 mL，搖勻。然后各取0.1 mL溶液于10 mL容量瓶中，再分別加入5 mL考馬斯亮藍顯色液，搖勻，放置2 min，測定595 nm下吸光度。以濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(Y)擬合得到線性方程：Y=0.004 6X+0.005 6(r=0.999 5)，線性范圍為10～80 μg mL-1。取0.5 mL的多糖稀釋液，同法顯色后測吸光度值A，代入線性方程計算脫蛋白前后多糖中的蛋白質量濃度，按公式(2)計算蛋白質脫除率，公式(3)計算多糖保留率：Sevage法蛋白質脫除率為23.58%，多糖保留率為63.97%，多糖損失較小。

蛋白質去除率=(c1-c2)/c1×100%

(2)

式中c1、c2分別為脫蛋白前后蛋白質的質量濃度，c1=71.7 μg mL-1，c2= 54.8 μg mL-1。

多糖保留率=mj/mi×100%

(3)

式中mi、mj分別為脫蛋白前后多糖的質量濃度，mj=639.7 mg mL-1，mi=10 mg mL-1。

2.5.2 過氧化氫法脫色素試驗 取1 g多糖粗粉，溶解成100 mL多糖溶液，加入30%H2O2溶液10 mL，10%NaOH溶液調節pH值至7.0后，55 ℃水浴不斷攪拌1 h，加熱除去H2O2，冷卻至室溫，醇沉，抽濾，冷凍干燥得野菊花多糖。通過公式(4)計算多糖脫色率，公式(5)計算多糖保留率。

脫色率=(Ai- Aj)/Ai×100%

(4)

式中Ai、Aj分別為脫色前后的吸光度，Ai= 0.778，Aj= 0.302。

多糖保留率=mj/mi×100%

(5)

式中mi、mj分別為脫色前后多糖的質量濃度，mj=296.5 mg mL-1，mi=10 mg mL-1。

比較脫色前后吸光度得過氧化氫法脫色率為61.18%，多糖保留率為29.65%。過氧化氫法脫色素效果明顯，但多糖損失較多。

2.5.3 膜分離純化試驗 將野菊花粗多糖配制成10 mg mL-1的多糖水溶液，壓力恒定，分別過0.8、0.2 μm陶瓷膜得截留液和滲透液，測試膜分離所得截留液和滲透液的多糖含量及多糖純度。當膜孔徑由0.8 μm變為0.2 μm時，野菊花多糖損失率至少為70%，按公式(6)計算；野菊花多糖溶液的顏色由黃褐色變成淺黃色；滲透液顏色淺于截留液顏色，且截留液野菊花多糖含量比滲透液多糖含糖量高；0.8 μm滲透液中野菊花多糖回收率與純度均高于0.2 μm滲透液，表明野菊花中多糖分子直徑多大于0.2 μm。

多糖損失率=(mi-mj)/mi×100%

(6)

式中mi、mj分別為過膜前后多糖的質量濃度，mi=10 mg mL-1，mj(0.8 μm)=6.32 mg mL-1，mj(0.2 μm)=2.19 mg mL-1。

2.6 抗氧化活性測定

將0.8 μm陶瓷膜純化后的野菊花多糖作抗氧化活性測定。

2.6.1 DPPH 清除活性 按照陳智坤等[23]清除DPPH 的方法，向6支試管中分別加入 2 mL 6 mmol L-1的 DPPH 乙醇溶液和2 mL質量濃度分別為1、2、4、6、8、10 mg mL-1的野菊花多糖溶液，充分混合，室溫避光反應 30 min后在 517 nm 測吸光度Ax；將多糖溶液換以等體積的無水乙醇同上測定吸光度A0；將DPPH 乙醇溶液換以等體積的無水乙醇，加入不同濃度的野菊花多糖溶液，同上測定吸光度Ay。以上測定均作3組重復樣取平均值，清除率按計算公式(7)計算。

清除率=[1-(Ax-Ay)/A0]×100%

(7)

從圖7可看出野菊花多糖對DPPH 的清除率隨著濃度增大而增強，在1～10 mg mL-1有量效關系，多糖濃度為10 mg mL-1時清除率達90.15%。

圖7 不同濃度野菊花多糖對DPPH· 的清除作用

2.6.2 · OH清除活性 以水楊酸法測定對 · OH[14]的清除能力，在試管中分別依次加入 6 mmol L-1FeSO4溶液2 mL，質量濃度分別為1、2、4、6、8、10 mg mL-1的野菊花多糖溶液2 mL，6 mmol L-1H2O2溶液2 mL，混勻反應10 min，分別加入6 mmol L-1水楊酸溶液2 mL，混勻37 ℃反應20 min后測定510 nm下吸光度Ax；將水楊酸乙醇溶液換以水測定吸光度 Ay，將多糖溶液換以水測定吸光度A0，以上樣品均重復3次取平均值，清除率計算公式為：

· OH清除率=[1-(Ax-Ay)/A0]×100%

(8)

從圖8可看出野菊花多糖對 · OH的清除率隨著濃度增大而增強，在1～10 mg mL-1有量效關系，多糖質量濃度為10 mg mL-1時清除率達78.26%。

圖8 不同濃度野菊花多糖對· OH的清除作用

3 討論

響應面法通過合理的試驗設計進行有限次試驗，利用所得結果采用多元二次回歸方程擬合多因素與響應值的函數關系，可以快速確定最優工藝參數[24-25]。本文首先通過單因素試驗確定因素水平，采用Box-Behnken法設計試驗優化野菊花多糖的水提醇沉前處理條件，建立的二次回歸方程擬合度好，能夠合理反映水提取料液比、提取溫度和時間對野菊花多糖得率的影響。利用此模型得到的野菊花多糖的最佳提取工藝為料液比1∶25 g mL-1，92.3 ℃提取2.5 h，多糖提取率為3.25%。由驗證實驗可知，理論預測值與試驗值接近，結果可靠。黃家利等[26]采用正交設計法優化得到的最佳工藝條件為提取溫度90 ℃，料液比1∶20 g mL-1，提取時間4 h，多糖得率為3.32%。本文所得最佳工藝更經濟，效應面法三維圖使多因素對考察指標的影響更為直觀。

對野菊花粗多糖的純化處理表明：Sevage 法脫蛋白的脫除率為23.58%，過氧化氫法除色素的脫色率為61.18%，0.8 μm陶瓷膜對多糖除雜效果明顯。膜分離純化后的野菊花多糖對DPPH 和 · OH的清除具有濃度依賴性，多糖質量濃度在10 mg mL-1時對DPPH 的清除率可達90%，對 · OH的清除率可達78%，野菊花多糖的強抗氧化性為其進一步的開發提供了理論依據。