響應面法優化莪術多糖提取工藝△

唐森，農佳慧，趙海燕，吳國勇，張鵬*

1.廣西科技師范學院 食品與生化工程學院，廣西 來賓 546119；2.廣西科技師范學院 特色瑤藥資源研究與開發重點實驗室，廣西 來賓 546119

莪術，姜科姜黃屬多年生宿根草本，別名烏姜、姜七、黑心姜、藍心姜等，主產于四川、廣西、浙江。莪術的根莖性溫，具有苦味和辛味，在醫藥行業中，常用于化瘀行氣、消積止痛等，其主要成分莪術油在臨床上用于治療腫瘤、病毒和預防早孕等。莪術多糖具有降血脂、降血糖、增強免疫力等功能[1-3]。現代藥理學研究證實，莪術具有抗癌、抗炎、抗血栓、保肝、降血脂等作用[4-9]。研究證明，植物多糖是藥用植物水煎劑的主要成分，具有復雜的生物活性和功能，被認為是中藥發揮傳統治療作用的主要藥效物質之一。近年來，由于不同植物來源的多糖結構組成復雜多變、功能活性多種多樣，關于多糖提取、分離等研究受到學者們的重視。

目前常用的植物多糖提取方法有溶劑提取法、超聲波輔助溶劑提取法、微波輔助溶劑提取法、超聲-微波協同提取法、酶解法、超臨界流體萃取法等[10-13]。熱水提取法是目前最常用的植物多糖提取方法，其具有操作簡單、設備要求低、提取產物綠色無污染等優點。響應面試驗設計是一種回歸試驗設計方法，通過相關實驗采集數據，采取多元二次回歸方程進行擬合自變量(試驗因素)和響應值(試驗指標)之間的函數關系，建立相應的數學模型，對二次多項式回歸方程的計算分析來尋求最優工藝參數，是解決多變量問題的一種統計方法，其預測結果可信度高，能夠快速確定多因素系統的最佳實驗條件[14-15]。本實驗擬以莪術為原料，采用熱水提取法對莪術多糖進行提取，在單因素試驗基礎上，采用響應面法試驗設計對莪術多糖的熱水提取條件進行優化，以確定莪術多糖的最佳提取工藝條件，為以莪術為原料的植物多糖在中醫藥領域的進一步開發和利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

循環水多用真空泵[SHZ-D(III)型，鞏義市科瑞儀器有限責任公司]；恒溫水浴鍋(HH-S4型，金壇市醫療儀器廠)；數控超聲波清洗器(KQ-300DB型，昆山市超聲儀器有限公司)；紫外/可見分光光度計[UV-9600型，北京北分瑞利分析儀器(集團)公司]；臺式高速冷凍離心機(H3-20KR型，湖南可成儀器設備有限公司)；電子分析天平(FA-2004B型，上海越平科學儀器有限公司)；玻璃儀器氣流烘干器(C-20型，上海貝侖儀器設備有限公司)；中草藥粉碎機(FW-135型，天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試藥

葡萄糖、濃硫酸、石油醚(沸程30～60 ℃)苯酚、乙醇、正丁醇、三氯甲烷均為國產分析純試劑，蒸餾水。

莪術采購于亳州市眾益堂中藥材銷售有限公司，經廣西科技師范學院特色瑤藥資源研究與開發重點實驗室張鵬博士鑒定為莪術正品。

2 方法

2.1 莪術多糖的提取

干燥莪術經中草藥粉碎機粉碎。稱取粉碎過篩(80目)的莪術粉末40 g置圓底燒瓶中，采用索氏提取器用石油醚提取2.0 h脫脂后，過濾，濾渣揮干溶媒備用。精確稱取1.00 g 莪術固體粉末，按試驗設計方案所需提取溫度、提取時間、液料比進行提取操作，所得提取液經抽濾，離心，減壓濃縮回收溶劑至一定體積，即得莪術粗多糖提取液。

2.2 標準曲線的繪制

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取0.010 0 g葡萄糖對照品置于100 mL容量瓶中，加入適量蒸餾水定容，充分搖勻，得到100 μg mL-1葡萄糖對照品溶液。放置于4 ℃冰箱儲存備用。

2.2.2 對照品標準曲線的測定 分別吸取 100 μg mL-1葡萄糖對照液0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL分置于具塞試管中，各加蒸餾水至2.0 mL，再加質量分數為 6%的苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL(與液面垂直加入，勿接觸試管壁，便于反應液充分混合)，搖勻后室溫放置5 min，然后將具塞試管放置于40 ℃水浴中反應20 min，取出冷卻至室溫。另以蒸餾水同上操做作，此為空白對照，在最大吸收波長490 nm處測定吸光值[16-17]。以葡萄糖質量濃度(μg mL-1)為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為：Y=0.083 2X-0.017 04，r=0.999，線性范圍為3.75～11.25 μg mL-1。

圖1 葡萄糖和莪術多糖顯色后400～800 nm全波長掃描圖

2.3 莪術多糖提取率的測定

吸取2 mL莪術粗多糖提取液于容量瓶中，加入適量蒸餾水進行稀釋，精密吸取2 mL莪術粗多糖稀釋液于具塞試管中，加入Savage試劑(V三氯甲烷∶V正丁醇=4∶1)，混勻，2000 r min-1離心20 min，將上清液轉至刻度試管中，得到供試品溶液[18-19]。按照項2.2項下方法測定吸光度，按公式(1)計算莪術粗多糖溶液中多糖的含量。

莪術多糖提取率=(C×D×V)/M×100%

(1)

式中：C為供試液多糖質量濃度(μg mL-1)，D為稀釋倍數，M為樣品質量(μg)。V為最初樣品定容體積(mL)。

2.4 莪術多糖提取的單因素試驗

以液料比、提取溫度、提取時間為單因素進行試驗，篩選出各因素的最適條件。

2.4.1 液料比對莪術多糖提取率的影響 固定提取時間為60 min，提取溫度為80 ℃的條件下，考察不同的液料比100∶1、120∶1、140∶1、160∶1、180∶1對莪術多糖提取率的影響。

2.4.2 提取溫度對莪術多糖提取率的影響 固定料液比為140∶1，提取時間為60 min，考察不同提取溫度50、60、70、80、90 ℃對莪術多糖提取率的影響。

2.4.3 提取時間對莪術多糖提取率的影響 固定液料比為140∶1，提取溫度為80 ℃，考察不同提取時間30、60、90、120、150、180 min對莪術多糖提取率的影響。

2.5 BBD響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，使用軟件Design-Expert(版本8.0.6)中Box-Behnken Design(BBD)進行試驗設計，選取液料比(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)3個對莪術多糖提取效果有影響的試驗因素為自變量，分別以1、0、-1對每個自變量的高、中、低實驗水平進行編碼。以莪術多糖提取率(Y)為響應值，建立三因素三水平BBD響應面試驗研究，利用D-E軟件對實驗結果進行數據處理分析，各實驗因素及水平設計見表1。

表1 BBD響應面試驗因素與水平表

2.6 驗證實驗

3 結果與分析

3.1 莪術多糖提取的單因素試驗

3.1.1 液料比對莪術多糖提取率的影響 見圖2，液料比為140∶1時多糖提取率達到峰值，為1.11%。料液比達到140∶1以后多糖提取率緩慢下降，這是因為增大溶劑用量，使過多無用的雜質溶入到了溶液中，同時也為后續回收溶劑的操作帶來不便。因此確定最佳液料比為140∶1 。

圖2 液料比對多糖提取率影響

3.1.2提取溫度對莪術多糖提取率的影響 見圖3，當提取溫度為80 ℃時，多糖提取率達到峰值，為1.35%。當繼續升高提取溫度后，多糖提取率呈下降趨勢。當溫度高于80 ℃后，由于高溫使熱穩定性差的多糖結構發生降解從而造成多糖提取率降低。因此確定最佳提取溫度為80 ℃。

圖3 提取溫度對多糖提取率影響

3.1.3提取時間對莪術多糖提取率的影響 見圖4，提取時間為150 min時，多糖提取率達到最大值，為1.57%。當提取時間達到150 min后多糖提取率下降，由于時間過長，一方面雜質成分也隨著提取出來，另一方面長時間煎煮會導致多糖穩定性下降。因此確定最佳提取時間為150 min。

圖4 提取時間對多糖提取率影響

3.2 BBD響應面試驗

3.2.1 響應面試驗設計 根據響應面法設計三因素試驗考察，本次實驗共有分為兩種類型的17個試驗點，第一類為析因點，是自變量取值在A、B、C所構成的三維頂點，析因點共有12個。第二類為位于區域中心的各自變量均為零水平的重復試驗點，用來檢驗回歸方程與中心試驗點的擬合情況，同時可以提供剩余自由度，以提高試驗的精度，本次試驗設計的零點實驗重復5次。對軟件設計出的試驗方案見表2，按2.1項進行多糖提取試驗，按公式(1)求得相應條件下的多糖提取率。應用Design expert 8.0.6.1軟件對所得試驗結果進行分析，所得結果見表 3。

表2 響應面設計及結果

表3 響應面方差分析結果

注：*P<0.05，**P<0.01；r=0.985 8。

以 A、B、C(提取時間)為自變量，Y(多糖提取率)為響應值，建立莪術多糖提取率與提取條件的二次多項式回歸方程：Y=1.57-0.047A+0.11B-0.006 25C+0.012AB+0.012AC-0.015BC-0.1A2-0.14B2-0.11C2。

由表3回歸模型方差分析結果可知：選用模型P<0.000 1，F=53.88，說明該二次回歸模型極顯著，具有統計學意義。失擬項不顯著(P=0.276 8>0.05)，試驗誤差較小，不存在失擬因素。模型r=0.985 8，說明有約98.58%的莪術多糖提取率的變化可以用該模型來解釋。綜上所述，該模型擬合程度較好，可以用來優化和預測莪術多糖最佳提取工藝條件。由二次回歸方程系數的顯著性檢驗可知，A、B對莪術多糖提取率的影響差異有統計學意義(P<0.01)；二次項A2、B2、C2對提取率的影響差異有統計學意義(P<0.01)。試驗因數A、B、C對莪術多糖提取率的影響大小依次為：B>A>C。

3.2.2等高線圖和3D響應面圖分析 為直觀地考察各個因素之間的交互作用對提取率的影響，以莪術多糖提取率(Y)為響應值運用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面分析，得到由響應值與自變量A、B、C 所構成的3D響應面圖及其二維平面上投影所得的等高線圖。分析結果見圖5～7。

從圖5可知：當液料比增大時，多糖提取率的變化趨勢為先增大后減小。但是當提取溶劑使用過量時，擴散達到平衡，增大提取溶劑量不會促進多糖的溶出，反而影響溶劑的回收效率。當液料比一定時，隨提取溫度的增加，多糖的提取率變化趨勢為先增加后降低。從圖中可明顯看出液料比的曲線比提取溫度的曲線更陡峭，表明提取溫度和液料比交互時，液料比影響響應面值變化程度更為敏感，即料液比的交互作用對莪術多糖的提取率影響較大。

圖5 多糖提取率隨溫度和料液比變化的響應面與等高線

由圖6可知：等高線近似橢圓形，表明提取時間和料液比交互關系顯著。當提取時間固定時，莪術多糖提取率隨液料比的增大呈現出先升高后降低的趨勢。在液料比較少的情況下，提取溶液容易達到飽和。增大溶劑用量，使過多無用的雜質溶入到了溶液中，同時也為后續回收溶劑的操作帶來不便。料液比和提取時間的曲線陡峭程度相近，說明兩因素對多糖提取率的影響程度相差不大。

從圖7可知，在溫度固定時，莪術多糖的提取率隨著提取時間增長呈現出也先升高后降低的趨勢。當提取時間固定，隨著溫度增加時，多糖提取率先升高后降低。觀察其陡峭程度，可看出時間的曲線比溫度的曲線更陡峭，則時間對響應面值的影響程度比提取溫度的影響程度高。

圖6 多糖提取率隨時間和液料比變化的響應面與等高線

圖7 多糖提取率隨時間和溫度變化的響應面與等高線

3.2.3 響應面模型驗證 經過響應面優化分析后，最終得出優化后莪術多糖的提取工藝條件為：液料比135.67∶1，提取溫度83.63 ℃，提取時間148.02 min，預測得到莪術多糖提取率的理論值為1.592 6%。為驗證結果的準確性，采用上述優化參數提取莪術多糖，考慮到試驗條件的實際可操作性，將工藝參數修正為液料比136∶1，提取時間148 min，提取溫度84 ℃。該工藝合理、可行。

4 結論

本研究在單因素試驗的基礎之上，選取提取溫度、提取時間、液料比為考察因素，利用Box-Behnken方法進行三因素三水平試驗設計優化莪術多糖的提取工藝。實驗結果表明，建立的二元多項式回歸方程的擬合情況較好，由其預測并根據實際情況進行修正后的莪術多糖提取最佳工藝為：液料比136∶1，提取時間148 min，提取溫度84 ℃。在該提取條件下多糖實際提取率(1.593±0.005)%。可見，運用響應面法優化莪術多糖提取工藝參數合理可靠，為后續莪術多糖進一步研究提供相應依據，為擴大傳統中藥莪術的應用范圍提供幫助。