白熱斯丸質量標準研究△

姜萌，李治建，張雨欣，霍仕霞*，斯拉甫 艾白，閆明*，張蘭蘭

1.新疆醫科大學 藥學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所，新疆 烏魯木齊 830049；3.新疆維吾爾自治區藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830002

民族醫藥學在長期的發展過程中用民族藥治療白癜風積累了豐富的實踐經驗[1]。白熱斯丸是由驅蟲斑鳩菊、玫瑰花瓣、干姜、蓽茇、盒果藤、蒺藜六味中藥采用傳統制藥工藝和現代制藥技術相結合生產的口服固體藥丸。該制劑具有驅寒止痛、化瘀消腫、殺蟲去斑的功效，能有效地激活酪氨酸酶的活性、促進黑色素的形成、增加皮膚的光敏作用，有改善病灶部位皮膚的微循環環境和補充微量元素的功能[2-4]，該制劑現主要用于白癜風的治療。為保證白熱斯丸的安全、穩定，對其質量標準項下的鑒別、檢查、含量測定內容進行研究，并初步建立白熱斯丸的質量標準。

1 材料

1.1 儀器

日本島津LC-20AT高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器(DAD)；SQP電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；WD-9403A型雙光觀察照相儀(北京沃德生物儀器公司)；WG1-070超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)；XMTD-7000電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫療儀器有限公司)；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；FCB-500A型萬能高速粉碎機(上海菲力博食品機械有限公司)；UPS-Ⅰ- 40L優普系列超純水器(四川優普超純科技有限公司)；BJ-2D智能崩解試驗儀(天津創興電子設備制造有限公司)。

1.2 試藥

槲皮素對照品(批號：10081-201610，純度：98.3%)、胡椒堿對照品(批號：110775-201405，純度：98.9%)均由中國食品藥品檢定研究院提供；驅蟲斑鳩菊(產地：新疆，批號：201701003)、干姜(產地：云南，批號：201610003)、蓽茇(產地：廣西，批號：201609003)、玫瑰花瓣(產地：新疆，批號：201610003)、盒果藤(產地：新疆，批號：201701003)均購自北京時珍堂(宜昌)藥業有限公司；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

白熱斯丸樣品為自制(批號分別為：20170812、20170814、20170816、20170818、20170820、20170822、20170824、20180215、20180216、20180217)。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 槲皮素的TLC鑒別 取10批白熱斯丸粉末，每份1 g，加50 mL甲醇，超聲0.5 h，濾過，濾液蒸干，加水30 mL溶解，水液加HCL 5 mL，置80 ℃水浴中水解1 h，取出迅速冷卻，用乙醚萃取2次每次20 mL，合并乙醚液，用水30 mL洗滌，棄去水液，乙醚液揮干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，即得供試品溶液。取槲皮素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含4 mg的溶液，即得槲皮素對照品溶液。根據處方取缺玫瑰花瓣的其他各味藥材，按法制成丸劑，取丸劑適量，照供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。

照薄層色譜法實驗，吸取上述供試品溶液、缺玫瑰花瓣的陰性樣品溶液各10 μL及對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(5∶2∶1)為展開劑，展開，取出吹干，置紫外燈(365 nm)下檢視[5]。結果見圖1。

注：a.槲皮素對照；b.陰性對照溶液；c～l.10批白熱斯藥丸樣品。圖1 槲皮素薄層鑒別

2.1.2胡椒堿的薄層鑒別 取10批白熱斯丸粉末，每份1 g，加5 mL無水乙醇，超聲0.5 h，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取胡椒堿對照品適量，精密稱定，加無水乙醇制成每1 mL含4 mg的溶液，作為胡椒堿對照品溶液。根據處方取缺蓽茇的其他各味藥材，按制備工藝制成丸劑，照供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。

照薄層色譜法實驗，吸取白熱斯丸供試品溶液、缺蓽茇丸劑的陰性樣品溶液各10 μL及胡椒堿對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(5∶4.5∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視[6]。結果見圖2。

注a.胡椒堿對照；b.陰性對照溶液；c～l.10批白熱斯藥丸樣品。圖2 胡椒堿薄層鑒別

2.2 水分檢查

將丸劑粉碎，過60目藥篩，取供試品2～5 g，平鋪至扁形稱量瓶中，扁形稱量瓶事先干燥至恒質量，厚度不超過5 mm，精密稱定，打開瓶蓋干燥5 h，干燥溫度105 ℃，蓋好瓶蓋，移置干燥器中，放冷0.5 h，精密稱定，繼續105 ℃干燥1 h，放冷后稱質量，至連續兩次稱質量的差異不超過5 mg為止。根據減失的質量，計算供試品中含水量(%)[12]。結果顯示，10批白熱斯丸中含水量分別為8.49、8.58、8.48、8.59、8.47、8.46、8.40、8.40、8.59、8.51，均未超過9.0%，白熱斯丸含水量符合標準。

2.3 含量測定

2.3.1 槲皮素含量測定

2.3.1.1 色譜條件 色譜柱：Shimadzu VP-ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：甲醇-0.2%磷酸水(56∶44)，流速：1 mL min-1，進樣量：10 μL，檢測波長：367 nm，柱溫：30 ℃。

2.3.1.2 對照品溶液的配制 取適量槲皮素對照品，精密稱定，置棕量瓶，加甲醇制成每1 mL含2 mg槲皮素的溶液，即對照品儲備液。精密吸取0.1 mL對照品儲備液，置10 mL棕量瓶，用甲醇定容至刻度線，即得質量濃度為20 μg mL-1的對照品溶液。

2.3.1.3 供試品溶液的制備 取白熱斯丸粉末，約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶，加20 mL甲醇、50%鹽酸5 mL，80 ℃水浴水解50 min，取出，迅速冷卻，轉移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，搖勻并濾過，續濾液即供試品溶液。

2.3.1.4 陰性對照品溶液的制備 取處方缺玫瑰花的其他各味藥材，按制備工藝制成丸劑，取丸劑適量，照2.3.1.3項下方法制成陰性對照品溶液。

2.3.1.5 專屬性 精密吸取對照品溶液20 μL、供試品溶液20 μL、陰性樣品溶液20 μL，照2.3.1.1項下色譜條件測定。結果顯示，陰性樣品溶液在槲皮素相應的保留時間未出現色譜峰，表明在該色譜條件下槲皮素和胡椒堿的吸收良好，基線無干擾，白熱斯丸中其他成分對槲皮素測定無干擾。

注：A.陰性樣品溶液；B.槲皮素對照品；C.供試品溶液。圖3 槲皮素HPLC圖

2.3.1.6 線性關系考察 精密量取對照品儲備液適量，逐級稀釋制成200、100、50、25、12.5、6.25 μg mL-1對照品系列液。按照2.3.1.1項下色譜條件進行測定，以峰面積(Y)為縱坐標，進樣溶液濃度(X)為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y=51 536X-112 070，r=0.999 5，說明槲皮素質量濃度在6.25～200 μg mL-1線性關系良好。

2.3.1.7 精密度試驗 取同一份樣品溶液，按照2.3.1.1項色譜條件進行測定，連續進樣6次，結果槲皮素的峰面積RSD為0.13%，表示方法精密度良好[7]。

2.3.1.8 重復性試驗 取同一批號(20170812)的白熱斯丸各6份，按2.3.1.3項下方法制備白熱斯供試品溶液，對槲皮素進行含量測定，峰面積RSD為0.05%，表示方法重復性良好[8-9]。

2.3.1.9 穩定性試驗 取同一白熱斯丸(20170812)供試品溶液，分別于1、2、4、6、8、12、24 h分別按照2.3.1.1項色譜條件進樣，測定槲皮素的峰面積。計算得槲皮素RSD為0.13%(n=7)，說明白熱斯丸供試品溶液在24 h內穩定性良好[10-11]。

2.3.1.10 加樣回收率 分別稱取約0.25 g已知含量的白熱斯藥丸(20170812)粉末9 份，精密稱定，再分別按照高、中、低濃度，精密加入一定量槲皮素對照品，混合均勻，按2.3.1.3項下方法處理后，按2.3.1.1項色譜條件進行測定，計算加樣回收率，白熱斯丸中槲皮素平均加樣回收率為95.7%，RSD=2.77%，符合《中華人民共和國藥典》規定。

2.3.1.11 樣品含量測定 精密稱取10批白熱斯藥丸，照2.3.1.3項下方法制備，并照2.3.1.1項色譜條件進行測定，同時計算槲皮素含量，結果見表1。

表1 白熱斯丸中槲皮素含量測定結果 mg g-1

2.3.2胡椒堿含量測定

2.3.2.1 色譜條件 色譜柱：Shimadzu VP-ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相∶甲醇-水(77∶23)，流速：1 mL min-1，檢測波長：343 nm，柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL。

2.3.2.2 對照品溶液的配制 取適量胡椒堿對照品，精密稱定，置棕量瓶，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，即對照品儲備液。精密吸取0.1 mL對照品儲備液，置10 mL棕量瓶中，用甲醇定容至刻度線，即得質量濃度為20 μg mL-1的對照品溶液。

2.3.2.3 供試品溶液的制備 取0.1 g白熱斯丸粉末，精密稱定，置棕量瓶，加25 mL甲醇，稱定質量，超聲0.5 h，取出放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失質量。搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.3.2.4 陰性對照品溶液的制備 根據處方取缺蓽茇的其他各味藥材，按法制丸劑，取丸劑適量，照2.3.2.3項下方法制成陰性對照品溶液。

2.3.2.5 專屬性 精密吸取對照品溶液20 μL、供試品溶液20 μL、陰性樣品溶液20 μL，照2.3.2.1項色譜條件測定。結果顯示，陰性樣品溶液在胡椒堿相應的保留時間未出現色譜峰，表明在該色譜條件下胡椒堿的吸收良好，基線無干擾，白熱斯丸中其他成分對胡椒堿測定無干擾。

注：A.陰性樣品溶液；B.胡椒堿對照品；C.供試品溶液。圖4 胡椒堿HPLC圖

2.3.2.6 線性關系考察 精密量取對照品儲備液適量，逐級稀釋制成200、100、50、25、12.5、6.25 μg mL-1對照品系列液。按照2.3.2.1項色譜條件進行高效液相色譜法測定，以峰面積(Y)對進樣濃度(X)進行線性回歸，得回歸方程Y=78 378X-30 138，r=0.999 9，表明胡椒堿質量濃度在6.25～200 μg mL-1線性關系良好。

2.3.2.7 精密度試驗 取同一份樣品溶液，按照2.3.2.1項色譜條件進行測定，連續進樣6次，結果胡椒堿的平均質量分數為5.212 mg g-1，RSD為0.000 4%，表示方法精密度良好。

2.3.2.8 重復性試驗 取同一批號(20170812)的白熱斯丸6份，按2.3.2.3項下方法制備白熱斯供試品溶液，對胡椒堿進行含量測定，胡椒堿峰面積RSD為0.12%，表示方法重復性良好。

2.3.2.9 穩定性試驗 取同一白熱斯丸(20170812)供試品溶液，于1、2、4、6、8、12、24 h分別按照2.3.2.1項色譜條件進樣，測定胡椒堿的峰面積。計算得胡椒堿RSD為0.000 9%(n=7)，說明白熱斯丸供試品溶液在24 h內較穩定。

2.3.2.10 加樣回收率 分別稱取約0.05 g已知含量的白熱斯(20170812)藥丸粉末9份，精密稱定，再分別按照高、中、低濃度精密加入一定量胡椒堿對照品，混合均勻，按2.3.2.3項下方法處理后，按2.3.2.1項色譜條件進行測定，計算加樣回收率，結果白熱斯丸中胡椒堿平均加樣回收率為104.8%，RSD=4.05%，符合要求。

2.3.2.11樣品含量測定 精密稱取10批白熱斯藥丸，照2.3.2.3項下方法制備，并照2.3.2.1項色譜條件進行測定，同時計算胡椒堿含量，結果見表2。

表2 白熱斯丸中胡椒堿含量測定結果 mg g-1

2.4 溶散時限

參照《中華人民共和國藥典》四部[12]丸劑項下，取白熱斯丸供試品6丸，選擇適當孔徑篩網的吊籃(丸劑直徑在3.5 mm以上的用孔徑約2.0 mm的篩網)，照崩解時限檢查法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則092)片劑項下的方法，加擋板進行檢查，要求濃縮丸應在2 h內全部溶散。結果10批白熱斯丸的溶散時限均符合規定。

3 討論

為了有效控制白熱斯丸的質量，對處方中的藥材進行薄層鑒別，并采用高效液相色譜法對其中的有效成分進行定量測定。同時參照《中華人民共和國藥典》四部通則項下丸劑標準，進行了水分及溶散時限考察，結果表示，白熱斯丸符合《中華人民共和國藥典》項下規定，所建立的質量控制方法適用于白熱斯丸的質量標準研究。

薄層色譜鑒別方法研究中，課題組前期從樣品制備、展開劑組成及比例的選擇、點樣量、不同品牌薄層板、展開環境(如溫度和濕度)等方面，對處方中的六味藥材的薄層色譜條件進行了考察和優化。結果玫瑰花瓣和蓽茇薄層結果顯示，藥材、對照藥材及白熱斯丸在相同位置顯示相同斑點，且陰性無干擾，可作為薄層鑒別項，列入質量標準，而處方中的其他藥材因無對照藥材或陰性有干擾，不列入。

含量測定中，本研究前期對白熱斯丸中槲皮素含量測定方法進行了系統考察，分別考察了提取方式、提取溶劑、水解時間、水解溫度、加鹽酸體積和鹽酸濃度，結果以加入甲醇后直接加入5 mL 50%鹽酸，80 ℃水浴水解50 min為最佳，并最終建立高效液相色譜法測定白熱斯丸中槲皮素的含量。白熱斯丸中胡椒堿含量測定分別考察了提取溶劑、超聲提取時間和超聲功率，結果以加入甲醇、50%超聲功率下超聲30 min為佳，最后進行系統的方法學考察，建立了高效液相色譜法測定白熱斯丸中胡椒堿的含量。

白熱斯丸為傳統的民族藥復方制劑，主要用于治療白癜風，在新疆的各大中醫醫院使用廣泛，臨床效果確切，但尚未有系統的質量標準研究，對該產品的質量控制影響較大，本研究按照丸劑要求，對白熱斯丸質量進行系統研究，從薄層鑒別、含量測定、水分、溶散時限對自制的10批白熱斯丸進行質量控制研究，最終建立的方法適用性較強，可作為白熱斯丸的質量標準，為該產品的質量控制提供了參考。