SLC30A8基因位點(diǎn)rs11558471 A/G多態(tài)性 與妊娠糖尿病的相關(guān)性研究

李 瑩，張書巧，周 霞，武 闖

（1.廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，福建 廈門 361023； 2.棗莊市中區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 棗莊 277000； 3.臨沭縣婦幼保健院婦產(chǎn)科，山東 臨沂 276700）

妊娠期糖尿病（ gestational diabetes mellitus，GDM） 是指孕婦在妊娠期首次發(fā)病或發(fā)現(xiàn)的任何程度的糖代謝異常。GDM可增加母兒健康危害加大，并

伴有其他代謝功能紊亂，是妊娠期常見并發(fā)癥之一[1]。相關(guān)研究表明，GDM有遺傳傾向，與其易感基因突變有關(guān)[2]。SLC30A8基因即鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-8基因，其編碼的胰島腺特異性鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體-8（ZnT-8）是調(diào)節(jié)胰腺細(xì)胞分泌胰島素的重要組成部分,可促進(jìn)鋅在胰島β細(xì)胞的囊泡蓄積[3]。研究顯示，SLC30A8可增加2型糖尿病的遺傳易感性，但與不同地區(qū)孕婦GDM的發(fā)病的相關(guān)性存在較大差異，具有明顯的地域性。為此，本研究對2015-2018年山東地區(qū)GDM與SLC30A8 rs11558471 A/G單核苷酸多態(tài)性的遺傳易感性的相關(guān)性進(jìn)行了調(diào)查分析，現(xiàn)報(bào)導(dǎo)如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

前瞻性收集2015年9月-2018年10月山東地區(qū)確診為GDM孕婦患者149例，納入GDM組。患者年齡22-41歲，平均27.9±8.03歲，孕周21-28周，平均23±2.0周。選取同期入院的健康孕婦163例，納入對照組。對照組年齡23-41歲，平均28.3±6.9歲，孕周21-30周，平均24±1.2周。

GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：采用2011年美國糖尿病學(xué)會(huì)（ADA）診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有受試者于孕24-28w行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（glucose tolerance test，0GTT），空腹血糖（FPG）≥5.1 mmol/L，餐后1h血糖≥10.0mmoL/L，餐后2h血糖≥8.5mmol/L，血糖值符合其中1 項(xiàng)即診斷GDM。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并有其他妊娠疾病的患者；（2）妊娠前已確定為糖尿病的患者；（3）糖尿病患者合并有心、腦、肝、腎、肺等慢性病者； （4）有精神病史的患者；（5）腫瘤或服用影響糖代謝藥物的患者等。所有研究均簽訂知情同意書，并經(jīng)各醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2 研究方法

1.2.1 指標(biāo)收集

收集所有研究對象的身高、孕前體質(zhì)量，計(jì)算孕前BMI（BMI=體質(zhì)量/身高2）。所有研究對象均于清晨空腹8小時(shí)后采集靜脈血2-3ml，室溫靜置30min后分析血清，采用化學(xué)發(fā)光法檢測FINS；同時(shí)采用糖激酶法檢測FPG。采用穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）評估胰島素抵抗。（計(jì)算公式：FINS×FPG/22.5）

1.2.2 DNA提取

空腹抽取孕婦靜脈血樣標(biāo)本2ml，按照DNA 基因組試劑盒（北京全式金生物試劑有限公司，中國）說明書提取各血液樣本DNA，并檢測DNA 的純度和濃度。A260 /A280比值在1.7-1.9為符合DNA 純度要求。將DNA統(tǒng)計(jì)標(biāo)記標(biāo)本置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 rs11558471位點(diǎn)多態(tài)性分析

應(yīng)用Pr imer Pr emer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物上游為5’-ACCAGCCAAAGAATGTGGTT-3’，下游為：5’-AATGTTGGCCTGCACATCTT-3’。引物由華大基因公司合成。PCR擴(kuò)增體系總體積為25μl：按體系加入PC R Master Mix 5μl；2U Taq DNA聚合酶0.5μl；上、下游引物體積各0.5μl ；DNA模板1μl；去離子水加至25μl。反應(yīng)體系為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性5s，62℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)35 次，最后72℃延伸10min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用3% 瓊脂凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行檢測。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后進(jìn)行SLC30A8基因位點(diǎn)rs11558471 A/G基因型及等位基因檢測。PCR 產(chǎn)物酶切反應(yīng)體系為20μl： PCR產(chǎn)物10μl； 10XNEBuffer4緩沖液2μl；100XBSA 為0.2μl；ExoI 0.5μl；去離子水7.5μl。基因分型的檢測由華大生物科技有限公司完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對所測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中計(jì)量資料采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示。各組組間基因型分布及等位基因頻率比較采用x2檢驗(yàn)，并以Hardy-Weiberg定律檢驗(yàn)樣本遺傳平衡。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床指標(biāo)比較

GDM組孕婦的BMI、FPG、FINS及HOMA-IR水平均明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組臨床指標(biāo)比較

2.2 rs11558471 A/G基因型與頻率

SLC30A 8（rs11558471）基因型表現(xiàn)為AA、AG和GG。GDM組和對照組SLC30A8（rs11558471）位點(diǎn)三種基因型及A、G等位基因頻率符合Hardy-Weiberg遺傳平衡定律，具有群體代表性。GDM組SLC30A8基因位點(diǎn)rs11558471的AA基因型頻率及A等位基因頻率分別為26.85%和44.63%，明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 兩組SLC30A8基因位點(diǎn)rs11558471A/G基因型及等位基因頻率的比較

3 討 論

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是糖尿病的一種特殊類型，是妊娠期間發(fā)生或者首次發(fā)現(xiàn)的具有不同程度的OGTT異常。目前，GDM在我國的發(fā)病率為6.8%-10.4%，且呈逐年上升的趨勢，遠(yuǎn)高于全球發(fā)病率[5]。目前有關(guān)GDM的發(fā)病機(jī)理尚不完全清楚，但研究顯示遺傳因素在的GDM的發(fā)病過程中起著至關(guān)重要的作用，而具有糖尿病家族史的孕期女性發(fā)生GDM的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。不同地區(qū)GDM發(fā)病率因受環(huán)境、遺傳背景等因素的影響而存在巨大差異[6,7]，逐步開展不同地區(qū)GDM的遺傳易感性調(diào)查具有重要的臨床意義。

SLC30A 8基因位于人類染色體8q24.11上，全長41.62KB，可在胰腺中特異性高表達(dá)。SLC30A8基因可編碼含有369個(gè)氨基酸的鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-8（ZnT-8）是胰島素成熟、儲存和分泌過程中具有重要作用的蛋白[8]。ZnT-8位于胰島素分泌顆粒膜中，能夠促進(jìn)鋅離子從細(xì)胞質(zhì)到胞內(nèi)胰島素囊泡中聚集，隨后使胰島素與鋅離子結(jié)合，從而形成較為穩(wěn)定的六聚體。當(dāng)胰島β細(xì)胞受到刺激時(shí)，六聚體從囊泡中分泌出去，從而介導(dǎo)胰島素的成熟和分泌[9,10]。

本研究結(jié)果顯示，G D M組的孕婦血清中BM I、FINS、FPG及HOM A-IR結(jié)果均高于對照組（P＜0.05）。SLC30A 8的多態(tài)性位點(diǎn)較多，常見的研究位點(diǎn)為rs11558471，rs1326634,rs7002176,rs1995222及rs17738231等。該研究中選取了與妊娠性糖尿病相關(guān)性最大的位點(diǎn)rs11558471進(jìn)行測定和分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GDM組孕婦SLC30A8基因位點(diǎn)rs11558471（A/G）多態(tài)性AA、AG、GG基因型頻率比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），同時(shí)DGM組孕婦的A等位基因頻率明顯高于對照組。這提示，攜帶SLC30A8基因rs11558471（A/G）多態(tài)性A等位基因可使孕婦發(fā)生GDM的風(fēng)險(xiǎn)增加。因此，加強(qiáng)孕婦SLC30A8基因rs11558471（A/G）突變的檢測，對山東地區(qū)孕婦GDM 發(fā)病的診斷具有重要意義。

綜上所述，山東地區(qū)孕婦SLC30A8基因rs11558471（A/G）突變與GDM的發(fā)病具有明顯的關(guān)聯(lián)性，因本研究納入樣本量相對較小，SLC30A8基因rs11558471（A/G）多態(tài)性與GDM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，尚需更多大樣本及隨機(jī)對照研究結(jié)果證實(shí)。