全血中4種新型合成大麻素的快速檢測

徐恩宇，張云峰，宋歌，蔣銳，劉光琴，劉俊亭

（1.中國醫科大學法醫毒物分析教研室，遼寧 沈陽 110122；2.公安部物證鑒定中心，北京 100038）

合成大麻素類（synthetic cannabinoid，SC）新型策劃藥是人工合成的內源性大麻素受體1（cannabinoid receptor 1，CB1）和CB2 受體激動劑[1]，經化學結構修飾降低分子極性以增強血腦屏障通過能力，只需要很低的濃度就能產生比天然大麻更強的效力。1-戊基-3-（2-氯苯乙?；┻胚幔?-（2-chlorophenyl）-1-（1-pentyl-1H-indol-3-yl）ethanone，JWH-203］、1-戊基-3-（4-甲基-1-萘甲?；┻胚幔郏?-pentyl-1H-in?dol-3-yl）（4-methylnaphthalen-1-yl）methanone，JWH-122］、N-（1-金剛烷基）-1-（5-氟戊基）吲唑-3-甲酰胺［N-（1-adamantyl）-1-（5-fluoropentyl）-1H-indazole-3-carboxamide，5F-APINACA］、N-（1-氨甲?；?2-甲基丙基）-1-（環己基甲基）吲唑-3-甲酰胺［N-（1-amino-3-methyl-1-oxobutan-2-yl）-1-（cyclohexylmethyl）-1H-indazole-3-carboxamide，ABCHMINACA］作為國內發現的合成大麻素的典型，已于2015年10月被我國列為第一類精神藥品加以管制[2]。合成大麻素類種類繁多且更新速度極快，在生物樣品如血液中濃度低，檢測時限短，難以檢測[3-5]，在常規毒物篩查中多為陰性，目前檢測方法報道不多，基于紅外光譜、色譜-質譜聯用和高分辨質譜技術是鑒定此類未知物的有效手段。

為滿足鑒定工作的需要，本研究聯合氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）和液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術分析檢材中的合成大麻素，建立準確、快速的檢測方法，并提供4種合成大麻素的質譜解析信息，結合分子結構、色譜行為和CB1受體親和力信息推測未知合成大麻素的精神活性作用，為此類物質的鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1260-6420三重串聯四極桿液質聯用儀、7890B-5977A氣相色譜質譜聯用儀（美國Agilent公司），SPD1010P1-230離心濃縮系統、SorvallTMLegendTMMicro 21R微量離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司），Lab Dancer振蕩器（德國IKA公司），Simplicity 185超純水系統（美國Millipore公司）。

乙腈、甲醇和甲酸（HPLC級，美國Sigma-Aldrich公司），AB-CHMINACA、JWH-203、5F-APINACA、JWH-122對照品由公安部禁毒局國家毒品實驗室制備。

空白全血樣品采自健康受試志愿者。

1.2 溶液配制

用甲醇分別配制對照品（JWH-203、JWH-122、5FAPINACA和AB-CHMINACA）質量濃度為1mg/mL的儲備液，置于-20℃保存。本實驗中所用其他質量濃度的工作液均由上述儲備液經甲醇稀釋獲得。

1.3 色譜與質譜條件

1.3.1 GC-MS條件

色譜柱為HP-5MS毛細管柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm，美國 Agilent公司）。程序升溫：初始柱溫60℃，保持1 min，以20℃/min升至300℃，保持12min。氦載氣流量0.56mL/min，進樣口溫度265℃，離子源溫度230℃，檢測器溫度150℃。結合美國國家標準與技術研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）14譜庫進行篩選。

1.3.2 LC-MS/MS條件

色譜柱為ZORBAX SB C18色譜柱（2.1mm×50mm，1.8μm，美國Agilent公司）。流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈，兩者體積比為3∶7；流速0.20mL/min；進樣體積1 μL；采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）正離子模式；干燥氣溫度350℃；干燥氣流速12 L/min；霧化器壓力45 psi；采用子離子（product ion）掃描模式進行定性分析，多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式進行定量分析，駐留時間為150ms。

1.4 樣品前處理

精密吸取全血樣品200 μL于2 mL離心管中，加入600μL乙腈，超聲1min，以17500×g離心3min，上清液經離心濃縮后揮干，經50μL甲醇復溶進樣。

1.5 方法學驗證

工作曲線、檢出限（detection limit，LOD）和定量限（quantification limit，LOQ）：取空白血液200μL，添加適量的JWH-203、JWH-122、5F-APINACA和ABCHMINACA對照品標準溶液，分別配制成質量濃度為0.1、0.5、1、10、50、100、250、1 000 ng/mL 的校準樣品，按照1.4節方法進行樣品前處理，按1.3節色譜與質譜條件進樣分析。分別以4種目標物的添加質量濃度為自變量（x，ng/mL）、第一組母離子/子離子對的峰面積為因變量（y）進行線性回歸，以信噪比（S/N）=3確定LOD，S/N=10確定LOQ。

回收率、基質效應和精密度：在空白血液中分別添加4種對照品標準溶液，分別配制成高、中、低質量濃度（分別為250、50、5 ng/mL）的血樣，并按照1.4節方法進行樣品前處理，按1.3節色譜與質譜條件進樣分析。血樣按1.4節方法處理后，將進樣的峰面積設為A；空白樣品按1.4節方法處理后，加入相應質量濃度的對照品溶液，將進樣后的峰面積設為B；將對照品溶液吹干復溶后進樣的峰面積設為C。提取回收率為A/B×100%，基質效應為B/C×100%。連續3d在同一時間分別對4種目標物高、中、低質量濃度進行檢測，計算日間精密度，以相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）表示。

2 結 果

2.1 GC-MS分析

血液中4種目標物在選定的GC-MS條件下需要21 min完成分析，色譜行為良好，總離子流色譜圖見圖 1。JWH-203、AB-CHMINACA、5F-APINACA 和JWH-122的提取離子分別為m/z214、m/z241、m/z233、m/z355，保留時間分別為16.0、17.2、19.3、20.7min。

圖1 全血中4種合成大麻素的GC-MS總離子流圖

4種目標物的提取離子色譜圖（extracted ion chro?matogram，EIC）經NIST 14譜庫檢索得到相應的質譜信息，JWH-203、5F-APINACA和JWH-122均能匹配譜庫中的結構式信息，但AB-CHMINACA未檢索到相應的質譜信息，特征碎片離子為m/z312.3、m/z241.2、m/z145.1。

2.2 LC-MS/MS分析

血液中4種目標物在選定的LC-MS/MS條件下僅需5min即完成分析，色譜行為良好，AB-CHMINACA、JWH-203、5F-APINACA和JWH-122的保留時間分別為1.17、2.24、3.07、3.68min（圖2）。

圖2 全血中4種合成大麻素的LC-MS子離子色譜圖

先對4種合成大麻素的碰撞誘導解離電壓優化（優化的質譜參數見表1），使前體離子產生最強信號，再選取質子化分子作為前體離子，獲得各種碰撞能量下的裂解信息（圖3）。

表1 全血中4種合成大麻素的質譜參數

圖3 全血中4種合成大麻素的LC-MS質譜信息

2.3 方法學驗證

4種目標物的線性回歸方程、LOD及LOQ見表2，回收率、基質效應和精密度見表3。AB-CHMINACA、JWH-203、5F-APINACA和JWH-122在1～250 ng/mL質量濃度范圍內線性良好，相關系數（r）＞0.99，LOD為0.1～0.5 ng/mL，提取回收率為85.4%～95.2%，基質效應為80.3%～92.8%，日間精密度小于10.0%，說明該方法適用于血液中痕量合成大麻素的檢測。

表2 全血中4種合成大麻素的LOD、LOQ和線性范圍

表3 全血中4種合成大麻素的回收率、基質效應和日間精密度 （%）

3 討 論

本研究先應用GC-MS法對全血添加樣品進行初步檢測，呈陽性結果的再應用LC-MS/MS法進行確認，經建立的快速檢測方法得到4種合成大麻素的色譜行為和質譜解析信息，可為禁毒工作提供參考。在選定的GC-MS條件下，AB-CHMINACA在NIST 14譜庫中無信息，特征碎片離子為m/z312.3、m/z241.2、m/z145.1，與文獻[6-7]一致。在選定的LC-MS/MS條件下，AB-CHMINACA、JWH-203、5F-APINACA和JWH-122目標物的特征碎片明顯區分，與文獻[5，8-11]一致。

本研究GC-MS法的保留時間中，JWH-203＜ABCHMINACA＜5F-APINACA＜JWH-122，而LC-MS/MS法的保留時間中，AB-CHMINACA＜JWH-203＜5FAPINACA＜JWH-122，提示合成大麻素JWH-203和AB-CHMINACA在不同的色譜條件下保留行為具有不一致性[12]。不同化合物在毛細管柱中的出峰順序主要取決于相對分子質量和沸點大小，目標物的相對分子質量JWH-203＜AB-CHMINACA＜5F-APINACA，與出峰順序一致；JWH-122相對分子質量較小但出峰慢，可能與其分子結構中的萘環有關，沸點較高，保留時間長。

合成大麻素的精神活性作用與CB1的親和性相關，親和力K1值越低，對受體的親和力越高。4種合成大麻素與CB1的親和力K1值為AB-CHMINACA［（0.78±0.11）nmol/L］＜5F-APINACA［（1.94±0.55）nmol/L］和 JWH-122［（0.69±0.05）nmol/L］＜JWH-203［（8.0±0.9）nmol/L］[1，13-14]。5F-APINACA 和 AB-CHMINACA屬于較新的第8代吲唑酰胺類合成大麻素，分別于2013年和2015年成為德國、美國和中國等國家管制藥物，再結合液相色譜保留時間和K1值可推測：第8代吲唑酰胺類合成大麻素中，較新的AB-CHMINACA比5F-APINACA的精神活性作用更強（K1值低）、極性較大（保留時間短）?？傮w可以看出，新型合成大麻素的發展趨勢為精神活性作用更強、使用劑量更低、檢測難度更大。