脈沖LED黃光對皮膚細胞黑素生成的影響

戴 惟，韓秋漪，李福生，張善端

(復旦大學電光源研究所，上海 200433)

1 皮膚光療簡介

光療法是用于治療各類疾病的最古老的療法之一，在古埃及、古印度和中國，陽光在治療皮膚病方面的應用已有數千年歷史。20世紀60年代末，匈牙利醫生恩德·梅斯特(Endre Mester)使用低功率紅寶石激光(694 nm)照射小鼠來研究激光的致癌性。令他感到意外的是，激光并未導致癌癥的產生，但改善了小鼠受照面被剃去的小鼠毛發的生長。這是近代首次低水平光療法(low level light therapy，LLLT)的案例，為皮膚光學開啟了一條新的研究路徑。發展至今，用于皮膚光療的光源主要包括相干光(如激光)和非相干光(如LED)兩類，并在全世界范圍內得到普及。目前，國內外對于激光皮膚光療的研究體系較為成熟，臨床應用更為廣泛。

1.1 皮膚光療的作用機制

人體皮膚由表皮層、真皮層和皮下組織構成。表皮層含有角質形成細胞、黑素細胞、朗格漢斯細胞和麥克爾細胞。角質形成細胞占表皮細胞的80%以上，參與表皮分化、角化等作用；黑素細胞占表皮細胞的10%左右，起到遮擋和反射紫外線的作用；朗格漢斯細胞占表皮細胞的3%～5%，為免疫活性細胞；麥克爾細胞則具有非神經末梢介導的感覺作用。真皮層主要由纖維和基質構成，常駐細胞包括成纖維細胞和肥大細胞。成纖維細胞在傷口愈合和皮膚再生中起到重要作用。其他細胞如巨噬細胞、真皮樹狀細胞等也或多或少地存在于真皮層[1]。

細胞光生物效應的機制涉及分子、細胞和組織水平的作用，其機制尚未完全明確。當前研究普遍認為，光主要作用于皮膚細胞中的發色團，發色團吸收光子能量并轉化為熱能和化學能，激活線粒體呼吸鏈組分，從而導致一系列細胞反應。發色團是指賦予化合物顏色的分子(或分子的一部分)，通常以共軛π電子體系和金屬絡合物形式存在。人體中的發色團主要包括血紅蛋白、肌紅蛋白、細胞色素、黃素、黃素蛋白和卟啉等。皮膚組織中常見的目標發色團是含有鐵和銅的細胞色素C氧化酶(CCO)，位于線粒體呼吸鏈中[2-4]。德國生物化學家奧托沃伯格發現細胞色素氧化酶負責細胞呼吸的關鍵步驟，并控制了該過程最終的化學反應。

除一氧化碳(CO)外，一氧化氮(NO)也通常會取代氧與細胞色素氧化酶結合，進而阻礙細胞呼吸[5]。當細胞呼吸被阻斷時，會產生自由基或活性氧(ROS)形式的化學信號，過量時會導致細胞凋亡[6]。研究表明，光照會促進NO從細胞色素C氧化酶(CCO)中解離，使得氧再次與其結合并增強呼吸鏈活性[7]、增強酶活性[8]、影響電子傳遞[9]并促進線粒體呼吸和三磷酸腺苷(ATP)的生成[10-13]。此外，通過對活性氧物質(如單態氧物質)的調節，光照將進一步改變細胞的氧化還原狀態，誘導細胞內多種信號傳導途徑的激活，改變與細胞增殖、存活、組織修復和再生相關的轉錄因子水平。

相對于高功率激光而言，雖然LLLT在近年來應用快速普及，但在某些方面仍存在不確定性。一是入射在細胞上的光子信號轉換成被照組織中生物效應的分子機制尚未完全明確；二是在臨床應用中，光照劑量和參數的選擇存在著大量的不確定性，包括波長、輻照度或功率密度、脈沖結構、相干性、極化、照射時間、接觸與非接觸應用等。已有研究表明，細胞對于光劑量的反應有雙相效應，即過小的輻照度或時間對于細胞沒有影響，過大的輻照度或時間可能具有抑制作用。因此可能存在輻照度和時間的最佳平衡值，且不同的波長、組織類型、氧化還原狀態下的絕對數值會有所不同，并受到不同脈沖參數的影響[14]。

1.2 黑素合成的機制

黑色素是由酪氨酸或3,4-二羥基苯丙氨酸的一系列化學反應形成的一類生物色素。人體皮膚顏色主要受色素沉著過程的影響，包括黑素的合成、轉運和代謝等環節，具體包括：在黑素小體中進行的黑素細胞的合成與黑素儲存，黑素小體從細胞核周邊向樹突末端的轉移以及向鄰近角質形成細胞的傳遞，角質形成細胞的再分布和降解等[15]。

黑素生成是一種多步酶促生化反應，通過酪氨酸的一系列化學反應實現。酪氨酸經由酪氨酸酶(TYR)催化后轉變成多巴(DOPA)，多巴被氧化脫氫后生成多巴醌。在半胱氨酸的參與下，一部分多巴醌合成褐黑素；另一部分多巴醌形成多巴色素，最終重排為5，6-二羥基吲哚，吲哚與結構蛋白結合成黑素蛋白即常說的黑素。該一系列過程中TYR和TRP-1是所涉及的關鍵酶。酪氨酸酶(TYR)是黑色素合成中的關鍵酶，能夠催化黑色素合成的早期限速步驟，即底物(能和酶特異性結合的物質)酪氨酸羥化和DOPA氧化過程。黑色素合成的速率與酪氨酸酶的量和活性直接相關。酪氨酸酶相關蛋白1 (TRP-1)也具有與TYR相似的催化活性，主要作用是將酪氨酸運送給黑素小體，因此黑色素合成速率也與TRP-1的合成正相關[16，17]。

黑素細胞前體起源于神經嵴，并遷移分化到各個部位，包括表皮、毛囊、內耳、脈絡膜、軟腦膜等。小眼畸形相關轉錄因子(MITF)參與這種遷移過程，是分化過程最早的標記物之一，可以通過調控TYR基因家族來影響黑素合成過程。研究表明，將MITF cDNA轉染至成纖維細胞中促進了成纖維細胞轉化為樹突細胞的過程以及黑素細胞特異性標志物(如酪氨酸酶TYR和酪氨酸相關蛋白TRP-1)的表達。TYR和TRP-1的編碼基因，即第一個發現的MITF靶基因，由MITF直接調節[18]。

1.3 光照模式

光照模式可分為脈沖光和連續光。這兩類模式對于細胞的具體影響機制目前仍無定論，但脈沖光通常被作為皮膚光療中一類常見的手段用于臨床治療[19，20]。

Sterenborg等[20]使用各類血卟啉文獻中的數據進行理論計算，認為當峰值輻照度低于4×108W/cm2時，脈沖寬度為10 ns、100 ns、1 μs、10 μs、100 μs，脈沖模式與連續模式光動力療法的效率相同。Farouk等[21]在14只大鼠背部制造橢圓形創面，分別使用100～500 Hz不同頻率脈沖和連續光(635 nm，1.0 J/cm2，0.89 mW/cm2，3次/周)照射進行傷口愈合情況對比，結果顯示100 Hz相對于其他頻率脈沖光有更好的愈合效果，但與連續光相比并無改善。文章認為連續光在該實驗中有更好的治療效果，原因在于連續光帶來的光子刺激增加。Brian等[22]通過組織模擬劑量計研究脈沖/連續模式下光動力劑的吸收情況，使用690 nm、300 mW/cm2的連續光和脈沖光(10 Hz，10 nm脈寬)照射劑量計，結果顯示脈沖光在劑量計中的穿透性比連續光更強。文章認為高峰值輻射照射會引起激發態飽和，降低劑量計吸收系數，使得脈沖光穿透深度更深。Brodon等[23]將人體HEP-2細胞在完全DMEM培養基中培養，以670 nm、5 J/cm2的連續光和不同頻率脈沖光(6 Hz、18 Hz、36 Hz、100 Hz、600 Hz)照射72 h，并與無光照組對比，評估細胞增殖和氧化爆發情況。結果顯示細胞增殖在100 Hz脈沖條件下得到最大刺激，而氧化爆發在600 Hz時得到最大刺激，從而推斷脈沖模式能夠減少黑色素對光子的吸收，使得更多光子到達靶細胞產生治療效果。文章認為其原因可能在于特定頻率脈沖光能夠穿過黑色素之間的“空穴”而更好地到達靶細胞。Barolet等[19]對10名患者前臂進行高低輻照度下連續和脈沖光照(660 nm，高輻照度：60 mW/cm2，低輻照度：5 mW/cm2)，治療完成72 h后在每個測試區域中收集皰液并使用放射免疫測定法測定膠原蛋白合成速率。結果顯示：高輻照度下，脈沖模式III型前膠原生產速率增加50%，連續模式增加29%；低輻照度下，脈沖模式III型前膠原生產速率增加76%，連續模式增加38%。文章認為其原因可能在于脈沖模式能提供細胞周期性松弛時間，避免成纖維細胞衰竭，維持細胞活性。此后Barolet等[19]進一步細化脈沖參數，使用630 nm、8 J/cm2光照研究了在單層培養的成纖維細胞模型中使用各種脈沖或連續光傳輸模式對I型前膠原蛋白刺激的影響，結果顯示脈沖模式優于連續模式，最佳脈沖參數為：脈沖持續時間(pulse duration) 100 μs，脈沖串間隔(pulse train interval) 750 μs，每串脈沖數(pulses per train) 4個，脈沖間隔(pulse interval) 1000 μs。但最佳組合參數仍有待評估。

2 黃光LED裝置

2.1 LED光源制備

本文設計并制作了一款參數可調的590 nm黃光LED裝置以進行實驗。該裝置可以改變驅動電源的占空比、頻率和功率，也即輻照度和輻照時間可調，具備6個可調頻率(10 Hz、50 Hz、100 Hz、250 Hz、500 Hz、1 000 Hz)和4個可調占空比(25%、50%、75%、100%)，并采用無極調光來調節輻照度。當占空比改變時，該裝置的峰值輻照度將相應改變，以保持恒定的平均輻照度，由此確保在相同照射時間內，脈沖模式和連續模式的總劑量(J/cm2)相等。光源模塊采用小功率LED封裝器件，以11并17串的排布方式進行表面貼裝，如圖1所示，PCB尺寸為200 mm×80 mm。單顆封裝器件額定功率為0.3 W，整個模塊的標準輸入電壓為36 V?？紤]到用于光色電熱參數測試的積分球直徑較小，用30個相同規格的LED封裝器件串聯制作了一個小型LED光源模塊來測試光電參數，如圖2所示，PCB直徑為80 mm。測試模塊的PCB板材料與實驗用LED器件相同，以確保散熱性能一致。

圖1 細胞實驗用LED光源模塊Fig.1 LED light source module for cell experiment

圖2 參數測量用LED光源模塊Fig.2 LED light source module for parameter measurement

2.2 LED光源的特征參數

常用溫度測量工具(如熱像儀和熱電偶)無法直接獲得LED芯片的PN結溫度(結溫)，因此我們采用正向電壓法間接測量結溫。其原理是在給定的小電流下，LED芯片或封裝器件的正向電壓和結溫之間存在近似線性關系。測量過程包括定標和測量兩個步驟。

第一步定標。將測試用LED光源模塊放入恒溫箱中，經過約2 h的充分熱交換后可認為結溫與恒溫箱溫度相同，對LED施加1 mA恒定小電流，利用結溫測試儀(上海力茲，LEDT-300B)測得此電流下串聯封裝器件的正向電壓；測定不同恒溫箱溫度下的正向電壓，可以獲得正向電壓與結溫的關系，由系統自動擬合成定標曲線，該曲線在一定溫度范圍內接近線性。

第二步測量。LED在設定好的大電流條件下工作，結溫測試儀會周期性地切斷工作電流，對LED光源模塊施加1 mA小電流，時間持續20 ms，測定瞬時正向電壓，根據定標曲線可計算得出該工作電流下的結溫。

在測量結溫的同時，采用積分球和光譜儀測量LED模塊的光色參數，并測定電參數。參數測試用LED光源模塊貼裝在水套表面，使用恒溫循環水浴來模擬環境溫度。水浴溫度依次設定為45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃和85 ℃。LED模塊的輸入電流設定為0.03 A、0.075 A、0.15 A、0.3 A、0.45 A和0.6 A，分別對應于額定電流的0.2、0.5、1、2、3、4倍。結溫與電流的關系如圖3所示，可見隨著輸入電流的增大，結溫幾乎線性增加。但即使輸入電流增加到額定值的3倍，結溫仍保持在140 ℃以下。因此，如散熱良好，封裝器件可實際工作在3倍額定功率而不損傷。

圖3 結溫與電流的關系Fig.3 The dependence of junction temperature on forward current

圖4為輻射功率與輸入電流的關系，可見在額定電流的3倍范圍內，輻射功率隨輸入電流增加而增加。功率達到3倍以上時，輻射功率開始下降。隨著芯片內熱量的不斷積累，結溫逐漸升高，將導致載流子逸流增加，從而降低器件的注入效率和發光效率。在實際使用中，輸入功率選擇應小于額定值的三倍，并考慮輻射效率參數。

圖4 輻射功率與輸入電流的關系Fig.4 The dependence of radiant power on forward current

輻射效率是輻射功率與輸入功率之比。圖5所示為輻射效率隨電流的變化。當輸入電流為額定值的0.5倍時，輻射效率最高，此后輻射效率幾乎呈線性下降。根據一般的設計要求，輻射效率必須達到10%以上。再考慮到工作溫度一般不高于45 ℃，合適的工作功率應在額定功率的2倍以內。

圖5 輻射效率與輸入電流的關系Fig.5 The dependence ofradiant efficiency on forward current

當結溫變化時，LED芯片的峰值波長也會有所變化。當輸入電流增加至2倍額定值時，PN結溫度上升約25～30 ℃，如圖3所示；峰值波長紅移約2 nm，如圖6所示。但相對而言，與熒光粉型LED相比，芯片型LED的波長一般偏移更小。

圖6 主波長與輸入電流的關系Fig.6 The dependence of dominant wavelength on forward current

2.3 恒定輻照度控制

通常當照明模式由連續轉換為脈沖模式時，LED器件的平均輻照度將發生變化。例如，當脈沖占空比從100% (連續光)變為50%時，由于峰值輻照度保持不變，但導通時間減半，這將導致每個周期的平均輻照度減半。本實驗過程中，保證了相同照射時間內的總“劑量”相同，亦即平均輻照度相同。

本實驗設計的LED裝置能夠根據占空比自動改變峰值輻照度，例如當占空比減半時峰值輻照度加倍，以確保平均輻照度不變。為了驗證該控制功能，用分光光度計PLA-20 (遠方光電，杭州)測定連續和脈沖(50%占空比，10 Hz)照射模式下的照度(lx)和輻照度(W/m2)。每種模式分別進行三次測量取均值，如表1所示，連續光模式下的平均輻照度為171.8 W/m2，脈沖光模式的平均輻照度為169.5 W/m2。兩種模式的平均測量結果無明顯差異，在合理誤差范圍內(<1%)，平均輻照度取6次測量的均值170.7 W/m2。

表1 連續和脈沖光的平均輻照度測量

*P>0.05, 無顯著差異。

3 生物實驗

將人表皮黑素細胞(HEM)分別用20 J/cm2連續光(10 Hz，100%占空比)和20 J/cm2脈沖光(10 Hz，50%占空比)在距離2 cm處照射20 min，并與無光照(0 J/cm2)組進行對比。為了避免來自光源的熱干擾，我們在照射前后測試了距離光源2 cm處的溫度，結果顯示溫度沒有變化。

3.1 細胞活性測量

實驗評估了不同光照條件下的細胞活力。將HEM (每孔2×103個)一式三份接種到100 μl生長培養基中的96孔板中，分成3組并分別用不同光照條件。在照射24 h后，采用Cell Count Kit-8來處理樣本(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)，然后用Multiskan GO酶標儀(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)測量波長450 nm處的每個孔的吸光度，從而測定細胞活力。

3.2 黑素含量測量

將原代培養的HEM (每孔5×105個)一式三份接種到100 μl生長培養基中的96孔板中，分成3組并分別采用不同光照條件。照射后24 h，將HEM在70 ℃條件下于1 N NaOH中溶解1 h，然后用Multiskan GO酶標儀(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)通過波長475 nm處的吸光度測量相對黑色素含量。

3.3 酪氨酸酶活性測量實驗

將原代培養的HEM (每孔5×105個)一式三份接種到100 μl生長培養基中的96孔板中，分成3組并用不同光照。照射后24 h，用PBS洗滌HEM，然后在4 ℃條件下在RIPA緩沖液中孵育30 min后進行裂解。然后將100 ml裂解緩沖液接種到96孔板中。用Multiskan GO酶標儀(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)測量波長630 nm處的吸光度。

3.4 實時熒光定量PCR

該實驗旨在評估在不同光遞送下黑色素合成中3種顯著酶(即MITF，TRP-1和TYR)的mRNA表達。PCR擴增使用MITF，TRP-1和TYR引物分別在以下條件進行：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s40個循環，60 ℃ 34 s，95 ℃15 s，60 ℃ 1 min和95 ℃ 15 s。使用設備為DNA Thermal Cycler 9600 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)。

3.5 Western Blot免疫蛋白印跡

該實驗旨在評估在不同光照下黑色素合成中3種顯著酶的蛋白質表達。裂解HEM并通過RIPA緩沖液從HEM中提取蛋白質。通過10% SDS-PAGE (EpiZyme, Shanghai, China)分離提取蛋白質，然后電轉移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore, Billerica, MA, USA)上。在室溫下在5%脫脂奶粉中孵育1小時以阻斷非特異性抗體結合后，使用來自Abcam (Cambridge, MA, USA)的一抗將膜在4 ℃溫育過夜，包括：抗MITF (ab59232; 1∶1000)，抗TYR (ab61294; 1∶1000)和抗TRP-1 (ab83774; 1∶500)。然后將膜與二抗在室溫下孵育1 h。通過增強型ECL化學發光試劑(Biodragon, Beijing, China)檢測免疫反應條帶，并在LAS-3000發光圖像分析儀(Fujifilm, Tokyo, Japan)上顯影。使用ImageJ軟件進行分析。

3.6 數據分析

實驗采用常規單向ANOVA和Dunnett多重比較檢驗以進行統計學分析。在Graphpad Prism軟件(版本：7.05; GraphPad Software, San Diego, CA, USA)上進行分析。數據代表來自3個獨立實驗的平均值。結果的重要性在統計學中表示為P值。統計P值根據顯著性檢驗方法獲得。通常，P<0.05被認為是顯著的，P<0.01被認為非常顯著，以此類推。其含義是由采樣誤差導致樣本之間出現差異的概率小于0.05或0.01。在第4節的圖中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.0001。

4 脈沖光和連續光對黑素細胞影響的實驗結果

4.1 光源照射對細胞活性的影響

圖7為不同模式LED黃光照射后HEMs的細胞活性，數據表示為相對控制組變化的倍數，取三組重復試驗平均值。結果顯示，細胞增殖沒有統計學上的顯著變化，即無論是連續光還是脈沖光，590 nm LED黃光照射對黑素細胞均不產生顯著的細胞毒性作用。

圖7 不同模式LED黃光照射后HEMs的細胞活性Fig.7 Cellular activity of HEMs with different modes of LED yellow light irradiation

4.2 脈沖及連續模式對細胞黑素成熟的影響

實驗進一步測量了連續和脈沖光照射對黑素生成的影響。黑色素是通過酪氨酸或3,4-二羥基苯丙氨酸的反應形成的生物色素。因此，比較了有光和無光處理的HEMs細胞中的黑色素含量和酪氨酸酶活性。如圖8和圖9所示，經過光照射后黑色素含量和酪氨酸酶活性均有降低。

結果顯示，連續光和脈沖光照射后，細胞黑色素含量(n=3，p<0.01)和酪氨酸酶活性(n=3，p<0.05)之間存在顯著差異。顯而易見地，脈沖光照對黑色素含量和酪氨酸酶活性具有更強的抑制作用。黑色素含量與黑素小體的成熟密切相關?？梢哉J為，脈沖LED黃光照射比連續光更能抑制黑素小體的成熟。

圖8 不同模式LED黃光照射后細胞黑素含量Fig.8 Cellular melanin content with different modes of LED yellow light irradiation

圖9 不同模式LED黃光照射后細胞酪氨酸酶活性Fig.9 Tyrosinase activity with different modes of LED yellow light irradiation

4.3 脈沖及連續模式對細胞黑素合成的影響

接下來通過研究關鍵的黑素生成酶在mRNA和蛋白質水平上的表達，探討在連續和脈沖LED黃光照射條件下對黑素生成的影響。

(1) mRNA表達。如圖10所示，連續光(n=3，p<0.01)和脈沖光(n=3，p<0.0001)照射均對TYR的mRNA表達有顯著的抑制作用，其中脈沖光組的TYR mRNA表達與連續光組相比顯著降低(n=3，p<0.05)。

圖10 不同模式LED黃光照射后TYR mRNA表達Fig.10 TYR mRNA expression with different modes of LED yellow light irradiation

同樣地，如圖11所示，連續光(n=3，p<0.01)和脈沖光(n=3，p<0.0001)照射均對TRP-1的mRNA表達有顯著的抑制作用，其中脈沖光組的TRP-1 mRNA表達與連續光組相比顯著降低(n=3，p<0.05)。

圖11 不同模式LED黃光照射后TRP-1 mRNA表達Fig.11 TRP-1 mRNA expression with different modes of LED yellow light irradiation

然而，如圖12所示，MITF的mRNA表達在有無光照射的情況下未出現顯著變化。

圖12 不同模式LED黃光照射后MITF mRNA表達Fig.12 MITF mRNA expression with different modes of LED yellow light irradiation

(2) 蛋白質表達。如圖13所示，連續光(n=3，p<0.05)和脈沖光(n=3，p<0.0001)照射均對TYR的蛋白表達有顯著的抑制作用，其中脈沖光組的TYR 蛋白表達與連續光組相比顯著降低(n=3，p<0.01)。

圖13 不同模式LED黃光照射后TYR 蛋白表達及免疫條帶Fig.13 TYR protein expression and immunological bands with different modes of LED yellow light irradiation

如圖14所示，脈沖光(n=3，p<0.01)照射對TRP-1的蛋白表達有顯著的抑制作用，脈沖光組的TRP-1 蛋白表達與連續光組相比顯著降低(n=3，p<0.05)。

圖14 不同模式LED黃光照射后TRP-1 蛋白表達及免疫條帶Fig.14 TRP-1 protein expression and immunological bands with different modes of LED yellow light irradiation

與mRNA表達相類似地，如圖15所示，MITF的蛋白表達在有或沒有光照射的情況下同樣未出現顯著變化。

圖15 不同模式LED黃光照射后MITF 蛋白表達及免疫條帶Fig.15 MITF protein expression and immunological bands with different modes of LED yellow light irradiation

綜上，經過不同照射模式處理后，TYR、TRP-1、MITF的mRNA表達和蛋白表達水平結基本一致，這些結果表明LED黃光照射能夠顯著抑制細胞內黑色素生成，并且抑制效果強弱與光照占空比明顯相關。相同的頻率、照射強度和劑量下，50%占空比的脈沖光照在降低黑素生成方面更為有效。

5 討論

連續光和脈沖光如何影響細胞的機制尚未明確[26]。我們認為，一方面，這主要是由于相應疾病的差異和實驗細胞的可變氧化還原水平的不同，使得結論分析更為復雜。另一方面，除了單一變量外，其他照明參數的控制也發生了變化。例如，許多研究中沒有提到連續光照和脈沖光照條件下的平均輻照度是否保持一致。如要求平均輻照度相同，占空比50%的脈沖光的幅值是連續光的2倍。這一因素將直接影響在相同照射時間下的總劑量。因此，本實驗中嚴格控制除占空比以外的其他可變因素，包括照射時間、平均功率、總劑量和脈沖頻率。

實驗結果表明，與無光照組相比，連續光和脈沖光照射未顯著影響細胞活性。在這一前提下，進一步探討了連續和脈沖兩種不同光照模式對于黑素體成熟和黑素生成過程的抑制作用。觀察到酪氨酸酶活性和黑素含量均在光照后降低，其中脈沖光照組的抑制作用更強，表明脈沖光照射下黑素體的抑制作用更強。此外，探討了與黑素合成相關的關鍵酶在經過不同光照處理后基因和蛋白層面的表達，結果顯示，黑素合成過程中的兩種關鍵酶TYR和TRP-1的mRNA和相對蛋白表達受到脈沖光的抑制作用更強，表明50%占空比脈沖光相對連續光而言更能抑制黑素生成。

此前關于脈沖光和連續光功效討論主要有兩類研究：一類是體外細胞實驗，一類是臨床人體實驗。Brodon等[23]通過實驗得出結論：通過減輕皮膚黑色素的過濾效應，脈沖光比連續光更能改善皮膚色素沉著，本實驗進一步發現，這一過程不僅是由于過濾效果，而且黑色素的成熟和合成本身會受到脈沖光更強的抑制作用。本實驗結果與Barolet等[19]的結論一致，即脈沖光照射擁有更好的治療效果。在本實驗設計中，更加注重光源平均輻照度的控制，嚴格確保除占空比以外其他所有的變量(照射時間、平均輻照度、總劑量、頻率、溫度等)保持一致。此外除了目標物質含量(黑色素)，進一步探索了幾種影響黑色素合成的關鍵酶在mRNA和蛋白質水平上的表達，試圖通過此研究光照對黑色素含量的影響機制。

至于為什么脈沖光照射模式要優于連續光照模式，目前有幾種可能的解釋，主要包括：

1) 細胞可能需要時間用來吸收和處理光子[19]，以及避免細胞耗盡[24]，靶向分子/細胞可能有其自身特定的熱弛豫時間。

2) 脈沖光照可能增強NO解離和ROS爆發[25]，從而增加線粒體的能量產生以參與細胞活動。

3) 可能存在通過“孔”的光的局部場增強，并且在特定頻率下的脈沖光輸出可減輕光吸收效應，導致更多的能量到達靶細胞[23]。

本實驗中脈沖光比連續光更能抑制黑素合成，可能有以下的原因：

1) 脈沖光在轉錄水平層面以抑制TYR和TRP-1 mRNA合成的方式影響黑色素合成。

2) 脈沖光可能抑制黑素合成反應的關鍵酶和相關蛋白質的合成。

在這兩種方式中，可以提出假設，在基因轉錄或蛋白質合成過程中可能存在“極限輻照度”。在實際輻照度高于極限輻照度的情況下，連續模式在同樣的時間內能夠提供更多能量，加快轉錄或合成的反應速度。

3) 酶的半衰期和脈沖持續時間之間可能存在某種重合，從而在瞬時功率更高的脈沖照射下，蛋白分解過程加快，TYR和TRP-1家族蛋白的含量降低，進一步影響黑素的合成過程。

此外值得注意的是，盡管TYR和TRP-1在無光、連續光和脈沖光模式之間具有顯著差異，但MITF表達沒有顯示出顯著變化。這可能是由于因為TYR和TRP-1直接的基因和蛋白表達直接受到光照影響，同時作為MITF的靶基因，TYR和TRP-1的編碼基因直接受MITF調節，但相反的通路是否成立，即TYR和TRP-1表達是否影響MITF的表達，可能有待研究。

6 結論

本文設計并制造了一個590 nm的黃光LED裝置，能夠在連續和脈沖模式下保持平均輻照度不變。實驗評估了不同光照條件下黑色素合成中的3種關鍵黑色素酶TYR/TRP-1/MITF的細胞活力、酪氨酸酶活性、mRNA和蛋白質表達，用來比較連續和脈沖光照射對黑素體的成熟和黑色素合成的影響。

結果顯示連續和脈沖LED光照處理顯著抑制了黑色素合成，其特征表現在mRNA和蛋白質水平上的TYR和TRP-1表達降低。與連續模式相比，脈沖光照射對黑色素合成具有更好的抑制作用，表現為更低的TYR和TRP-1基因和蛋白表達。由此得出結論，通過影響TYR和TRP-1 mRNA合成的轉錄水平以及通過合成或降解關鍵酶和相關蛋白，脈沖光能夠更有效地抑制黑色素合成。

致謝:陳力主治醫師支持和指導了本文的細胞實驗。上海力茲照明電氣有限公司制作了黃光LED裝置。在此表示感謝。