ENPP2對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響及機(jī)制

白玉婷,蘇曉靈，劉彥民，年蔚，李衛(wèi)，魏曉娟，常榮

(1青海省人民醫(yī)院，西寧 810001；2深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院·廣東醫(yī)科大學(xué)附屬龍華中心醫(yī)院)

血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)分布于整個(gè)循環(huán)系統(tǒng)中，將血管壁與循環(huán)血液分離，在幾乎所有的基本血管功能中發(fā)揮重要作用[1]。血管內(nèi)皮不僅提供了一種非黏附性、高選擇性的物理屏障來(lái)控制血管通透性，還釋放出大量的血管活性物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)血管收縮和血管壁的重塑[2]。研究表明，血管內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病的早期特征[3],保護(hù)血管內(nèi)皮功能可預(yù)防心血管疾病的發(fā)生[4]。溶血磷脂酸(LPA)是一種具有廣泛生物活性的溶血磷脂，可引起調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移、存活等的多種生長(zhǎng)因子樣反應(yīng)[5]。焦磷酸酶/磷酸二酯酶2(ENPP2)是分泌LPA的一種重要的酶。有研究表明ENPP2/LPA軸參與血管生成、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)發(fā)育等多種病理生理過(guò)程[6,7]。2018年8月，我們以HUVEC為研究對(duì)象，進(jìn)一步研究ENPP2/LPA軸對(duì)HUVEC增殖和遷移的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 HUVEC、過(guò)表達(dá)腺病毒Ad.ENPP2和對(duì)照病毒受贈(zèng)予軍事科學(xué)院醫(yī)學(xué)研究院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)血液學(xué)實(shí)驗(yàn)室。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司。RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibico公司。兔抗人AKT抗體、兔抗人磷酸化AKT(p-AKT)抗體、GAPDH抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology。兔抗人ENPP2抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。ECL發(fā)光液購(gòu)自北京莊盟生物科技有限公司。HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。SBYR熒光定量PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。TaqMan Gene Expression Master Mix購(gòu)自美國(guó)ABI公司。TRIzol Reagent美國(guó) Invitrogen公司。BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。蛋白Marker購(gòu)自中國(guó)Genstar公司。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。4%多聚甲醛、RIPA購(gòu)自北京Solarbio公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自日本Dojindo公司。LPA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海古朵生物科技有限公司。結(jié)晶紫購(gòu)自美國(guó)Cyagen公司。

1.2 過(guò)表達(dá)腺病毒Ad.ENPP2感染HUVEC細(xì)胞 HUVEC細(xì)胞計(jì)數(shù)后制成2×105/mL的細(xì)胞懸液，以1 mL/孔鋪入6孔板中過(guò)夜，次日更換培養(yǎng)基后隨機(jī)分為Ad.ENPP2組、Ad.Null組，分別感染腺病毒Ad.ENPP2、Ad.Null，感染劑量為20 MOI，6～8 h后根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)給予補(bǔ)液，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，通過(guò)qRT-PCR法、Western blotting法檢測(cè)感染效率較高。

1.3 HUVEC細(xì)胞LPA受體、ENPP2表達(dá)檢測(cè) 采用qRT-PCR法。分別收集HUVEC細(xì)胞和感染了腺病毒Ad.ENPP2、Ad.Null的HUVEC細(xì)胞3×105/mL，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗1或2次，加入1 mL TRIzol，室溫靜置5 min，取上清至1.5 mL EP管，加入氯仿200 μL，振蕩15 s，室溫靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上層無(wú)色水相至新的EP管，加入異丙醇500 μL，輕輕混勻液體，室溫靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，EP管中加入75%乙醇1 mL，輕微洗滌沉淀，4 ℃、7 500 r/min離心5 min，棄上清，真空干燥10 min，加入20 μL滅菌水溶解沉淀，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5 qRT Mix 4 μL，總RNA 2 μg，水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：以上液體混勻后短暫離心，25 ℃、10 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min，4 ℃。qRT-PCR反應(yīng)體系：水3.3 μL，2SYBR PreMix 5 μL，Primer 1 μL，cDNA 0.5 μL，ROX Ⅱ 0.2 μL。將以上混合液加入96孔板中，每個(gè)樣品3個(gè)副孔，瞬時(shí)離心后上機(jī)，PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 30 s(預(yù)變性)；95 ℃ 5 s、6 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)(PCR階段)。

1.4 ENPP2與LPAR1拮抗劑Ki16198干預(yù)HUVEC細(xì)胞后磷酸化AKT檢測(cè) 采用Western blotting法。Ad.ENPP2組、Ad.Null組分別收集感染了腺病毒Ad.ENPP2、Ad.Null的HUVEC細(xì)胞3×105/mL，加入細(xì)胞裂解液(RIPA 60～100 μL)，充分裂解細(xì)胞，加入1% PMSF，-80 ℃反復(fù)凍融(39 ℃)細(xì)胞3次后4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清。BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，取10～20 μL蛋白進(jìn)行電泳，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加GAPDH抗體、ENPP2抗體、AKT抗體、p-AKT抗體，室溫慢搖1 h或4 ℃過(guò)夜。TBST漂洗3次，每次10 min，加入含有HRP標(biāo)記的二抗TBST 5 mL(1∶5 000)，室溫孵育45 min～1 h，TBST漂洗3次，每次10 min, ECL發(fā)光液1∶1配好后曝光，使用Image J軟件進(jìn)行吸光度分析。Ad.ENPP2組、Ad.Null組加入LPAR1拮抗劑Ki16198干預(yù)HUVEC細(xì)胞，再次檢測(cè)AKT水平。1.5 細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用CCK-8法。Ad.ENPP2組、Ad.Null組HUVEC細(xì)胞感染上述病毒后若效率超過(guò)85%，用胰酶消化細(xì)胞后計(jì)數(shù)，制成5×103/mL的細(xì)胞懸液，以100 μL/孔鋪入96孔板中，分別在24、48、72 h后每孔加入CCK-8 10 μL，避光孵育2 h后使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀讀取450 nm波長(zhǎng)處光密度(OD)值以檢測(cè)ENPP2對(duì)H9c2細(xì)胞增殖的影響。為研究ENPP2調(diào)控HUVEC細(xì)胞增殖的可能機(jī)制，予HUVEC細(xì)胞LPAR1拮抗劑Ki16198后再次檢測(cè)HUVEC細(xì)胞增殖情況。

1.6 細(xì)胞遷移檢測(cè) 采用 Transwell實(shí)驗(yàn)。HUVEC細(xì)胞計(jì)數(shù)后制成2×104/mL的細(xì)胞懸液加至Transwell chamber上室中，用無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)液補(bǔ)足至200 μL，下室加入含10%FBS的RPMI1640 800 μL，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 h。取出chamber，用移液搶吸干上室液體，PBS 800 μL清洗3次，4%多聚甲醛800 μL固定30 min。吸干上室多聚甲醛，800 μL PBS清洗3次，結(jié)晶紫800 μL染色20～30 min，吸干上室結(jié)晶紫，800 μL PBS清洗3次，濕棉簽輕輕擦拭上室，顯微鏡取9個(gè)視野拍照后計(jì)數(shù)。為研究ENPP2調(diào)控HUVEC細(xì)胞遷移的可能機(jī)制，予HUVEC細(xì)胞LPAR1拮抗劑Ki16198后再次檢測(cè)HUVEC細(xì)胞遷移情況。

1.7 LPA水平檢測(cè) HUVEC細(xì)胞感染Ad.ENPP2、Ad.Null病毒后取細(xì)胞培養(yǎng)上清，按LPA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)加入檢測(cè)液，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及測(cè)得的OD值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，根據(jù)測(cè)得的樣品OD值在直線回歸方程上計(jì)算相應(yīng)濃度。

2 結(jié)果

2.1 HUVEC細(xì)胞中LPA受體表達(dá) HUVEC細(xì)胞中LPAR1～LPAR6的相對(duì)表達(dá)量分別為0.377±0.011、0.004±0.002、0.002±0.001、0.000±0.000、0.000±0.000、0.007±0.001，HUVEC細(xì)胞中LPAR1表達(dá)最高，其次為L(zhǎng)PAR6、LPAR2、LPAR3、LPAR5、LPAR4。

2.2 HUVEC細(xì)胞感染腺病毒后ENPP2表達(dá) Ad.ENPP2組、Ad.Null組ENPP2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.186±0.004、0.002±0.000，ENPP2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.261±0.080、0.532±0.031，兩組HUVEC細(xì)胞中的ENPP2 mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，P均<0.05。

2.3 ENPP2、Ki16198對(duì)HUVEC細(xì)胞AKT信號(hào)通路的影響 HUVEC細(xì)胞過(guò)表達(dá)ENPP2后，Ad.ENPP2組、Ad.Null組AKT相對(duì)表達(dá)量分別為0.539±0.008、0.107±0.004，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HUVEC細(xì)胞給予Ki16198后，Ad.ENPP2組、Ad.Null組AKT相對(duì)表達(dá)量分別為0.882±0.062、1.154±0.074，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 過(guò)表達(dá)ENPP2對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響 Ad.ENPP2組在24、48、72 h時(shí)HUVEC細(xì)胞的增殖倍數(shù)分別為2.355±0.018、4.365±0.096、4.980±0.111，Ad.Null組分別為1.983±0.050、4.017±0.077、4.728±0.059。與Ad.Null組相比，Ad.ENPP2組過(guò)表達(dá)ENPP2后HUVEC細(xì)胞于24、48和72 h增殖倍數(shù)增加(P均<0.05)。

2.5 過(guò)表達(dá)ENPP2對(duì)HUVEC細(xì)胞遷移的影響 Ad.ENPP2組、Ad.Null組細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)分別為(569.333±70.465)、(401.000±62.610)個(gè)/HP,與Ad.Null組相比，Ad.ENPP2組HUVEC細(xì)胞遷移能力增加(P<0.05)。

2.6 LPAR1拮抗劑Ki16198對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響 HUVEC細(xì)胞給予Ki16198后，Ad.ENPP2組在24、48、72 h時(shí)HUVEC細(xì)胞的增殖倍數(shù)分別為2.416±0.010、4.351±0.233、4.994±0.208，Ad.Null組分別為2.355±0.018、4.219±0.116、4.980±0.111，兩組24、48、72 h時(shí)HUVEC細(xì)胞的增殖倍數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.7 LPAR1拮抗劑Ki16198對(duì)HUVEC細(xì)胞遷移的影響 HUVEC細(xì)胞給予Ki16198后，Ad.ENPP2組細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)分別為(314.333±21.733)、(423.667±27.683)個(gè)/HP，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.8 過(guò)表達(dá)ENPP2對(duì)HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)上清中LPA水平的影響 Ad.ENPP2組、Ad.Null組細(xì)胞培養(yǎng)上清中LPA水平分別為(612.267±69.940)、(476.184±15.995)nmoL/L，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

新生血管是局部組織再生及修復(fù)的最主要因素，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化、遷移以及匯聚是組織新生血管化的重要步驟，而其功能的障礙貫穿冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病及心血管事件的整個(gè)過(guò)程[8]。內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)重要特征，包括細(xì)胞增殖缺陷和異常凋亡，其中內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力通過(guò)修復(fù)血管內(nèi)皮來(lái)應(yīng)對(duì)損傷是維持內(nèi)皮細(xì)胞壁完整性所必需的[9]。

ENPP2是維持LPA水平的主要酶ENPP2/LPA信號(hào)通路的異常與心血管疾病密切相關(guān)。為研究ENPP2/LPA軸在HUVEC細(xì)胞中的調(diào)控作用，我們首先研究了ENPP2對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖和遷移的影響。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)ENPP2可以促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的增殖和遷移。提示ENPP2在新生血管化中發(fā)揮重要作用。

LPA是一種小的、普遍存在的磷脂，通過(guò)結(jié)合并激活G蛋白偶聯(lián)受體(LPAR1～6)而發(fā)揮細(xì)胞外信號(hào)分子作用，具有神經(jīng)發(fā)生、血管生成、促進(jìn)細(xì)胞遷移、存活及致癌作用[10]。其中LPAR1、LPAR3～5廣泛分布于心血管組織中。Shlyonsky等[11]研究顯示，在慢性低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓模型中，大鼠肺組織和血清中LPA水平明顯升高，低氧組動(dòng)物的血清對(duì)大鼠原發(fā)性肺成纖維細(xì)胞具有明顯的趨化作用，LPAR1和LPAR3的拮抗劑可阻止細(xì)胞遷移，LPA可以促進(jìn)血管生成，有助于肺血管的重塑。為了進(jìn)一步研究ENPP2促進(jìn)HUVEC細(xì)胞增殖和遷移的可能作用機(jī)制，我們檢測(cè)了HUVEC細(xì)胞中LPA受體表達(dá)及細(xì)胞培養(yǎng)上清中LPA濃度。結(jié)果顯示，HUVEC細(xì)胞可表達(dá)LPAR1～6，主要表達(dá)LPAR1、LPAR6、LPAR2。進(jìn)一步研究，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)ENPP2可以促進(jìn)HUVEC細(xì)胞LPA濃度的升高，提示ENPP2可能通過(guò)促進(jìn)LPA產(chǎn)生并與LPA受體結(jié)合進(jìn)一步促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的增殖和遷移。LPAR1主要通過(guò)活化MAPK、PI3K/AKT、Rho等途徑發(fā)揮作用，介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、存活和遷移[13]。另外，有研究表明，ENPP2/LPA軸可通過(guò)調(diào)控AKT信號(hào)通路促進(jìn)H9c2細(xì)胞的增殖和遷移[14]。Hwang等[14]認(rèn)為，LPA通過(guò)激活LPA1/3受體，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、絲裂原活化蛋白激酶磷酸化、Rho和Ca2+活化，發(fā)揮血管生成效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)ENPP2可以上調(diào)HUVEC細(xì)胞p-AKT活性，提示AKT信號(hào)通路參與ENPP2調(diào)控的HUVEC細(xì)胞的增殖和遷移。Ki16198是LPA受體拮抗劑，可同時(shí)拮抗LPAR1和LPAR3，本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，Ki16198對(duì)HUVEC細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響，但能抑制HUVEC細(xì)胞的遷移，與此同時(shí)，我們檢測(cè)了HUVEC細(xì)胞給予Ki16198后AKT信號(hào)通路表達(dá)的情況，結(jié)果顯示，Ki16198可以下調(diào)HUVEC細(xì)胞p-AKT表達(dá)，提示Ki16198可能通過(guò)拮抗LPAR1進(jìn)而調(diào)控AKT信號(hào)通路影響HUVEC細(xì)胞的遷移。

綜上所述，ENPP2/LPA軸可能通過(guò)調(diào)節(jié)AKT信號(hào)通路調(diào)控HUVEC細(xì)胞的增殖和遷移，LPA受體拮抗劑Ki16198可能通過(guò)抑制LPAR1進(jìn)而抑制AKT信號(hào)通路而調(diào)控HUVEC細(xì)胞的遷移。