種植材料表面納米級形貌對細胞成骨效應的影響

蔡彥坤 祁星穎 綜述 隋磊 審校

材料表面的形態特征是影響種植體骨整合效果的重要因素，適當粗糙表面較之光滑表面更有利于骨整合的形成［1］。目前應用于臨床的種植體表面多具有微米級形貌，有利于細胞成骨向分化，但可能抑制成骨細胞增殖，影響種植體表面成骨速度［2］。納米級形貌是指至少在一個維度上尺寸為納米級水平的顯微形貌。采用酸蝕［3］、陽極氧化［4-6］、堿熱、水熱［7］、電子束刻蝕［8］等方法可在材料表面獲得具有不同幾何形態的納米級形貌，常見者包括納米管［9-10］、納米結節［11］、納米球［12］、納米凹坑［13］、納米溝槽［14］等。這些納米級形貌或單獨存在，或與微米級形貌形成復合結構，都會對組織細胞的生物學行為產生一定影響，多數學者認為其對材料表面成骨具有促進作用［1，15-16］。

本文綜述種植材料表面納米級形貌對細胞成骨效應的影響及其機制，以期為相關實驗研究及后期臨床轉化提供線索。

1 細胞黏附

一般認為，納米級形貌對細胞成骨效應的影響機制在于其對早期蛋白吸附、細胞粘附及后續的細胞伸展、增殖、分化等一系列生物學行為的調控。其中，整合素介導的細胞粘附是納米級形貌產生作用的最重要環節。整合素是由α和β亞單位鏈構成的跨膜受體，直徑約為8～12 nm，其細胞內部分通過多種銜接蛋白（talin，vinculin，paxillin等）與肌動蛋白絲相連，并通過肌動蛋白絲與細胞核實現連接［17-18］。當細胞與具有納米級結構的材料表面接觸時，細胞外基質首先與材料表面發生反應，其中的蛋白質通過靜電引力吸附于納米結構表面［19］，這些蛋白質的RGD序列（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列）作為配體，可以與整合素發生特異性結合［17］。細胞的絲狀偽足表面含有整合素，在絲狀偽足伸出并感知細胞所處環境、收集空間信息的過程中，其上的整合素與吸附于納米級形貌表面的RGD蛋白相結合，形成包含RGD蛋白、整合素、銜接蛋白以及肌動蛋白絲在內的超分子復合體，即黏著斑（focal adhesion，FA）。黏著斑的形成使細胞偽足錨定在粘附位點上。當黏著斑數量較多且間距適宜時，在肌動蛋白絲的牽引下相互連結聚合，形成更大更成熟的黏著斑復合物（直徑約為2～5μm）［18］，促進細胞的粘附。研究表明，單個RGD配體間距約70 nm時，有利于整合素受體與配體結合并聚集［20-21］，即有利于黏著斑復合物形成。黏著斑聚合的同時，肌動蛋白絲亦聚合成束，促使細胞骨架重組，為細胞在材料表面的伸展提供動力基礎。在整合素-RGD蛋白發生結合的同時，整合素構象發生改變，會激活與之連接的黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）。FAK是一種酪氨酸激酶，在胞漿內通過整合素銜接蛋白與黏著斑共存，并與多種信號蛋白、結構蛋白相關聯。當整合素構象因納米及形貌的作用而發生改變時，與其相連的FAK上某些位點（如Tyr397位點）會發生自動磷酸化，并與Src蛋白結合形成FAK-Src復合物，進而發生一系列級聯反應激活下游信號通路。FAK的激活可調控Rac1表達升高，有利于細胞板狀偽足的形成，進而促進細胞在材料表面的錨定；同時還可激活Rho-GTPase（主要為RhoA），使肌球蛋白收縮，促進肌動蛋白聚合，為細胞伸展提供有利條件［22］。

2 細胞增殖

當細胞粘附在納米級形貌表面后，即開始增殖活動。納米級形貌對細胞增殖能力的促進可能與其表面吸附的蛋白、FAK信號通路及細胞間相互作用有關。①吸附蛋白：細胞通過表面吸附蛋白的介導粘附于材料表面，實驗表明，細胞增殖能力與吸附蛋白的數量呈正相關［7］。此外，吸附于納米結構表面的蛋白可能因納米級形貌的不同而改變蛋白構象，繼而影響整合素的結合及不同亞基的激活，從而調控細胞增殖［23］；②FAK相關信號通路：FAK的激活是細胞粘附后調控細胞增殖、分化的重要環節［24］，一方面，FAK的激活對其下游信號通路RhoA-ROCK的表達具有正向調控作用，從而促進細胞增殖［25］；另一方面，FAK-Src形成復合物后產生SH2結構域，與接頭蛋白結合，再與Ras中的交換因子結合，從而激活Ras-Raf-MAPK／ERK通路，經過磷酸化級聯反應將表面形貌信號轉導至細胞核內，通過促分裂原蛋白活化激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的作用促進細胞分裂增殖［26-27］；③細胞間相互作用：細胞間相互作用時的信號傳遞主要由跨膜結構神經鈣黏素（N-cadherin）完成，其對細胞增殖具有重要作用。在具有納米結構的表面上，形狀伸展的細胞較在光滑表面上類圓形的細胞需要更多的N-cadherin生成來維持細胞間的粘附，因而N-cadherin呈現高表達［28］。而N-cadherin能激活Ca2+通道，使與之相連的鈣調素（calmodulin，CaM）激活，進而激活MAPK通路。

3 細胞分化

納米級形貌對干細胞成骨向分化的調控機制目前尚不完全清楚。現有研究報道因所采用的納米級形貌的形態不同、細胞分化水平不同以及所觀察的信號通路不同，導致結論存在很多爭議。一般認為，納米結構對細胞成骨向分化的促進作用主要通過細胞骨架對機械力的傳導以及整合素相關信號轉導兩方面實現。

細胞骨架對機械力的傳導是目前本領域的研究熱點之一。當細胞粘附于納米級粗糙表面時，較之在光滑表面上具有更伸展的形態，細胞內部相應產生一定的張力，繼而細胞骨架發生重組，以維持其形態的穩定。在此過程中細胞內產生了一系列機械信號和生物化學信號變化，主要包括：①細胞核形狀變化：細胞骨架通過整合素與細胞外基質相連，連接細胞膜與核膜，又通過LINC復合體（linkers of nucleoskeleton and cytoskeleton complexes）與細胞核骨架（nucleoskeleton）相連，使細胞作為一個整體感受外界機械力的變化。細胞骨架重組、張力增加，使細胞核的形狀發生改變，細胞核骨架亦發生重組，進而在染色質重組酶的介導下使染色質重組［29］，染色質重組過程中，某些轉錄因子被激活，進而上調了成骨向分化相關基因的表達；②與細胞骨架相連的細胞因子被激活：細胞形態對YAP（yes-associated protein）等與細胞骨架相連的細胞因子在細胞質及細胞核內的分布有直接影響，有研究表明，細胞骨架的收縮和重組會抑制YAP在細胞質中的磷酸化，有利于YAP從細胞質轉移至細胞核內。其入核后與RunX2等成骨分化相關轉錄因子結合，可促進細胞成骨向分化［30］；③鈣離子通道：細胞內張力增加可能直接使牽張激活性Ca2+通道開放，Ca2+流入細胞內，激活CaM，CaM不僅可以激活MAPK通路，還可以與β連環素（β-catenin）結合，使肌動蛋白收縮，細胞骨架重組［31］，進而激活前述信號通路。

整合素相關信號轉導是納米級形貌調控細胞成骨向分化的另一重要機制。信號轉導的起始環節主要包括FAK和整合素連接激酶（integrin linked kinase，ILK）的激活。①FAK的激活：FAK磷酸化可激活相關下游信號通路，如RhoA-ROCK通路［32］、MAPK通路等，促進成骨細胞相關基因ALP、RunX2、OCN、OPN等的表達，從而促進細胞的成骨向分化；②ILK的激活：ILK與整合素β亞基的細胞內部分相連。在納米級形貌表面，整合素-RGD蛋白結合會改變整合素的構型，使 β1亞基選擇性激活并高表達［3，33-34］，進而激活ILK，而被激活的ILK可抑制GSK-3β的表達及GSK-3β對β-catenin的磷酸化，使細胞質中游離的β-catenin不被降解，且逐漸在細胞質中積聚進而轉移至細胞核中與RunX2等轉錄因子結合并表達［35］，促進細胞成骨向分化［28，34］。

綜上所述，細胞對納米級粗糙表面的粘附是納米級形貌發揮促進細胞成骨效應的關鍵環節，其對細胞增殖、分化的影響均與整合素介導的細胞粘附及伸展密切相關，當材料表面的微觀形貌利于整合素的聚集時，則有利于細胞的粘附，并為后續的細胞增殖、成骨向分化、細胞外基質礦化及骨組織成熟奠定良好基礎；反之則細胞成骨效應不佳。因此可以認為細胞粘附是種植材料表面骨形成的前提和基礎。然而，因不同實驗間納米級形貌特征、細胞種類及評價標準的差異，現有研究結果可比性尚存疑問。未來研究可采用激光處理等手段獲得精確可控的納米級表面形貌，排除混雜因素，更精準地了解特定納米級形貌對細胞城固效應的影響及其機制，以期篩選出有利于成骨的最佳微觀形貌，推動種植體體表面設計的更新迭代。