Claudin-2在膽固醇結石形成過程中的作用及其機制研究*

陳 躍 馮亞東 趙向陽

南京市溧水區人民醫院消化科(東南大學附屬中大醫院溧水分院)1(211200) 東南大學附屬中大醫院消化科2

背景：Claudin蛋白家族是構成細胞緊密連接的重要分子，其中claudin-2是一種在肝細胞和膽管細胞中高表達的細胞旁通道形成蛋白，具有水分子和陽離子的選擇滲透性，在消化和泌尿系統中發揮至關重要的生理調控作用。目的：探討claudin-2在膽固醇結石形成和膽汁分泌過程中的作用及其機制。方法：收集claudin-2基因敲除(Cldn-2-/-)小鼠和野生型(Cldn-2+/+)小鼠的肝臟和膽囊組織，以蛋白質印跡法檢測claudin蛋白家族的表達，HE染色、免疫熒光染色和電鏡觀察敲除claudin-2基因對肝臟和膽囊組織結構的影響。并分析claudin-2蛋白對膽汁成分和流速的調控作用。結果：Claudin家族蛋白在Cldn-2+/+小鼠肝臟和膽囊組織中高表達。與Cldn-2+/+小鼠相比，Cldn-2-/-小鼠肝臟和膽囊組織結構無明顯差異，膽汁流速明顯降低(P<0.05)，膽汁濃度明顯增加(P<0.05)，肝臟和膽囊膽汁中的膽汁酸、膽固醇、膽紅素、磷脂含量顯著增加(P<0.05)。結論：Claudin-2蛋白通過調控膽汁成分和細胞緊密連接中的水分子旁分泌過程，影響膽汁的形成，這一過程的失調顯著增加了小鼠對膽固醇結石相關疾病的易感性。

膽石癥是消化系統的常見疾病，我國的發病率高達10%～15%，并呈逐年上升的趨勢[1]，但對膽石癥尤其膽固醇結石形成的具體機制缺乏深入的研究。有研究發現，在膽汁成核作用開始，到脂質轉化、囊泡破壞和融合直至膽固醇單水結晶形成的過程中，成核因子和抑成核因子在多個水平上調控膽固醇的成核作用[2]，尋找關鍵的成核因子和抑成核因子是遏制膽固醇結石形成的重要突破口。

Claudin-2是第一個發現的通道形成蛋白，具有水分子和陽離子的選擇滲透性，在消化和泌尿系統中發揮至關重要的生理調控作用[3-4]。Claudin-1、-2、-3蛋白在肝臟和膽管系統中廣泛分布，claudin-1基因的功能障礙會導致膽汁滲漏、肝內膽汁淤積和肝細胞損傷，形成硬化性膽管炎[5]。目前尚無關于claudin-2基因在膽囊結石致病機制中的報道，但其功能可能與claudin-1類似，在膽管結石的形成過程中發揮重要的生理調控作用。本研究通過評估敲除claudin-2基因對小鼠肝臟和膽囊組織結構的影響，以及對膽汁成分和流速的調控作用，旨在探討claudin-2在膽固醇結石形成和膽汁分泌過程中的作用及其機制，從而為臨床治療膽囊結石尋找潛在靶點。

材料與方法

一、實驗動物和主要試劑

1.實驗動物：20只SPF級claudin-2基因缺失(Cldn-2-/-)C57BL/6小鼠和20只claudin-2野生型(Cldn-2+/+)小鼠購自上海南方模式生物科技股份有限公司，體質量20～25 g。由東南大學附屬中大醫院動物實驗中心飼養并穩定建系傳代。所有動物實驗方案通過東南大學附屬中大醫院動物研究倫理委員會批準。

2.主要實驗試劑：兔抗claudin-1、-2、-3抗體(Invitrogen，Life Technologies)，Alexa-488標記的抗兔IgG以及Alexa-546標記的抗鼠IgG抗體(Molecular Probes)。

二、實驗方法

1.實驗分組和組織標本的獲?。篊ldn-2+/+小鼠和Cldn-2+/+小鼠喂食膽固醇結石誘石飼料4周。所有實驗小鼠于術前禁食12 h，戊巴比妥(4.5 mg/100 g劑量)腹腔注射麻醉，采用腹部正中切口，暴露膽囊，觀察有無結石并收集部分膽汁進行膽汁成分分析，結扎膽囊管切除膽囊于液氮凍存，同時采集肝臟組織-80 ℃保存。

2.HE和免疫熒光染色：取肝臟和膽囊組織，以甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片行常規HE染色，光學顯微鏡下分析肝臟和膽囊組織形態學變化。另取部分液氮冷凍的肝臟和膽囊組織進行切片，修復抗原，清除內源性過氧化物酶活性，血清封閉，滴加claudin-1、-2、-3免疫熒光抗體(工作濃度1∶750)4 ℃孵育過夜，室溫下孵育二抗2 h，封片。光學顯微鏡下觀察免疫熒光染色結果。

3.膽汁流量測量：小鼠自由飲水、禁食4 h后戊巴比妥腹腔注射麻醉，剖腹分離膽總管后插入塑料引流管并結扎固定，待流量穩定后連續觀察4 h，測定每小時膽汁流量和流速，并收集部分膽汁進行膽汁成分分析。

4.蛋白質印跡法檢測肝臟組織claudin蛋白家族的表達情況：取100 mg肝臟組織，低溫研磨，充分裂解后獲取蛋白上清，以Bradford法進行蛋白定量。取40 μg蛋白樣品，行10% SDS-PAGE電泳，半干轉至硝酸纖維素膜，37 ℃封閉液中封閉2 h；分別加入claudin-1、-2、-3抗體(工作濃度為1∶500)4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜3次后，加入相應二抗(工作濃度1∶20 000)，室溫下孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL化學發光試劑顯色。以GAPDH蛋白條帶作為內參。

5.電鏡觀察膽囊和肝內膽管超微結構：取肝內膽管和膽囊組織，2.0%多聚甲醛和2.0%戊二醛溶液前固定24 h，磷酸緩沖液沖洗，置于1%鋨酸中后固定2 h，雙蒸水沖洗后系列乙醇脫水，包埋，切片，厚60～90 nm，醋酸鈾-檸檬酸鉛復染，透射電鏡(JEM-1230)下觀察并拍照。

三、統計學分析

結 果

一、Claudin蛋白家族在肝臟和膽囊組織中存在特異性高表達

Claudin-1、-2、-3在Cldn-2+/+小鼠肝內膽管和膽囊上皮的表達均較高，而敲除claudin-2基因后，claudin-2表達顯著降低，但claudin-1、-3表達無明顯差異(圖1)。說明claudin蛋白家族在Cldn-2+/+小鼠肝臟和膽囊組織中特異性高表達，Cldn-2-/-小鼠能在肝臟和膽囊組織中實現claudin-2蛋白的特異性敲除，同時不影響其他claudin蛋白的表達。

二、Claudin-2蛋白對肝臟和膽囊組織結構的影響

HE染色示，兩組小鼠肝臟和膽囊組織并未呈明顯的差異(圖2A、2B)。掃描電鏡結果顯示，與Cldn-2+/+小鼠相比，Cldn-2-/-小鼠靜脈區膽管寬度[0.79±0.03)mm對(0.78±0.04)mm]、門靜脈區[(0.92±0.03)mm對(0.90±0.02)mm]均無明顯差異(P>0.05；圖2C)。說明敲除claudin-2基因在組織學上并不會對肝臟和膽囊組織結構產生明顯影響。

A：免疫熒光染色；B：蛋白質印跡法

A：肝臟HE染色(×100)；B：膽囊HE染色(×100)；C：掃描電鏡(×200)

圖2 敲除claudin-2基因對小鼠肝臟和膽囊結構的影響

三、Claudin-2蛋白對膽汁流速的影響

與Cldn-2+/+小鼠相比，Cldn-2-/-小鼠肝內和膽囊膽汁的顏色加深，質地濃稠(圖3A)；膽汁流速明顯降低[(3.00±0.40)μL·min-1·100 g-1對(5.80±0.32)μL·min-1·100 g-1，P<0.05；圖3B]。證實敲除claudin-2基因會導致膽汁分泌的流速降低、膽汁濃縮。

四、Claudin-2蛋白對膽汁成分的調控

與Cldn-2+/+小鼠相比，Cldn-2-/-小鼠肝臟和膽囊膽汁中總膽固醇、磷脂、總膽汁酸、總膽紅素含量均明顯升高(P<0.05；圖3C、3D、表1)。

討 論

膽囊膽固醇結石的形成機制相當復雜，受到多種因素的影響和調控。研究發現，成核因子和抑成核因子共同參與了膽囊膽固醇結石的形成，其中包括蛋白質、有機離子和無機離子[6-7]。本研究通過Cldn-2-/-小鼠的在體和離體實驗證實claudin-2蛋白缺失會改變分泌膽汁成分，進而誘導膽囊結石的形成，有望為尋找遏制膽固醇結石形成的關鍵因子提供重要突破口。

研究認為，生物系統內外環境的穩定性可通過細胞旁滲透進行調節，細胞旁滲透的破壞可誘發多種疾病。緊密連接作為細胞間的一種連接方式，是細胞旁滲透發揮生理作用的結構基礎，可實現水分子和脂溶性物質的選擇性轉運，為維持上皮細胞內外兩個不同環境的穩定提供滲透屏障，進而保證上皮細胞的極性[8]。多種緊密連接蛋白共同組成了細胞的緊密連接，包括claudin蛋白、連接黏附分子(JAMs)、咬合蛋白(occludin)，其中claudin蛋白是緊密連接最重要的組成部分[9-10]。Claudin蛋白家族是一個四跨跨膜蛋白的大家族，目前發現了至少27個成員，在不同細胞系統中發揮不同功能[11]。Claudin-2是claudin蛋白家族中最早發現和研究最多的緊密連接蛋白，能形成陽離子選擇性通道[12]。在腎臟組織中，claudin-2基因的缺失會導致小鼠近端小管喪失陽離子選擇性，鈉離子和氯離子的重吸收受阻[13]。研究發現claudin-2通過形成細胞旁水通道，介導水分子在MDCK細胞間的跨細胞運輸[14]。膽管系統分泌的膽汁成分中98%是水，因此膽汁中水分含量會直接影響膽汁流速和成分[1]。本研究發現，敲除claudin-2基因后膽汁中的鈉離子濃度降低，膽汁酸和脂質成分濃縮，提示膽管系統中claudin-2缺失可減弱細胞緊密連接中的水分子旁分泌，進而造成膽汁中膽汁酸、膽固醇、磷脂、膽紅素等成分的濃縮和相對含量增加，膽汁流速降低，從而促進小鼠膽固醇結石的形成。

*P<0.05

A：肝內膽汁和膽囊膽汁肉眼圖；B：膽汁流速；C：肝臟膽汁成分；D：膽囊膽汁成分

圖3 Claudin-2蛋白對膽汁流速和成分的調控作用

表1 Cldn-2+/+和Cldn-2-/-小鼠膽汁成分比較

總之，本研究證實膽汁成分和分泌量部分受claudin-2蛋白介導的細胞旁通透性所調節，有望為預防膽石病提供新的治療靶點，靶向claudin-2調控的細胞旁通透性可能成為治療各種病因引起的膽汁淤積癥的潛在策略。