超聲分散技術(shù)前處理的痰標(biāo)本分枝桿菌培養(yǎng)觀察

田鵬，王俊玲，凌曉潔，張真金，尹詩維，鄧云峰

(山東省胸科醫(yī)院漢光國際微生物實驗室,濟(jì)南250013)

近年，結(jié)核病的發(fā)病率居高不下。早發(fā)現(xiàn)、早處理對結(jié)核病患者的預(yù)后具有重要意義。肺結(jié)核病依然是我國重點防控的主要傳染病，實驗室診斷是我國十三五結(jié)核病防治規(guī)劃的核心內(nèi)容。痰標(biāo)本的分離培養(yǎng)檢測不僅是結(jié)核病實驗室診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，并且還是開展藥物敏感試驗、分枝桿菌菌種鑒定、基因分型，以及各種基礎(chǔ)研究的前提。影響痰分枝桿菌培養(yǎng)污染率和陽性檢出率最關(guān)鍵因素是前處理方法的選擇，因此，改良與創(chuàng)新分枝桿菌培養(yǎng)前處理方法是國內(nèi)外專家和學(xué)者們研究的熱點[1～4]，但目前國內(nèi)外專家均把改良和創(chuàng)新關(guān)注點大多放在了前處理液的選擇上，臨床尚未見將超聲分散技術(shù)應(yīng)用在痰分枝桿菌培養(yǎng)的前處理過程中的報道。目前，越來越多的技術(shù)和方法被應(yīng)用到臨床實驗室，超聲分散技術(shù)就是其中之一。超聲分散技術(shù)的原理為超聲波發(fā)生器發(fā)出高頻振蕩信號，在介質(zhì)中產(chǎn)生高頻機(jī)械振蕩，使結(jié)團(tuán)物質(zhì)在液體內(nèi)均勻分散。我們采用超聲分散技術(shù)前處理了400例份痰標(biāo)本,并觀察其分枝桿菌培養(yǎng)效果。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 根據(jù)2015年版《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[5]中痰標(biāo)本收集的要求，連續(xù)收集山東省胸科醫(yī)院2018年1～8月間收治的387例疑似肺結(jié)核患者的痰液標(biāo)本，共400例份，標(biāo)本量為3～5 mL。387例患者中男260例、女127例，年齡12～89歲(50±13)歲。400例份干酪樣痰標(biāo)本平行均分為A、B、C組及對照組。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)同意，納入者均知情同意并簽署知情同意書。。

1.2 儀器和試劑 超聲分散儀使用廣東體必康生物科技有限公司的超聲波發(fā)生器(固定頻率小于50 kHz)，4%氫氧化鈉(NaOH)溶液為本實驗室自配，酸性改良羅氏培養(yǎng)基使用珠海貝索生物科技有限公司產(chǎn)品。研究中獲得的所有培養(yǎng)產(chǎn)物使用BD布魯克質(zhì)譜儀進(jìn)行菌株鑒定。

1.3 超聲分散處理及分枝桿菌培養(yǎng) 實驗組采用超聲分散技術(shù)進(jìn)標(biāo)本前處理，將1 mL痰標(biāo)本與1～2 mL的4%NaOH溶液混合，放入超聲分散儀中超聲處理1 min，室溫靜置5 min后，接種于酸性改良羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)。對照組根據(jù)2015年版《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》分枝桿菌培養(yǎng)標(biāo)本前處理簡單法操作：將1 mL痰標(biāo)本與1～2 mL的4% NaOH溶液混合，并在渦旋振蕩器上渦旋震蕩30 s左右直至痰標(biāo)本充分液化，室溫靜置15 min，接種于酸性改良羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)。

1.4 觀察指標(biāo)及方法 連續(xù)觀察各組分離培養(yǎng)的生長情況，觀察并記錄各組菌株生長并判定為抗酸桿菌陽性的時間，測算各組分枝桿菌培養(yǎng)陽性率(陽性菌株例份/總例份)，各組菌株生長并判定為糠酸桿菌陰性的視為標(biāo)本被污染，計算標(biāo)本污染率(陰性菌株例份/總例份)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料比較采用秩和檢驗計數(shù)資料，以n及%表示，比較采用χ2檢驗。二分類變量及無序多分類變量的組內(nèi)與組間差異比較采用χ2檢驗，非正態(tài)分布的計量資料。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

實驗組及對照組實驗組及對照組出現(xiàn)陽性菌株時間分別為(20±8.11)、(20±7.67)d。實驗組、對照組分枝桿菌培養(yǎng)陽性率分別為30.0%(120/400)、23.5%(94/400)(P<0.05)。實驗組、對照組培養(yǎng)污染率分別為1.0%(4/400)、4.8%(19/400)(P<0.05)。

同一標(biāo)本在對照組生長并判定為其它細(xì)菌污染而被實驗組報告陽性的為13例份，同一標(biāo)本在對照組生長并判定為抗酸桿菌陽性而被實驗組報告陰性的為1例份，同一標(biāo)本在對照組不生長判定陰性而被實驗組報告陽性的為13例份。

3討論

痰標(biāo)本是一種成分復(fù)雜的標(biāo)本類型，通常情況下可有多種菌體共存,分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)本前處理的目的就是盡可能殺滅痰標(biāo)本中的污染菌來控制污染率，同時還要最大限度的保持分枝桿菌的活力以提高陽性檢出率。首先，標(biāo)本的正確采集和留取非常重要。對于痰標(biāo)本，患者口腔正常菌群、口腔衛(wèi)生狀況是造成污染的主要原因。文獻(xiàn)[6～8]報道，患者留取痰標(biāo)本前刷牙、用涼開水或洗必泰漱口，痰培養(yǎng)污染率可明顯降低。其次，操作技術(shù)、前處理方法等因素都與痰分枝桿菌培養(yǎng)污染率和陽性檢出率密切相關(guān)。大量國內(nèi)外研究[1～4]顯示，影響痰分枝桿菌培養(yǎng)污染率和陽性檢出率最關(guān)鍵因素是去前處理的方法的選擇。WHO現(xiàn)行指南要求前處理時NaOH的終濃度為1%～2%，但也有文獻(xiàn)[9，10]報道，終濃度為1%～2% 的NaOH前處理方法在去除葡萄球菌屬、肺炎克雷伯菌、腸球菌、黏質(zhì)沙雷菌、嗜麥芽窄食假單胞菌等污染菌方面不是有效的方法。傅津平等[11]提出在痰分枝桿菌培養(yǎng)前處理時采用0.1%新潔爾滅代替4%的NaOH，有較好的前處理效果，痰污染率為0.4%，培陽率為 38.8%。本研究引進(jìn)新技術(shù)成果，將超聲分散技術(shù)應(yīng)用于痰分枝桿菌培前處理的過程，通過分枝桿菌培養(yǎng)陽性率、分枝桿菌培養(yǎng)污染率等指標(biāo)比較四組不同前處理方法的優(yōu)劣，以探討超聲分散技術(shù)在痰分枝桿菌培養(yǎng)中的應(yīng)用價值。

本研究采用的對照組前處理方法為經(jīng)典的技術(shù)，從1931年 Lowenstein 和 1932 年 Jensen 發(fā)明羅氏培養(yǎng)基(L-J)開始，一直沿用至今，也是我國相關(guān)操作指南推薦在基層結(jié)核病實驗室廣泛使用的分枝桿菌培養(yǎng)的前處理方法(簡單法)[12]。趙立平[2]等在報道中認(rèn)為，簡單法的檢出陽性率與離心法接近，但操作相對簡單、污染率較低，初生長時間也相對較短，因而可能更符合臨床的需要。實驗組前處理方法是在簡單法前處理方法的基礎(chǔ)上加入超聲分散技術(shù)。超聲分散技術(shù)的原理[13]為超聲波發(fā)生器能夠發(fā)出高頻振蕩信號在介質(zhì)中產(chǎn)生高頻機(jī)械振蕩，使液體振蕩，產(chǎn)生數(shù)以萬計的微小氣泡(即空化核)。空化核在聲場的作用下振動，當(dāng)聲壓達(dá)到一定值時，氣泡迅速增長，然后突然閉合，在氣泡閉合時產(chǎn)生沖擊波，在其周圍產(chǎn)生上千個大氣壓，破壞結(jié)團(tuán)的物質(zhì)，使結(jié)團(tuán)物質(zhì)在液體內(nèi)均勻分散，簡稱“空化”作用。Nor Saadah等[14]提出，超聲波在液體中對于細(xì)菌的殺傷作用有兩方面，第一產(chǎn)生物理“空化”作用，第二產(chǎn)生化學(xué)作用即能使水分子解離，增加去污染溶液的殺菌效果。同時，超聲波在液體中殺菌作用強(qiáng)弱，還與細(xì)菌本身特點有關(guān)，例如細(xì)菌的大小、細(xì)胞壁的成分厚薄程度及細(xì)菌是否有芽孢莢膜等。

本研究對400例痰標(biāo)本分離培養(yǎng)總體陽性率和總體污染率以及同一標(biāo)本在不同組間分離培養(yǎng)生長情況的觀察結(jié)果顯示：實驗組的前處理方法與對照組相比較，實驗組分枝桿菌培養(yǎng)陽性率增高且污染率降低，這說明與對照組相比，實驗組能夠在充分保護(hù)痰中分枝桿菌活性的基礎(chǔ)上，增加對痰中污染菌的抑制，能夠更好的避免因污染菌生長而造成的陽性標(biāo)本漏檢；且實驗組前處理過程用時短，縮短了痰分枝桿菌培養(yǎng)實驗過程的時間成本。同一標(biāo)本在不同組間分離培養(yǎng)的生長情況顯示，對照組19例報告污染的痰標(biāo)本中，有13例在實驗組報告了培養(yǎng)陽性，也再一次證明了實驗組的前處理方法能更好的避免因污染菌生長而造成的陽性標(biāo)本漏檢。對13例痰標(biāo)本分析發(fā)現(xiàn)，標(biāo)本性狀較為特殊，均為十分黏稠的干酪樣痰。這提示可能在處理特殊性狀的痰標(biāo)本特別是十分黏稠的干酪樣痰時，實驗組的方法更優(yōu)。

綜上所述， 超聲分散技術(shù)前處理的痰標(biāo)本去污染效果明顯，可有效殺滅痰標(biāo)本中的污染菌，同時保持分支桿菌的活力，分枝桿菌培養(yǎng)陽性檢出率高，且超聲分散計數(shù)前處理所需時間短。