梅毒螺旋體重組蛋白在血清學診斷中應用的研究進展

鄧毅，雷鳴，趙飛駿，張曉紅

(1 南華大學病原生物研究所，湖南衡陽421001；2 南華大學附屬常德市第一人民醫院)

梅毒是一種可累及人體多器官系統的性傳播疾病，其病程長、臨床表現復雜多變，嚴重危害人類健康。其病原體為密螺旋體屬蒼白密螺旋體蒼白亞種，俗稱梅毒螺旋體(Tp)。盡管有研究者對其在體外以棉尾兔細胞做載體進行了培養，但仍未真正實現Tp的體外人工培養繁殖，極大限制了相關的基礎與臨床研究[1]。近年來，隨著分子生物學技術的飛速發展，在重組膜脂蛋白、表面蛋白基礎上，許多新的梅毒重組蛋白[2]如感染依賴性抗原、假定蛋白、黏附相關蛋白及鞭毛蛋白等，都被納入梅毒血清學診斷的候選蛋白進行了相應評價。現對這些蛋白在血清學診斷方面的應用綜述如下。

1 Tp感染依賴性抗原及假定蛋白

活的Tp在感染階段時，可能新合成分泌了一些抗原到菌體內外或胞質；這類抗原可通過調控宿主細胞信號轉導通路，介導Tp與宿主細胞間的相互作用，在梅毒感染早期的炎癥反應以及在宿主體內持續慢性感染過程中發揮重要作用，因此被稱為Tp感染依賴性抗原[3]。

1.1 Tp0971、Tp0768、Tp0462 Tp0971基因全長615 bp,可編碼305個氨基酸，蛋白晶體結構分析顯示其可能是一種周質膜脂蛋白，具有乳鐵蛋白結合特性和金屬離子穩態作用[4, 5]。張躍軍等[6]研究發現，Tp0971膜脂蛋白能刺激THP-1細胞轉化的巨噬細胞分泌大量前炎癥細胞因子IL-6、IL-1β，且這些細胞因子的分泌水平與Tp0971濃度呈一定劑量依賴關系。McKevitt等[7]研究顯示，被Tp感染后第7、14、28、56、84 d的新西蘭兔血清能識別重組GST-Tp0971融合蛋白,提示Tp0971在梅毒感染的診斷中有潛在價值。Brinkman等[8]研究發現，重組GST-Tp0971融合蛋白也與早期、二期和潛伏早期梅毒患者血清有較強的免疫反應性。曾鐵兵等[9]以重組蛋白Tp0971為已知抗原建立間接ELISA法，并與TPPA法進行了比較，結果顯示rTp0971-ELISA的特異性為100%、敏感性為89.1%、總符合率為92.7%，但其檢出率低于TPPA法 。

Tp0768又名TmpA抗原，可編碼345個氨基酸，相對分子質量約37 kDa，是Tp的一種質膜蛋白。Liu等[3]利用基因工程技術在原核表達系統中成功地表達和純化獲得了高純度的Tp0768重組蛋白，經免疫印跡鑒定，重組蛋白Tp0768能被梅毒患者陽性血清所識別,具有良好的抗原性,可以作為一種梅毒診斷抗原。同時，他們在篩選梅毒診斷抗原的過程中發現，Tp0768也具有感染依賴性抗原的特點，并與新西蘭兔血清和臨床患者的血清標本具有較好的免疫反應性。

Tp0462可編碼392個氨基酸，相對分子質量約40 kDa，屬于Tp013X家族，是一種目前功能未知的假定蛋白。經生物信息學分析，推測Tp0462具有信號肽，有可能是一種具有多個抗原表位區的分泌蛋白。劉文等[10]通過基因工程技術成功構建了pET43.1a/Tp0462重組質粒，并將其表達于大腸桿菌中，經免疫印跡鑒定，Tp0462與梅毒陽性血清發生免疫反應，而與梅毒陰性血清不反應。在后續的相關實驗中，他們以重組蛋白Tp0462為基礎建立間接ELISA法；結果顯示，基于Tp0462蛋白建立的ELISA檢測結果的靈敏度為97.0%、特異性為98.8%、ROC曲線下面積(AUC)為0.997，提示該蛋白具有較高的臨床診斷價值。通過動物實驗篩選Tp感染依賴性抗原時發現，活Tp接種組新西蘭兔誘導產生的抗體總水平與滅活Tp接種組并無顯著差異，但前者血清中檢測到有較高滴度的抗Tp0462特異性抗體，是一種非菌體膜蛋白，而后者血清中并無相關抗體,從而認為Tp0462是符合感染依賴性抗原特點的候選抗原蛋白之一。

在進一步的研究中[3]，分別以單一的Tp0971、Tp0768及Tp0462蛋白為包被抗原建立間接Tp-ELISA法，檢測了2 138份梅毒血清標本，評價其在梅毒血清診斷學中的價值。研究結果顯示，與TPPA法相比較，基于Tp0971、Tp0768、Tp0462建立的ELISA檢測結果的敏感性和特異性分別為97.6%、96.6%和97.0%、95.2%和91.7%、98.8%，前者顯示出較高的靈敏度和良好的特異性；經ROC曲線分析，AUC分別為0.983、0.990和0.997，亦說明這3個蛋白均可以作為梅毒的診斷抗原使用；同時研究發現，Tp0971、Tp0768在一期梅毒和隱性梅毒檢測中的陽性檢出率分別為97%、95%和94%、96%，提示Tp0971、Tp0768在早期感染和潛伏感染診斷中有重要的意義。

1.2 Tp0134、Tp0470 Tp0134是一種編碼376個氨基酸，相對分子質量約40 kDa，與Tp0136、Tp0462等屬于同一家族的Tp假定蛋白。黃作良等[11]分析發現，Tp0134具有信號肽，可能是一種分泌蛋白，且具有多個抗原表位區。進一步研究發現，Tp0134具有感染依賴性抗原的特點，由于這類抗原和以往發現的梅毒診斷抗原存在一定的差異，故兩者的診斷性能也可能有著各自不同的特點。在后續相關實驗中，他們以Tp0134抗原包被液建立rTp0134-ELISA，檢測了468份臨床各期梅毒血清，其靈敏度為97.19%、特異性為96.85%；ROC曲線分析，AUC為0.911，提示Tp0134具有良好的抗原性，且具有較高的診斷價值，可以作為梅毒血清檢測的候選診斷抗原。

Tp0470全長1 110 bp，蛋白相對相對分子質量約40.7 kDa，是一種目前功能尚未知的TP假定蛋白。黃作良等[11]通過生物信息學及蛋白結構分析推測，Tp0470可能有信號肽，具有分泌蛋白的一些基本特性。由于Tp0470與活Tp感染后和滅活Tp接種后新西蘭兔血清反應性存在顯著差異，從而初步證實Tp0470是一種感染依賴性抗原。他們以Tp0470蛋白為包被抗原建立間接ELISA法，檢測了468份臨床各類血清，結果顯示，基于Tp0470蛋白建立的ELISA檢測結果的靈敏度為95.32%、特異性為95.66%，ROC曲線分析進一步提示Tp0470作為梅毒診斷靶標抗原的潛質。

1.3 Tp0693 Tp0693是一種可能存在于在Tp的外膜，結構及功能尚不明確的假定蛋白，相對分子質量約為50 kDa。生物信息學分析發現，TP0693具有信號肽和多個抗原表位，可能屬于外分泌蛋白。研究發現，Tp0693蛋白在各Tp致病菌株中均能穩定表達，與其他病原菌蛋白和人體自身蛋白同源性低。Zhang等[12]通過基因工程技術成功構建了pET30a/Tp0693 重組質粒，經免疫印跡鑒定，重組蛋白Tp0693與梅毒陽性血清有特異性免疫反應，具有良好的抗原性。在后續相關實驗中，以重組蛋白Tp0693為包被抗原建立間接ELISA法，檢測了201份各期梅毒血清標本、66份交叉血清標本和100份陰性血清標本。研究結果顯示，Tp0693與正常人血清和交叉血清不反應，而與各期梅毒患者血清可發生較強的免疫反應，提示該抗原有良好的特異性。基于重組Tp0693建立的間接ELISA方法特異性為100%、敏感性為91%,與金標準TPPA結果符合率高,但陽性結果的S/CO值與RPR滴度無相關性。經ROC曲線分析，AUC為0.990，提示Tp0693具有潛在的臨床診斷價值。

2 Tp黏附蛋白

黏附介導的微生物定植在病原微生物感染的起始階段發揮重要作用。Tp具有黏附到細胞外基質纖連蛋白的能力，能黏附到宿主多個組織器官，導致全身性播散。

2.1 Tp0155和Tp0483 Tp0155基因全長1 116 bp，編碼371個氨基酸。Bamford等[13]研究認為，Tp0155是一種包含前導肽、2個N端LysM結構域和M23肽酶序列的蛋白質，其中兩個N端LysM結構域可識別碳水化合物的聚合體，M23肽酶序列則能降解肽聚糖并顯示出酶活性。Tp0155和Tp0483是細胞外基質纖連蛋白的結合蛋白，兩者都能與纖連蛋白特異性結合。Tp0155優先與纖連蛋白的基質形式結合，而Tp0483則能同時與纖連蛋白的可溶性和基質形式結合，它們以不同的構象形式存在，在纖連蛋白基質組裝過程中，可暴露出隱藏表位。通過對Tp0483外膜蛋白的分析，Dickerson等[14]發現了在274～289和316～333氨基酸殘基之間有2個纖連蛋白結合區域。然而，Van Voorhis等[15]研究發現，基于rTp0155和rTp0483建立的ELISA方法檢測梅毒患者血清的總靈敏度均較低，分別為28%、42%。他們同時發現，這兩種蛋白僅在9%的梅毒患者血清出現陽性結果，而且這些陽性反應性血清均來自早期原發性感染的個體。

2.2 Tp0136 Tp0136全長1 488 bp，編碼495個氨基酸，相對分子質量為50 kDa，位于Tp外膜上。Brinkman等[16]發現，附著在宿主細胞外基質上的Tp0136具有結合纖連蛋白和層粘連蛋白的能力。最近的研究表明[17]，Tp0136通過其N端保守區能有效地黏附于細胞，甚至比血漿纖維連接蛋白的作用更為有效。在模擬感染試驗中，宿主對病原體的免疫應答的同時，Tp0136被高度轉錄，表明該蛋白可能在Tp的持久性免疫中發揮作用。同時，Brinkman等[16]發現，在Tp各亞種及菌株之間，Tp0136基因的開放閱讀框均存在不同程度的變異；依據基因的異質性，Tp0136可分SS14 和非SS14兩種亞型。這種分子生物學的分型方法既能提高基因分型的效率，又能用于Tp菌株的鑒別，對于區分梅毒的臨床分期、了解病情進展、判斷預后和治療方案的選擇均具有重要意義。因此，Tp0136的蛋白異質性對于梅毒的血清學診斷和預后判斷具有重要的臨床應用價值。

3 Tp鞭毛蛋白

鞭毛蛋白是細菌鞭毛的主要成分，是Tp菌體蛋白質的重要組成部分，對Tp在宿主體內的入侵和傳播具有重要意義。此外，Tp鞭毛蛋白作為一種經典的病原相關分子模式，能觸發固有免疫應答和適應性免疫應答。因此，這些蛋白被認為是疫苗以及免疫治療的有效佐劑。

3.1 Tp0463 Tp0463是新近發現的一種含110個氨基酸的Tp鞭毛蛋白。生物學信息分析表明，Tp0463含有數個較強的B細胞表位，因而推測其可能具有較強的抗原性和免疫原性。McKevitt等[7]研究表明，Tp0463重組蛋白能與各期Tp感染兔混合血清發生很強的免疫反應，而與正常兔血清不發生免疫反應，提示該抗原具有較高的特異性和敏感性。劉小軍[18]通過基因工程技術成功構建了pET28a+/Tp0463重組質粒，經免疫印跡鑒定，重組蛋白Tp0463與梅毒陽性血清有特異性免疫反應，具有良好的抗原性，而與梅毒陰性血清則不發生免疫反應。在后續實驗中，他們以Tp0463重組蛋白為診斷抗原建立的間接ELISA檢測各期梅毒患者以及健康對照人群共340份臨床血清標本；結果顯示，基于Tp0463蛋白建立的ELISA檢測結果的總靈敏度為87.7%、特異性為100%，其靈敏度低于TPPA法，差異有統計學意義，兩種方法總符合率為 95.0%。Jiang等[19]研究結果表明，鞭毛蛋白Tp0463對原發性和先天性梅毒IgM抗體的檢測表現出良好的檢測性能，其敏感性為92.6%、特異性97.9%、陽性預測值為99.4%、陰性預測值為77.5%。由此認為，Tp0463可作為一種新的梅毒篩查診斷標記物且對疫苗的研制具有極其重要的意義。

3.2 Tp0868、Tp0792、Tp0870 Tp0868(FlaB1，34.5 kDa)、Tp0792(FlaB2，33 kDa)和 Tp0870(FlaB3，31 kDa)以及包裹在核心蛋白外的鞘蛋白 Tp0249(FlaA)是具有代表性的鞭毛蛋白，這些蛋白促成了Tp獨特的螺旋狀運動方式。McGill等[20]發現，Tp0868、Tp0792和Tp0870和鞭毛動力蛋白Tp0400在梅毒的各個階段均具有強烈的血清反應性。對重組鞭毛蛋白的篩選顯示，FlaB1、FlaB2、FlaB3對IgG抗體的整體敏感性和特異性較高，分別為95.4%、98.9%和92.6%、95.8%和95.1%和95.8%。此外，FlaB1、FlaB2、FlaB3蛋白在原發性和先天性梅毒IgM抗體檢測中均表現出較好的靈敏度和特異性，其敏感性和特異性分別為76.8%、83.1%和72.0%、87.7%和74.4%、89.2%[19]。因此，FlaB1、FlaB2和FlaB3蛋白被納入梅毒血清診斷的候選新抗原組。

4 Tp膜脂蛋白

Tp膜脂蛋白多位于細胞內膜層，在Tp致病過程中與宿主黏附、定植、播散以及激發機體免疫反應密切相關，可能為Tp的主要致病因子；同時，Tp膜脂蛋白也是梅毒血清學診斷的敏感特異性指標。

4.1 Tp0821 Tp0821是近年來發現的一種基因全長807 bp，編碼268個氨基酸的位于細胞外膜的TP膜脂蛋白。Tp0821的晶體結構與胞質配體結合蛋白類似，與蛋氨酸轉運蛋白家族具有同源性，可能參與Tp蛋氨酸轉運。以Tp0821為診斷抗原建立的ELISA試驗結果顯示，IgM和IgG的相對陽性率分別為91.0%、98.3%。對30例萊姆病患者、5例鉤端螺旋體病患者和52例未感染者對照血清樣本進行交叉試驗時，其特異性分別為94.3%、100%，基于Tp0821的ELISA試驗與臨床常用的TPPA和化學發光免疫檢測(CIA)的結果具有良好的相關性[21]。這些實驗數據表明，Tp0821可作為梅毒血清學診斷的一種新的候選抗原，但是否能應用于臨床診斷需要進一步的驗證和確認。

4.2 Tp15、Tp17、Tp47 Tp15在內膜中含量相對較少，其基因全長426 bp,相對分子質量為15 kDa。米希婷[22]采用重組抗原Tp15、Tp17、Tp47對各期梅毒患者進行體液免疫反應的檢測，Tp15在各期梅毒中陽性檢出率相對較低(僅為64.7%)，表明其引起的早期體液免疫反應是有限的。但Tp15在血清固定型梅毒患者中表達明顯增強，其有可能是造成梅毒患者血清固定的因素之一。Tp17蛋白抗原在內膜中含量豐富，其基因全長468 bp,相對分子質量為17 kDa。米希婷[22]研究發現，與正常對照組相比較，各期梅毒對Tp17的免疫反應均有統計學差異，Tp17的陽性檢出率為100%，是陽性反應最高的抗原,提示Tp17是Tp中免疫原性較強的一種膜脂蛋白。Tp47膜脂蛋白在Tp膜蛋白中含量較高，其基因全長1 302 bp，相對分子質量為47 kDa。它可刺激血管內皮細胞合成細胞間黏附分子，并誘導病原體與細胞間的黏附。Lee等[23]的研究發現，Tp47能促進細胞黏附分子如血管細胞黏附分子1、細胞間黏附分子1和E選擇素等在皮膚微血管內皮細胞上的表達，從而調節T淋巴細胞結合人皮膚微血管內皮細胞，繼而黏附侵入宿主，并刺激免疫細胞產生免疫應答。

Tp15、Tp17、Tp47是重要的Tp膜脂蛋白，這些抗原已經成功地應用于梅毒血清學診斷試驗的建立，并在臨床上廣泛使用。早期梅毒的血清學診斷是基于單個重組抗原。Tp15、Tp17、Tp47獨立診斷的敏感性和特異性分別為100%、96%和100%、100%和100%、20%，2種或3種抗原的聯合檢測則可提高診斷的準確性[24]。目前，以TpN15-TpN17-TpN47重組蛋白嵌合抗原建立的 Tp-ELISA能有效降低假陽性率和假陰性率，有著更高的靈敏度、特異度和符合率。

5 Tp表面蛋白

Tp表面蛋白位于菌體外膜，與其他革蘭陰性細菌相比，Tp外膜上表面蛋白種類稀少。因最先暴露于免疫系統，表面蛋白是完整的Tp菌體中最重要的免疫靶點，同時在Tp的毒力中也發揮重要作用[25]。

5.1 Tp0326(Tp92) Tp0326基因全長2 562 bp，編碼853個氨基酸，相對分子質量為96 kDa，是目前已知的Tp外膜蛋白中惟一與革蘭陰性菌外膜蛋白具有序列同源性的蛋白。Tp0326 N端有5個多肽轉運相關結構域，C端有1個由18個β-折疊形成的具有雙親性的β-桶樣結構。Luthra等[26]研究顯示，在Tp細胞膜表面，含有大量桶形結構的外膜蛋白形成親水性的化學通道，便于營養物質進入細胞，同時排出代謝產物，從而滿足其自身新陳代謝及繁殖的物質需求。在完整的Tp中僅有Tp0326的桶形結構區域包含暴露的抗原表位。Brinkman等[8]研究發現，Tp0326具有血清反應性。然而，McGill等[20]的研究結果顯示，Tp0326與早期潛伏梅毒血清無反應性，也無免疫原性。這個現象可以解釋為，多肽轉運相關結構域和C端β-桶形結構位點的抗原變異，從而引起Tp蛋白組中Tp0326極低水平的表達?；谶@些研究成果，許多以Tp0326、Tp0453和Tp0326-Tp0453嵌合抗原為基礎的檢測方法和試劑盒不斷被研發，進而推進其臨床應用。

5.2 Tp0453 Tp0453基因全長 864 bp，編碼 287個氨基酸 ，相對分子質量為 31 kDa。Tp0453是一種新型的整合外膜蛋白，定位于Tp外膜的內表面，這種蛋白質擁有大量的折疊結構和兩性螺旋, 當人工加入雙層膜時，此蛋白進入膜中，膜的滲透性增強，表明其可能是一種孔蛋白[27]。Hazlett等[27]研究發現, Tp0453可能使Tp的外膜對營養物質具有通透性，而抗體則無法進入。Luthra等[28]研究發現，Tp0453包括5個穩定折疊兩性螺旋，這對于Tp0453與膜結合是至關重要的。基于結構動力學和結核分枝桿菌脂蛋白的比較數據，Tp0453被認為是外膜生物轉化過程中脂質和糖脂的載體。從而可推測，Tp0453 在Tp攝取營養物質、維持生命的過程中起了一定的作用。在McGill等[20]的研究中，Tp0453表現出中等強度的血清反應性，可與早期梅毒患者的血清反應。Van Voorhis等[15]研究發現，基于Tp0453蛋白建立的ELISA對梅毒患者血清有較好的血清反應性，其特異性和敏感性高，而且對復發性發熱、萊姆病或鉤端螺旋體病患者血清均呈陰性反應。莫小輝等[29]成功制備抗Tp0453重組蛋白的單克隆抗體，經間接免疫熒光分析，表明抗Tp0453抗體能識別Tp的天然蛋白結構，且與鉤端螺旋體無交叉反應。近年來，以Tp0453重組產物和嵌合的Tp0453-tp0326蛋白為診斷抗原的ELISA檢測方法不斷發展，Tp0453和Tp0453-tp0326嵌合體的敏感性可達98%、98%，特異性可達100%、99%[30]，因此，Tp0453有望作為Tp特異性血清學診斷的新候選抗原用于TP的大規模血清篩選。

重組蛋白技術為梅毒血清學診斷提供大量的高純度的重組蛋白，推動了血清學檢測的快速發展。但是，梅毒血清學篩查依然有許多問題亟待解決，如縮短梅毒檢測的窗口期，避免晚期梅毒患者由于免疫應答水平降低而出現的假陰性結果。因此，我們有必要尋找新型的Tp重組抗原應用于梅毒血清學診斷。以重組蛋白技術為基礎建立的Tp特異性血清學實驗顯著提高了梅毒的診斷水平，血清學試驗的敏感性和特異性均達到95%以上。但這些Tp抗原實驗無法區分既往感染與現癥感染，也不能用于療效判定、有無復發及再感染。目前，我們只能通過非Tp特異性血清學實驗，檢測反應素的滴度變化，來判定疾病的進程變化。然而，反應素并非Tp感染后特有，其在病毒性肝炎、類風濕關節炎及系統性紅斑狼瘡患者和老年人血清中皆可出現，從而引起假陽性結果。因此，拓展Tp重組抗原組合，提高各期梅毒的檢測的靈敏度和特異性，仍是多個學科包括分子生物學、微生物學和免疫學研究的共同目標。近年來，感染依賴性抗原篩選技術的興起，促進了病原體的診斷相關應用研究。雖然，目前關于Tp感染依賴性抗原的研究大多停留在實驗室階段，但對其深入研究可以為梅毒早期診斷及治療提供新的靶標，且為研發梅毒新型疫苗提供新的理論基礎和研究方向。