神經束蛋白155高表達少突膠質細胞模型的構建

胡斌，王成舉，陳鵬慧，張雨平

(1 陸軍軍醫大學第二附屬醫院，重慶400037；2 陸軍軍醫大學基礎醫學院)

腦白質損傷是早產兒特有的腦損傷形式之一。最嚴重的結局是早產兒腦室旁白質軟化,會造成腦癱、視聽功能異常、認知障礙等神經系統后遺癥。目前腦白質損傷的具體發生機制尚不明確。神經束蛋白155(neurofascin155，NF155)主要存在于膠質細胞中，是神經束蛋白(neurofascin，NF)家族成員之一，在中樞神經系統主要表達于少突膠質細胞及其前體細胞中[1]。NF155的表達始于髓鞘形成初期，在整個髓鞘形成期間持續高表達，隨著少突膠質細胞的發育逐漸成熟，NF155從胞體向細胞突起末端遷移，最終分布于成熟中樞神經系統的髓鞘結側區脂筏中[2]。研究[3,4]發現，NF155在髓鞘形成及損傷后的修復過程中起到重要作用，并且與多種自身免疫性脫髓鞘疾病中的髓鞘病變相關。我們前期研究[5]發現，缺氧缺血腦白質損傷早產模型大鼠腦組織中髓鞘量減少、軸突萎縮導致神經功能異常，與NF155的表達缺失有關，在缺氧缺血損傷早期補充NF155，很可能對腦白質損傷具有預防甚至修復作用。因此，NF155有可能成為腦白質損傷干預治療的一個新靶點。為此，2017年9月～2018年1月，我們構建了NF155高表達的少突膠質細胞模型，并驗證NF155的表達情況，為進一步研究NF155在髓鞘損傷及修復中的作用和機制提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 DNA純化回收試劑盒、質粒小提試劑盒、pUM-T simple vector克隆試劑盒、2×Taq PCR MasterMix購自BioTeke公司；PCR試劑盒、PCR產物回收試劑盒、β-actin購自碧云天生物技術研究所；NheⅠ、AgeⅠ限制性內切酶購自Fermetas公司；NF155抗體購自CST公司；細胞培養DMEM/F12培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；少突膠質細胞由本課題組取新生大鼠大腦皮層原代培養，新生SD大鼠購自陸軍軍醫大學實驗動物中心；感受態細菌E.colin DH5α、T4連接酶為實驗室留存；引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 NF155慢病毒載體質粒構建

1.2.1 目的基因及引物設計合成 從NCBI GenBank數據庫獲取NF155的DNA序列，引物序列設計如下，NF155上游引物5′-CAAGCTAGCATGGCCAGGCAGCAGGCGCCA-3′，NF155下游引物5′-CGCACCGGTTCAGGCCAGGGAATAGATGGC-3′，下劃線部分分別為NheⅠ、AgeⅠ限制性內切酶酶切位點。以目的片段為模板進行PCR擴增，反應體系如下，NF155上游引物和NF155下游引物各取1 μL，模板2 μL，2×Taq PCR MasterMix 10 μL，用ddH2O補足至20 μL；反應條件如下，95 ℃預變性5 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s 30個循環，72 ℃延伸5 min。

1.2.2 NF155慢病毒載體質粒的構建及鑒定 取NheⅠ、AgeⅠ雙酶切PCR產物和pUM-T simple vector克隆載體，用1 %瓊脂糖凝膠回收酶切產物，連接目的片段和載體片段，反應體系如下，載體片段1 μL，目的片段1 μL，T4 連接酶1 μL，buffer 5 μL，加ddH2O補足至10 μL；反應條件為22 ℃連接過夜。連接產物轉化DH5α感受態細胞，涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板，37 ℃培養20 h。挑選單克隆菌落接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養基中，37 ℃搖床震蕩培養過夜。抽提質粒送沈陽萬類生物科技有限公司測序。 NF155慢病毒載體質粒經NheⅠ、AgeⅠ雙酶切，1 %瓊脂糖凝膠電泳后可見兩條3 723、8 083 bp的片段，表明NF155與pUM-T simple載體連接成功。經沈陽萬類生物科技有限公司測序，與GeneBank中NF155的基因序列一致，表明NF155慢病毒載體質粒構建成功。

1.3 NF155慢病毒載體質粒轉染的少突膠質細胞NF155 mRNA及蛋白檢測

1.3.1 少突膠質細胞分組及NF155慢病毒載體質粒轉染方法 取對數生長期少突膠質細胞接種于6孔板中，用不含抗生素的無血清培養基于37 ℃、5 % CO2的孵箱中培養24 h。將細胞分為空白對照組、陰性慢病毒感染組、NF155慢病毒感染組。空白對照組不做任何處理，陰性慢病毒感染組給予10 μL空載體慢病毒+100 μL培養基，NF155慢病毒感染組給予10 μL慢病毒載體質粒+100 μL培養基。37 ℃、5 % CO2條件繼續培養12 h。

1.3.2 三組細胞NF155 mRNA檢測 采用熒光定量PCR法。取轉染后的少突膠質細胞提取總RNA，反轉錄合成cDNA，然后進行PCR擴增。反應體系如下，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，2×Taq PCR MasterMix 10 μL，SYBR Green 0.3 μL，用ddH2O補足至20 μL；反應條件如下，94 ℃預變性5 min，94 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s 40個循環，72 ℃ 150 s，40 ℃ 90 s，60 ℃-94 ℃每1 ℃ 1 s，25 ℃ 120 s。以2-ΔΔCt代表CG5844基因的相對表達量，重復3次，取平均值。

1.3.3 三組細胞NF155蛋白檢測 采用Western blotting法。收集轉染72 h后的細胞時，先用預冷的PBS緩沖液清洗三次，加入含0.4 %蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，冰浴30 min后用細胞刮輕輕刮下細胞，移至離心管中，于4 ℃、14 000 r/min離心15 min收集上清。加入0.2倍體積的6×上樣buffer，100 ℃沸水煮5 min，上樣于SDS-PAGE。經電泳、轉膜后于5 %脫脂牛奶中封閉2 h。滴加相應的NF155抗體、β-actin抗體，4 ℃搖床孵育過夜。然后，用TBST清洗8 min×3次后，滴加辣根過氧化酶標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG，室溫孵育1 h。用TBST清洗8 min×3次后，將發光液A液和B液按1∶1混合均勻后滴加于PVDF膜表面，Quantity One曝光。以目的條帶灰度值與β-actin灰度值代表NF155蛋白的相對表達量，重復3次，取平均值。

2 結果

NF155慢病毒感染組、空白對照組、陰性慢病毒感染組NF155 mRNA相對表達量分別為3.25±0.11、1.00±0.06、1.08±0.01，與空白對照組、陰性慢病毒感染組比較，NF155慢病毒感染組NF155 mRNA相對表達量升高(P均<0.05)。

NF155慢病毒感染組、空白對照組、陰性慢病毒感染組NF155 蛋白相對表達量分別為1.57±0.08、0.51±0.12、0.50±0.06，與空白對照組、陰性慢病毒感染組比較，NF155慢病毒感染組NF155蛋白相對表達量升高(P均<0.05)。

3 討論

神經元軸突的髓鞘化完成標志著神經發育成熟。髓鞘的生理功能主要體現在對神經元軸突的保護和絕緣作用，并在此基礎上確保神經沖動通過跳躍式傳導而高速傳遞[6]。然而在腦白質損傷中，由于髓鞘損傷或發育不良，使其生理功能完全或部分喪失，導致一系列病理生理改變。腦白質損傷引起的神經纖維脫髓鞘包括了原發性脫髓鞘和繼發性脫髓鞘，諸如多發性硬化(multiple sclerosis，MS)和腦白質營養不良的原發性脫髓鞘病變多由免疫介導的變態反應或因遺傳因素所引起；而繼發性脫髓鞘病變則是由于感染、中毒、外傷、腫瘤等因素所引起；這些病變的發生與髓鞘的穩定性、抗原性等特性密切相關，而主要取決于髓鞘結構中的一些重要的黏附分子[7～9]。

神經束蛋白是Rathjen等[10]1987年在雞的體內發現的一種參與神經束形成的細胞表面蛋白，其結構包括6個Ig結構域、5個NFIII樣結構域、1個跨膜結構域和1個胞質結構域，這種結構與免疫球蛋白超家族(IgSF)的成員極其相似，如神經細胞黏附分子L1和類L1同源物、NgCAM相關黏附分子(NrCAM)[11]。目前在人類和各類動物的神經系統中，發現有NF140、NF155、NF166、NF180和NF186等5種不同的神經束蛋白多肽類型[12,13]，它們的表達受到時間和空間的調控，既可在胚胎或成體中表達，又可在神經元或膠質細胞中表達，或獨立、或與細胞內外不同的蛋白相互作用影響著不同的細胞進程[14]。NF166和NF180都只在未成熟的神經元中表達，主要功能是選擇性地調節神經軸突的生長，Lustig等[15]研究證明NF166和NF180在軸突起始段和郎飛結處高度富集，聯合Na+通道，共同作用于軸突電位和信號傳導的啟動過程；隨著大腦發育的成熟，NF186的表達逐漸占據主導地位，其功能主要是通過干擾并減少軸突起始段的突觸數量而使神經元保持穩定，Feinberg等[16]的研究表明NF186作用于Na+通道無髓鞘節段的β1和β3亞基聚集處，直接影響髓鞘郎飛結結側區的信號傳導，在神經纖維的神經膠質和神經元跳躍式傳導過程中發揮著獨特作用；NF140是2017年Dolmont等在慢性炎性脫髓鞘神經病(CIDP)患者血清中新發現的一種神經束蛋白多肽亞型，其結構與生物學功能尚待進一步的研究[12]；本研究構建的神經束蛋白多肽亞型NF155，在結構方面通過微外顯子的排他表達區別于其他神經束蛋白亞型[17]。NF155的生物學功能一方面表現在軸突起始段的形成早期發揮著重要的作用，Pomicter等[18]研究發現NF155表達缺失可造成軸突起始段形成障礙而導致小鼠表現出明顯的共濟失調和神經傳導速度下降；另一方面，NF155在髓鞘結構的形成和損傷后的修復過程中起到關鍵作用，Sherman等[19]研究發現NF155能招募和聚集caspr、contactin，在結側區形成復合物維持髓鞘結構的穩定，在caspr-/-和contactin-/-小鼠中，NF155尚且能在結側區聚集，但在NF155-/-小鼠中，盡管caspr和contactin總量未減少，但卻無法聚集于結側區；Mathey等[20]研究亦發現NF155對髓鞘損傷后的修復功能可以作為治療自身抗體介導的軸突損傷新靶點。NF155在中樞神經系統髓鞘的發育、穩定及修復中均發揮著重要作用。

隨著分子生物學技術的發展，目前應用于目的基因轉染的病毒載體主要包括腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒和慢病毒載體[21]。慢病毒載體是逆轉錄病毒的一個亞型，它有著更廣泛的宿主，對分裂期及非分裂期細胞均具有感染能力，對于一些較難轉染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞，可極大提高目的基因的轉染效率，且載體容量大，可攜帶并整合進入宿主細胞的目的基因對抗轉錄沉默作用，在靶細胞中得到持續高效穩定的表達，此外慢病毒載體中還可以插入組織細胞特異性的啟動子和增強子，提高轉入基因的轉錄靶向性，使慢病毒載體中的目的基因在特定的組織細胞中表達，基于上述諸多優點，慢病毒載體被廣泛應用于細胞生物學、分子生物學以及疾病的基因治療等方面的研究中[22]。

本研究成功構建了NF155慢病毒表達載體，經過酶切鑒定達到預期效果。為了進一步驗證構建的NF155慢病毒表達載體在過表達NF155方面的有效性，我們用重組的NF155慢病毒表達載體感染了少突膠質細胞，相較于空白對照組和陰性慢病毒感染組，NF155慢病毒感染組細胞中NF155 mRNA及其蛋白表達量均增高，進一步證實NF155高表達瞬轉細胞模型的成功建立。這一研究結果將為進一步研究NF155對腦白質損傷髓鞘形成及損傷修復等病理生理過程的影響，探究NF155在腦白質損傷髓鞘形成及修復中的作用和機制奠定了實驗基礎。