線栓插入深度對改良線栓法制備小鼠腦缺血模型穩定性及安全性的影響

莊麗華，孔營楠，楊爍慧，龔志剛，詹松華，劉孟瀟，張中帥

(1上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海201203；2西門子醫療系統有限公司上海分部)

目前我國缺血性腦梗死發病率高，約占其他類型腦梗死的66.4%[1]。缺血性腦梗死已成為全世界首位死亡原因，具有發病率高、病死率高和致殘率高的特點[2，3]。大腦中動脈栓塞模型為研究腦缺血疾病的重要模型，其主要造模方法為線栓法。相關研究多使用大鼠造模，但大鼠不能滿足腦缺血疾病基因水平的研究。隨著基因工程技術的發展，小鼠和基因工程小鼠已經成為目前研究的熱點[4，5]。建立穩定的小鼠腦缺血模型，并創立準確無創的模型評價體系，是目前研究的關鍵。過去常用TTC染色法來判定模型小鼠腦缺血范圍，但該方法無法對活體小鼠進行觀察[6～9]。隨著醫學影像學技術的發展，可利用磁共振掃描技術對小鼠進行活體多層面成像檢查[10～14]。2017年10月～2018年4月，本研究用改良線栓構建小鼠腦缺血模型，觀察線栓插入深度對模型穩定性及安全性的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 成年SPF級C57/BL6n小鼠40只，雄性，體質量20～25 g，購自維通利華實驗動物有限公司，SCXK(浙)2018-0001，飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心，溫度18～28 ℃，晝夜溫差<3 ℃，相對濕度40%～70%。適應性飼養1周，術前12 h禁食不禁水。青霉素鈉粉針劑，購自上海上藥新亞藥業有限公司，水合氯醛購自上海國藥集團化學試劑有限公司。線栓購自北京西濃科技有限公司，直徑0.16 mm，頭部直徑(0.2±0.1)mm，線長3.5 cm，距離頭端10 mm處有黑色標記，并于標記處前后1 mm處加兩個標記。磁共振掃描儀(西門子Skyra3.0T)、8通道橫向放置小鼠專用線圈(上海辰光醫療科技股份有限公司，編號5000049101/序列號001006)。

1.2 動物分組及腦缺血模型制備 將40只小鼠采用隨機數字表法分為A、B、C、D組，每組10只。將小鼠稱質量后用4%水合氯醛溶液按0.1 mL/10 g腹腔注射麻醉，將其仰臥位固定于泡沫紙板上，乙醇擦拭頸部消毒，用眼科鑷在頸部正中剪1 cm左右切口，鈍性分離下頜下腺，用玻璃分針游離胸骨舌骨肌及二腹肌之間的頸動脈鞘，分離頸總動脈和迷走神經，在頸總動脈上掛線，并繼續向前剝離分出頸外動脈，將頸外動脈和頸總動脈結扎。將線栓插入0.4 mm注射器針頭，針頭經頸總動脈近心端靠近結扎處插入，推入線栓，退出針頭，繼續往前推送線栓。B、C、D組線栓頭端距頸總動脈分叉處距離分別為9、10、11 mm，標記點到達頸總動脈分叉時停止，固定頸總動脈及其內線栓，剪減掉多余部分線栓及線頭。沖洗創面并縫合皮膚，將小鼠置于保溫棉墊上，待其蘇醒后單籠飼養。A組為假手術組，分離步驟同B、C、D組，分離出頸總動脈、頸外動脈后用手術線結扎，不插入線栓。各組術后均腹腔注射4萬U青霉素鈉溶液。

1.3 小鼠神經行為判定標準 分別于小鼠完全清醒后(術后)、磁共振掃描前采用Longa′s神經功能評分評價其神經功能。Longa′s神經功能評分0分：無明顯神經功能缺損癥狀；1分：垂直提尾時不能伸展對側前爪；2分：行走時向偏癱側轉圈；3分：行走時身體向偏癱側傾倒；4分：不能自發行走，意識喪失；5分：死亡。

1.4 磁共振掃描及腦梗死范圍測算 造模24 h，采用4%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，將其置于8通道橫向放置小鼠專用線圈中央，采取俯臥位固定，用西門子Skyra3.0T磁共振儀進行掃描，T1WI、T2WI采用快速自旋回波序列掃描，DWI采用梯度回波掃描。參數設置如下：T1WI TSE-TRA脈沖序列重復時間(TR)500 ms，回波時間(TE)13 ms，翻轉角131°，視野60 mm×48 mm，帶寬244 Hz/Px，激勵次數3，矩陣256×256，層數8層，掃描時間167 s；T1WI TSE-COR，TR 761 ms，TE 13 ms，翻轉角131°，視野60 mm×36 mm，帶寬244 Hz/Px，激勵次數4，矩陣256×256，層數10層，掃描時間171 s；T2WI TSE-TRA，TR 3800 ms，TE 80 ms，翻轉角150°，視野60 mm×48 mm，帶寬260 Hz/Px，激勵次數2，矩陣256×256，層數8層，掃描時間179 s；T2WI TSE-COR，TR 3800 ms，TE 80 ms，翻轉角150°，視野60 mm×36 mm，帶寬260 Hz/Px，激勵次數4，矩陣256×256，層數10層，掃描時間171 s。因磁共振掃描小鼠冠狀位層面多于橫斷位層面，故從冠狀位層面計算腦梗死體積。采用Image pro plus6.0軟件計算小鼠每個層面腦梗死面積，梗死面積×層厚為腦梗死體積，腦梗死體積占全腦總體積的百分比即為腦梗死范圍。

2 結果

2.1 各組造模情況 術后24 h磁共振掃描前，A組無死亡；B組存活9只，因腦疝死亡1只，造模成功6只；C組存活8只，因嚴重腦水腫死亡1只、原因不明死亡1只，造模成功7只；D組存活5只，因腦出血死亡3只、嚴重腦水腫死亡2只，造模成功4只。

2.2 各組存活小鼠術后及磁共振掃描前神經功能比較 A、B、C、D組存活小鼠術后Longa′s神經功能評分分別為0、1、2、2分；磁共振掃描前分別為0、1、3、2分。術后C、D組Longa′s神經功能評分高于A組,但差異無統計學意義(P均>0.05)；B組高于A組，低于C、D組，但差異均無統計學意義(P均>0.05)。磁共振掃描前C組Longa′s神經功能評分高于A組,但差異無統計學意義(P>0.05)；B、D組高于A組，低于C組，但差異均無統計學意義(P均>0.05)。

2.3 各組磁共振掃描結果及腦梗死范圍比較 磁共振掃描結果顯示,A組T1WI及T2WI無明顯信號改變，B、C、D組分別有3、1、1只無明顯信號改變，其他均出現不同程度的T2WI高信號區域。B、C、D組腦梗死范圍分別為(17.13±8.32)%、(26.63±5.76)%、(27.52±5.81)%。C、D組腦梗死范圍大于B組(P均<0.05)，C組腦梗死范圍與D組相當(P>0.05)。

3 討論

1986年Koizumi等[15]首次通過頸總動脈開口插入線栓制備大腦中動脈閉塞腦缺血模型。Longa等[16]在Koizumi的基礎上進行改進，通過頸外動脈開口制備大鼠可逆性腦栓塞模型。線栓法的優點在于術中對血壓、體溫、血生化等影響小，避免開顱對顱內環境的影響；穩定性強，重復性好，可進行缺血再灌注相關研究，應用頗為廣泛[17～20]。但該方法操作復雜，要求操作者動作精細準確，否則極易發生出血及血管痙攣等并發癥，同時存在諸多影響因素，需后續研究不斷改進與完善。

本研究制備永久性腦缺血模型，選用操作相對簡單的頸總動脈進栓，重在探究線栓插入深度對成模率及安全性的影響。預實驗發現小鼠頸內動脈解剖位置較深，難以分離，強制分離極易導致血管斷裂，而頸外動脈可見部分短，難以像大鼠一樣從頸外開口處置入線栓。因此，本研究在分離出頸總動脈及頸外動脈后，采用1 mL注射器針頭牽引線栓從頸總動脈直接插入頸內動脈，可降低頸總動脈斷裂的概率，且縮短了線栓插入時間，減少了出血量。由于小鼠體質量小，血管細，血管韌性及彈性不如大鼠，成模率低。除去操作因素，造模時線栓頭端插入深度是小鼠腦缺血造模成功率的重要影響因素。如線栓頭端插入過淺，未能阻斷血流則不會發生梗死；如插入過深，則會導致出血，小鼠發生神經功能缺損甚至死亡。本研究結果顯示，線栓頭端距頸總動脈分叉處10 mm時安全性及成模率較高。線栓頭端距頸總動脈分叉處距離為9 mm時，部分存活小鼠未發現信號改變區域，說明未形成梗死灶，即造模失敗。當線栓頭端距頸總動脈分叉處距離為11 mm時，小鼠死亡率升高。

本研究觀察術后各組神經功能評分，以初步觀察造模是否成功。各模型組發生不同程度神經功能缺損，說明線栓到達了大腦中動脈起始部。磁共振掃描前各組神經功能評分較術后略低，但差異無統計學意義，說明從術后到磁共振掃描期間模型組神經功能自我恢復并不明顯。有研究采用以上方法造模后1周內模型的神經功能評分與腦梗死體積不會自行恢復，而1周后才會大幅度恢復[21]。磁共振掃描前線栓插入10 mm與11 mm的小鼠神經功能評分高于插入9 mm的小鼠，說明插入9 mm深度不夠，未能完全阻塞大腦中動脈。

磁共振掃描技術在臨床廣泛用于腦缺血的診斷[22,23]。在梗死急性期，DWI為高信號，T2WI或FLAIR像出現高信號；亞急性期時可見T1呈低信號。本研究結果顯示，梗死區域T1WI信號降低不明顯，T2WI及DWI明顯高信號。本研究使用8通道橫向放置小鼠線圈掃描，圖像質量佳，病灶顯示清晰，可準確判斷梗死灶及梗死范圍。部分小鼠無行為學損傷表現，但磁共振掃描T2WI有大片高信號區域。說明小鼠行為學評分對梗死的判斷不如磁共振掃描靈敏。本研究發現，線栓插入10、11 mm時，腦梗死范圍大于插入9 mm；插入10 mm與11 mm時梗死部位穩定，范圍較為一致。但插入11 mm時小鼠死亡率達50%。通過解剖死亡小鼠發現，部分小鼠大腦中動脈被插破，部分小鼠因出血而發生神經功能缺損。死亡和行為學表現均因出血所致，可見插入11 mm的深度易導致出血。

總之，線栓法是制作小鼠腦缺血模型的可靠方法。小鼠腦缺血模型制作難度大，進線深度起決定性作用，過淺或過深均會影響腦缺血模型的安全性及穩定性，對實驗結果造成影響。通過對插線深度的改良，制作較為穩定的小鼠腦缺血模型。線栓插入深度為10 mm時安全性及成模率較高。但本研究也存在不足，各組小鼠樣本量少，需加大樣本量對結論進行驗證；另外，本研究僅對20～25 g的小鼠進行觀察，其他品系及體質量小鼠的適宜插入深度則需進一步研究。盡管本研究得出了適宜插入深度，但由于小鼠大腦中動脈直徑及頸總動脈分叉至大腦中動脈距離存在個體差異，因此在造模過程中操作人員的“手感”和熟練度起重要作用。