全氟己烷磺酸暴露影響小鼠腸道菌群組成的初步研究

張興桃,王海潮,徐禮生,章志遠(yuǎn)

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,安徽宿州,234000

全氟己烷磺酸(Perfluorohexane sulfonate,PFHxS)屬于一種全氟化合物，具有疏油、疏水和極低表面張力等特殊理化性質(zhì)，廣泛應(yīng)用于日用品的制造，如食品包裝物、不粘炊具等[1]。近年來，隨著人們環(huán)保意識(shí)的的提高，有關(guān)PFHxS毒理的研究受到了越來越多的關(guān)注。已有研究表明PFHxS是自然界中存在于人體代謝周期最長(zhǎng)的全氟化合物質(zhì)，且已在人血清，精液和母乳中檢出，濃度有逐年增高的趨勢(shì)，因此對(duì)人類存在潛在健康風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。PFHxS具有一定的發(fā)育神經(jīng)毒性和肝臟毒性[4]， Iwa Lee等發(fā)現(xiàn)初生小鼠PFHxS暴露后對(duì)腦神經(jīng)蛋白發(fā)育產(chǎn)生了不利影響[5]；Henrik Viberg等發(fā)現(xiàn)PFHxS暴露與小鼠行為與認(rèn)知功能紊亂相關(guān)[6]；Youn 等則揭示PFHxS暴露后激活ERK1/2介導(dǎo)的信號(hào)通路，誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[7]。

腸道菌群的變化與機(jī)體功能紊亂存在一定的相關(guān)性，已成為當(dāng)前生物學(xué)研究熱點(diǎn)之一，也是某些特定疾病研究的突破口[8]。腸道菌群是機(jī)體腸道的重要組成部分，與人體健康、疾病發(fā)生等密切相關(guān)[9]。王麗鳳研究發(fā)現(xiàn)腸道中微生物的變化和糞便菌群構(gòu)成顯著相關(guān)，因此研究糞便菌群，可為研究解腸道菌群提供便利[10]。而培養(yǎng)基培養(yǎng)等傳統(tǒng)的研究方法等局限于某些特定微生物，低估了菌群的數(shù)量和多樣性，不能充分反映腸道菌群的變化[11]。目前，分子生物技術(shù)如變性梯度凝膠電泳、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、克隆文庫(kù)構(gòu)建等已經(jīng)廣泛運(yùn)用到微生物群落分析中。高通量測(cè)序技術(shù)具有準(zhǔn)確定量、實(shí)時(shí)檢測(cè)等較為明顯的優(yōu)勢(shì)[12]，已廣泛應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究。本研究采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析技術(shù)分析測(cè)序數(shù)據(jù)，旨在分析PFHxS暴露對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成、菌群多樣性和豐度等變化，探索PFHxS暴露下小鼠腸道菌群的組成變化，探究腸道菌群改變與機(jī)體特定功能紊亂之間的關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器

1.1.1 材 料

SPF級(jí)Balb/c小鼠(購(gòu)自上海思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)、鼠糧、墊料等購(gòu)于南京青龍山動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)；PFHxS(Sigma-Adrich,>98.5%)；FastDNA? Spin Kit for Soil(MP Biomedicals，USA) 。

1.1.2 主要儀器

PCR儀(T100,Bio-RAD)、熒光化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(FluorChem HD2,Alfa)、超微量分光光度計(jì)(NanoDrop2000,NanoDrop)、高速冷凍離心機(jī)(1-15K,Sigma)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠馴化、染毒處理

SPF級(jí)Balb/c 小鼠40只，5周齡，體重18～22 g，室溫 維 持 (22±2) ℃，相對(duì)濕度為40%～60%，12 h晝夜循環(huán)，自由飲水和采食，提供Milli-Q純水和清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)鼠糧，暴露前馴化7 d。實(shí)驗(yàn)分4組，即對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，每組小鼠10只，分籠飼養(yǎng)，每天稱重后計(jì)算暴露量。實(shí)驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ灌胃暴露劑量分別為PFHxS 0.02 mg/Kg·d-1，0.1 mg/Kg·d-1，1.0 mg/Kg·d-1；對(duì)照組灌胃暴露同體積去離子水，連續(xù)暴露28 d。

1.2.2 小鼠糞便的收集

暴露28 d后，收集各組小鼠新鮮糞便，放置于干燥無菌的PP離心管中， 保存于-20℃冰箱。

1.2.3 總DNA提取

采用Soil DNA Kit試劑盒提取各組小鼠糞便中菌群的總DNA，超顯微紫外分光光度計(jì)法測(cè)定DNA 濃度與純度，確定提取的DNA質(zhì)量，DNA樣品放置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.4 Illumina MiSeq測(cè)序和生物信息學(xué)分析

設(shè)計(jì)帶有barcode擴(kuò)增16S rDNA V3-V4的特異引物， PCR特異擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，送往江蘇中宜金大分析檢測(cè)公司進(jìn)行MiSeq測(cè)序。測(cè)序得到的Raw Data利用Mothur軟件進(jìn)行DNA序列拆分處理；利用Qiime軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接與初步降噪；通過Mothur軟件去嵌合體等步驟后，得到fasta格式序列文件即有效數(shù)據(jù)，劃分OTU (Operational Taxonomic Unit)；將數(shù)據(jù)上傳至RDP數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)，利用RDP下的細(xì)菌功能模型，對(duì)樣品序列進(jìn)行物種分類學(xué)分析，計(jì)算出樣品的稀釋性曲線(Rarefaction curves)，豐富度指數(shù)(Chao1指數(shù))、多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù))、覆蓋率指數(shù)(Coverage指數(shù))等。

2 結(jié)果與分析

2.1 PFHxS暴露造成的小鼠體重的變化

在暴露的0～21 d中， PFHxS對(duì)小鼠體重的影響不明顯。21 d后，最高濃度組小鼠體重出現(xiàn)下降的趨勢(shì)；28 d后，最高濃度組的小鼠體重與對(duì)照組相比產(chǎn)生顯著差異(p<0.05)；而其他暴露劑量組與對(duì)照組相比，在28 d的暴露周期中均沒有表現(xiàn)出顯著體重差異(圖1)。

圖1 PFHxS暴露造成的小鼠體重變化

2.2 腸道菌群多樣性分析

通過Qiime軟件計(jì)算樣品的OTU(Operational Taxonomic Unit)數(shù)量 (相似水平97%以上),并利用OUT值用來衡量樣品物種的豐度。測(cè)序數(shù)據(jù)的 Coverage值(測(cè)序深度，即覆蓋率)均高于0.899以上，對(duì)照組在0.89以上，表明樣品的測(cè)序深度滿足分析要求。暴露后各組小鼠的腸道菌群的數(shù)均增加，實(shí)驗(yàn)Ⅱ組樣品OTU數(shù)量最高，為1 087 (表1)。但Alpha多樣性分析表明，暴露組小鼠腸道菌群的多樣性低于空白對(duì)照組，但 PFHxS暴露濃度越高腸道菌群的多樣性越低；Shannon指數(shù)越大表示群落多樣性越高，4組樣品中空白對(duì)照組的Shannon值較大為6.43， PFHxS濃度組次之，中、高濃度暴露組Shannon值均在3.36～4.41之間。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Chaol值和Shannon指數(shù)差異均顯著(p<0.05)。

表1 各組樣品腸道菌群多樣性分析

注：*P<0.1,**P<0.05。

2.3 腸道菌群構(gòu)成分析

分析樣品群落結(jié)構(gòu)(圖2)，結(jié)果表明門水平4組樣品的菌群組成以擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria) 3個(gè)門為主，所占比例高于90%。其中，厚壁菌門(Firmicutes)在所有樣品中所占比例相近，占全部菌群的25%～30%；擬桿菌門(Bacteroidetes)對(duì)照組比例最低，為44.7%，暴露組比例均增加，分別達(dá)57.6%、52.4%、53.4%；變形菌門(Proteobacteria) 對(duì)照組比例最高，占18.4%，暴露組分別降低了5.37%、12.4%、9.97%；同時(shí)，PFHxS暴露也影響放線菌門(Actinobacteria)、柔壁菌門(Tenericutes)的豐度，但與對(duì)照組相比差異不顯著。

圖2 小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)圖(在門分類水平上)

在屬水平上，對(duì)照組中的菌群主要有普氏菌屬(Prevotella)、桿菌屬(Odoribacter)、擬桿菌屬(Parabacteroides)、類桿菌屬(Bacteroides)等多個(gè)屬，其中普氏菌屬占菌群總量36.8%，4屬菌群約占總量的79.3%(表2)。

表2 腸道菌群在屬水平上的物種豐度

PFHxS暴露處理后，屬水平菌群組成比例發(fā)生了明顯改變，其中Prevotella比例對(duì)照組為25%，最高暴露組為51%，但中、低劑量組均未檢測(cè)到；Bacteroides、乳酸桿菌屬比例均隨暴露劑量增加而增加，最大暴露劑量組為28.1%；Lactobacillus最大暴露劑量組為8.1%；Lactobacillus、Prevotella和Bacteroides都與機(jī)體糖脂代謝有關(guān)，其菌群比例的改變可能與機(jī)體糖脂代謝功能紊亂存在一定的聯(lián)系(圖3)。

圖3 樣品在屬分類水平上豐度的熱圖

通過高通量分析小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，揭示PFHxS暴露對(duì)小鼠腸道菌群的影響。選取瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、Lactobacillus、Parabacteroides、Bacteroides、Prevotella等 5種與糖脂代謝相關(guān)的細(xì)菌，通過PFHxS暴露前后豐度的變化，初步分析PFHxS暴露下小鼠糖脂代謝功能紊亂與腸道菌群變化的關(guān)聯(lián)性。暴露后，Bacteroides、Prevotella豐度變化明顯，Lactobacillus高濃度暴露組與對(duì)照組差異明顯(圖4)，初步表明PFHxS暴露可能會(huì)造成糖脂代謝功能紊亂。

圖4 糖脂代謝有關(guān)的菌群豐度分布

3 結(jié) 論

本研究表明擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門為小鼠腸道的主要菌群；經(jīng)PFHxS暴露的小鼠腸道菌群的多樣性明顯高于空白對(duì)照組，最高暴露組OTU數(shù)量最高，為1 087。在門的水平上，Bacteroidetes、Firmicutes和Proteobacteria等為腸道優(yōu)勢(shì)菌群，占比達(dá)90%以上；其中擬桿菌門在空白對(duì)照組中所占比例最低，隨著PFHxS暴露劑量的提高呈上升趨勢(shì)。對(duì)照組的腸道菌群主要包含Prevotella、Odoribacter、Parabacteroides、Bacteroides等多個(gè)屬，但 PFHxS暴露處理后，屬水平上小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變，其中Prevotella對(duì)照組為25%，最高暴露組增加到51%，但中、低劑量組均未檢測(cè)到；Bacteroides、Lactobacillus比例均隨暴露劑量增加而增加，Bacteroides最大暴露劑量組最高，為28.1%；Lactobacillus最大暴露劑量組為8.1%。