大豆多糖顆粒劑的制備及對草酸鈣晶體生長調控的研究＊

肖治均，張特，潘婷婷

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大豆多糖顆粒劑的制備及對草酸鈣晶體生長調控的研究＊

肖治均，張特，潘婷婷

（商洛學院 生物醫藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000）

以大豆為原料提取大豆多糖（SPS），并以此為主要成分制備大豆多糖顆粒茶，擬開發出能夠用于防治泌尿系結石新制劑。通過多糖含量測定試驗、溶化性試驗、粒度試驗、水分測定試驗對大豆多糖顆粒劑進行質量評價。體外考察了多糖顆粒劑抑制草酸鈣結晶活性，著重考察了影響草酸鈣成核、生長和聚集過程中的關鍵指標，即最大誘導時間、成核抑制率和聚集抑制率。結果表明，和對照組相比，成核速率在0.466×10-3/min左右、聚集速率在0.108×10-3/min左右，最大誘導時間在15.33 min左右，成核速率和聚集速率均下降，且最大誘導時間增加，成核抑制率和聚集抑制率分別達到77.78%和72.91%，抑制效果明顯。

大豆多糖；大豆多糖顆粒茶；生長調控；紫外分光光度法

1 引言

泌尿系統結石是世界范圍內的常見病，且其發病率呈上升趨勢。歐美國家5～10年內該病的復發率為40%～50%，在中國則高于75%.草酸鈣（CaOxa）是尿結石中主要的結石晶體，約占70%.而存在于尿液中的某些有機大分子，會在尿結石的形成過程中起到抑制或促進作用。這些大分子不僅與尿結石形成與否密切相關，而且在結石鹽成核、生長、聚集和固相轉化過程中發揮著至關重要的作用[1-3]。

生物大分子酸性粘多糖（GAGs）是目前研究較多的一類CaOxa結石抑制物。利用從天然產物中提取的多糖來抑制尿結石形成的研究日趨深入，張朝燕等對富含硫酸基的草葉馬尾藻多糖的防石活性進行了研究，結果表明SGP對草酸鈣的成核、聚集抑制率分別為69.2%、76.8%；王淼等人的研究也表明降解海藻多糖不僅可以抑制晶體的生長和聚集，而且可以誘導與尿路細胞粘附力較弱的晶體生物形成，從而減少草酸鈣晶體的生成。

大豆多糖（SPS）是從大豆中提取精制的水溶性多糖，具有抗氧化、抑菌、調節免疫活性等生物學功能。分子結構類似球狀體，黏性較低，具有分散性、穩定性、乳化性和黏著性等特點，其分子結構與尿液中存在的尿石鹽抑制劑葡氨聚糖（GAGs）較為相似，可以清除羥基自由基，這使得SPS極有可能成為一種潛在的外源性綠色防石藥物。

本文將大豆作為原料提取大豆多糖（SPS），并以此為主要成分制備大豆多糖顆粒，擬開發出能夠用于防治泌尿系結石新制劑[4-9]。鑒于體內對泌尿系統結石的研究較為困難，該類研究目前都是在體外進行模擬研究，以此揭示尿石形成機理。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

2.1.1 實驗試劑

大豆（陜西田源農業發展有限公司），草酸鈉（天津市河東區紅巖試劑廠），無水乙酸鈉，無水氯化鈣，氯化鈉，苯酚，硫酸，三氯乙酸，蔗糖，糊精（天津市科密歐化學試劑有限公司），乙醚（天津市化學試劑有限公司），丙酮，無水乙醇，95%乙醇（利安隆博華醫藥化學有限公司），三氯甲烷（利安隆博華醫藥化學有限公司），正丁醇（天津市化學試劑六廠）。

2.1.2 實驗儀器

電熱恒溫水浴鍋HH-S6（北京科偉永興儀器有限公司），電熱恒溫鼓風干燥箱DHG-9123A（上海齊欣科學儀器有限公司），電子分析天平SI-2002（上海齊欣科學儀器廠），紫外-可見分光光度計UV-1780（島津（中國）有限公司），離心機TD5A（湖南凱達科學儀器有限公司），冰箱BCD-228UTMA（合肥美的榮事達電冰箱有限公司），超純水機ULUPUPE-H（四川優普超純科技有限公司），高速中藥粉碎機XFB-200（吉首市忠誠制藥機械廠），循環水真空泵SHZ-III（鞏義市予華儀器責任有限公司），旋轉蒸發儀RE-52（北京科偉永興儀器有限公司），藥典篩GB/T6003.1—1997（新鄉市同心機械責任有限公司），超聲波清洗機KQ5200E（昆山市超聲儀器有限公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 多糖標準曲線的繪制

2.2.1.1 對照品溶液的制備

取適量葡萄糖對照品于105 ℃干燥至恒重，從中精密稱取50 mg置于500 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解定容，配制質量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖對照品溶液。

2.2.1.2 標準曲線的制備

分別精密量取葡萄糖對照品溶液0 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL于10 mL容量瓶中，蒸餾水定容至10 mL。從中量取1.0 mL的溶液，加入質量分數為6%的苯酚溶液1 mL混勻，迅速加入5 mL濃硫酸，靜置10 min，搖勻，于30 ℃水浴中放置30 min，以0.0 mL為空白對照，于490 nm處測定不同濃度下的吸光度，并以對照品溶液濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線。得到線性回歸方程=9.414+0.040 8，2=0.990 4表明葡萄糖的質量濃度在0～0.1 mg/mL之間與吸收度的線性關系良好。

2.2.2 大豆多糖顆粒的制備

將大豆多糖、蔗糖、糊精研磨過100目篩，再按多糖∶蔗糖∶糊精=1∶9∶10的比例稱取并混合均勻，將質量分數為70%的乙醇作為稀釋劑制軟材，20目篩擠壓制粒，于55 ℃鼓風干燥60 min，10目、50目篩整粒[10]即得大豆多糖顆粒。

2.2.3 大豆多糖顆粒茶質量檢查

顆粒劑主要質量指標的測定方法[11]如下。

2.2.3.1 多糖顆粒劑的含量測定

精確稱取大豆多糖顆粒200 mg溶于20 mL蒸餾水中過濾。從中精密量取1 mL于10 mL離心管中，加入5 mL無水乙醇，搖勻，靜置5 min，以4 000 r/min離心10 min，傾去上清，沉淀用蒸餾水溶解并定容至100 mL容量瓶中，作為供試樣品。精確吸取1mL供試樣品，按照標準曲線計算大豆多糖顆粒劑中多糖的含量。

2.2.3.2 溶化性試驗

稱取制備的大豆多糖顆粒5 g，加熱水100 mL，攪拌5 min觀察顆粒溶解情況。

2.2.3.3 粒度試驗

稱取制備的大豆多糖顆粒10 g，置于藥篩內過篩，左右往返邊篩動邊輕叩3 min，其中不能通過10目篩和能通過50目篩的顆粒總量不超過總顆粒質量的15%.

2.2.3.4 水分測定試驗

稱取制備的大豆多糖顆粒2 g，置于干燥且恒重的稱量瓶中，精密稱定后，打開瓶蓋在105 ℃干燥5 h，蓋好瓶蓋，移至干燥器中冷卻30 min，再次精密稱定。重復上述操作直到連續兩次稱重的差異不超過5 mg為止，計算含水量。根據制劑質量標準，供試品中含水量不得超過6%.

2.2.4 SPS抑制草酸鈣晶體生長的活性檢測

用紫外分光光度法測出晶體成核、聚集的參數[9，12]。

2.2.4.1 測出晶體成核參數

臨用配置含1.0 mmol/L草酸鈉、200 mmol/L氯化鈉、10 mml/L醋酸鈉的混合溶液以及8.0 mmol/L的氯化鈣溶液。加入氯化鈉和醋酸鈉是為了將pH值調至5.7，此值最接近結石患者清晨尿液中的值。實驗中所有的操作均在37℃的恒溫水浴箱中進行，以此來模擬人類體溫。

先將1.0 mL氯化鈣溶液移至比色皿中并置于分光光度計中，然后加入1.0 mL含草酸鈉的混合溶液，此時得到的混合溶液為含有4 mmol/L鈣離子和0.5 mmol/L草酸根離子的亞穩溶液。當加入氯化鈣溶液后，在620 nm條件下每20 s分光光度計記錄一次，計錄30 min，此為空白組實驗。

2.2.4.2 測出晶體聚集參數

臨用現配含1.5 mmol/L的草酸鈉，300 mmol/L的氯化鈉和15 mmol/L的醋酸鈉的混合溶液，以及12 mmol/L的氯化鈣溶液。以大豆多糖顆粒配置含SPS為0.01 g/100 mL的溶液作為抑制物。實驗時所有的操作均在37 ℃的恒溫水浴箱中進行。

先將1.0 mL氯化鈣溶液轉移到比色皿中并置于分光光度計中，再加入含草酸鈉的混合溶液和抑制物溶液各1.0 mL，以獲得4 mmol/L鈣離子和0.5 mmol/L草酸根離子的亞穩溶液。當加入氯化鈣溶液后，分光光度計每30 s記錄一次，記錄時間相應延長至60 min左右。分光光度計使用前調至620 nm，并預熱20 min，平行測定3次。

3 結果與分析

3.1 大豆多糖顆粒劑的質量檢測

3.1.1 多糖含量測定

大豆多糖顆粒劑中多糖的含量為4.43%.

3.1.2 溶化性試驗結果

實驗中，制備的大豆多糖顆粒隨著攪拌，逐漸崩解。溶解時間1 min左右，最終得到澄清透明的淡白色溶液。

3.1.3 粒度試驗結果

實驗中不能通過1號篩（10目）和能通過3號篩（50目）的顆粒總質量為0.963 g，占總顆粒重的6.42 %，符合制劑相關要求。

3.1.4 水分測定試驗結果

兩次干燥稱重的差值為0.084 g，含水量為4.2%，符合制劑相關要求。

3.2 SPS顆粒劑抑制草酸鈣晶體生長的活性檢測

本實驗通過測定CaOx在620 nm處的吸光度值變化進行SPS顆粒劑抑制草酸鈣晶體生長的活性檢測。空白組的OD值變化曲線如圖1所示，由圖1可知，OD值變化趨勢為先升高后降低。其中在OD值上升階段：上升的OD值變化曲線斜率即為成核曲線速率，簡寫為N；達到最大值時所需的時間稱為最大誘導時間，即max.在OD值下降階段：下降的OD值變化曲線斜率即為聚集曲線速率，簡寫為A，而OD值下降的原因為由于晶體聚集從而導致微粒數減少，最終體現在OD值變化上。本實驗通過比較max、N和A參數值，以此評價SPS的抑制CaOx成核、聚集能力。

從圖1可看到，在沒有添加抑制物時，隨時間的延長大量晶體形成，吸光度逐漸達到最大值，之后因CaOx晶體的聚集OD值而逐漸下降。通過計算得max為8.67 min，N為2.1×10-3min-1，聚集速率A為0.4×10-3min-1。大豆多糖顆粒劑對草酸鈣晶體生長影響活性檢測如圖2所示。SPS顆粒劑抑制草酸鈣晶體生長的活性檢測如表1所示。

圖1 草酸鈣晶體生長活性檢測

注：（a）（b）（c）為三組平行實驗結果

由圖2和表1可知，與對照組相比，成核速率由原來的2.1×10-3min-1降低到0.466×10-3min-1左右，聚集速率由原來的0.4×10-3min-1降低到0.108×10-3min-1左右，最大成核時間由8.67 min延長至15.33 min左右，且成核抑制率和聚集抑制率分別達到77.78%和72.91%.因此，大豆多糖顆粒溶液對草酸鈣晶體的成核、聚集能力具有良好的抑制效果。

表1 SPS顆粒劑抑制草酸鈣晶體生長的活性檢測

實驗號評價指標 成核速率SN聚集速率SA/min-1最大成核時間tmax/min成核抑制率/（%）聚集抑制率/（%） 10.5×10-30.105×10-314.3176.273.75 20.46×10-30.12×10-315.578.170 30.44×10-30.1 ×10-316.279.0575 均值0.466×10-30.108 ×10-315.3377.7872.91

注：成核抑制率=[1－（NM/NC）]×100%；聚集抑制率=[1－（AM/AC）]×100%

4 結論與討論

4.1 結論

以大豆多糖為主要原料制備的大豆多糖顆粒，其劑型符合顆粒劑相關質量要求，多糖含量為4.43%.進一步考察了大豆多糖顆粒茶對草酸鈣晶體生長活性的影響，結果表明：加入大豆多糖顆粒茶后，N由2.1×10-3min-1降到0.466×10-3min-1左右、A由0.4×10-3min-1降到0.108×10-3min-1，max由8.67 min延長至15.33 min，且成核抑制率和聚集抑制率分別達到77.78%和72.91%.由此可見，所制備的大豆多糖顆粒溶液對草酸鈣晶體的成核、聚集能力有良好的抑制效果。

4.2 討論

CaOx結石的病因與發病機制復雜，在控制CaOx的發生率和復發率方面，還有很多研究工作要做。本課題研究的目的是探索大豆多糖存在下制備的顆粒劑對草酸鈣結石形成的影響，從而為人類防治結石提供新的思路。而由于人體的內部環境是一個復雜的體系，制劑的主要成分在體內的轉化過程使得制劑的作用發生很大的改變，因此，利用注射、灌胃口服等技術手段，設計合理的動物實驗，選擇科學的分析統計方法，將有利于研究大豆多糖顆粒劑在體內環境對草酸鈣結石的影響，從而為結石類新藥篩選提供有利的保證。

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潘婷婷（1988—），女，山西臨汾人，助教，碩士學位，主要研究方向為中藥資源開發。

國家級大學生創新創業訓練計劃項目（編號：201611396007）

2095－6835（2019）02－0024－03

TS201.2

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2019.02.024

〔編輯：嚴麗琴〕