pH,Na+和Ca2+對大豆種皮果膠類多糖乳化穩定性的影響

趙玲玲 張紅運 范宏亮 楊艷萍 王勝男 楊立娜 李 君 何余堂 朱丹實 劉 賀

(渤海大學食品科學與工程學院1，錦州 121013)(吉林大學食品科學與工程學院2,長春 130000)

大豆種皮是大豆深加工中最大的副產物，占整個大豆總質量的8%，具有價格低廉、貯存容易、果膠含量較高等特點[1]。與工業化生產的大豆水溶性多糖相比，大豆種皮果膠類多糖具有優良的凝膠、乳化、增稠等特性[2]。

大豆種皮果膠類多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、多聚半乳糖醛酸等組成[3]，果膠類多糖結構中含有疏水基團，可與蛋白質在油-水界面結合形成空間位阻，具有較好的乳化穩定性[4]。在乳化過程中，疏水性的多糖在油-水界面具有強烈的吸附能力或直接與蛋白質絡合[5]，同時通過增加乳液的黏性以防止乳液液滴重力分離從而形成穩定乳液[6]。趙麗[7]采用不同方法提取大豆皮多糖并分析多糖性質，發現微波輔助草酸銨提取大豆皮多糖制成乳液黏度大，粒度分布均勻，穩定性好。但乳液穩定性不僅與多糖本身(酯化度、分子量等)及濃度有關，還受pH、離子強度等外源性因素影響[8]。調節pH及添加金屬離子可中和多糖自身電荷或改變其分子形態。Akihiro等[9]研究發現不同pH值提取可溶性大豆多糖的乳化性能差異顯著。Makoto 等[10]通過對比甜菜果膠(SBP)，大豆可溶性多糖(SSPS)和樹膠(GA)的乳化性能，發現SSPS在較高pH及鹽濃度范圍下，乳液穩定性降低。目前關于大豆種皮果膠類多糖乳化穩定性研究較少，更缺乏關于pH,Na+和Ca2+對SHPP穩定乳液能力影響的信息，所以本研究探索pH和鹽濃度對用SHPP制備乳液穩定性的影響，從而進一步推動SHPP在食品工業中的應用及飲料產品開發。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆種皮；大豆色拉油；草酸銨、乙醇、HCl、NaOH：分析純。

1.2 儀器與設備

PHS-3C pH計；Discovery DHR-1 TA流變儀；尼康80I光學顯微鏡；HYL-108激光粒度儀；RE3000旋轉蒸發器；DHG-9055A電熱鼓風干燥箱；SL-250A高速多功能粉碎機。

1.3 方法

1.3.1 SHPP制作工藝流程

將大豆種皮除雜，粉碎后過60目篩。稱取大豆種皮100 g，按料液比1∶20加入1%的乙醇溶液，室溫攪拌30 min，過濾，放置65 ℃恒溫干燥箱中烘干。稱取烘干后的大豆皮殘渣，按料液比1∶20加入0.6%的草酸銨，在微波功率320 W作用20 min，取上清液。將上清液4 000 r/min條件下離心10 min，將離心后的液體濃縮至原體積的1/3，調節pH至4。加入無水乙醇使乙醇含量達到70%，于4 ℃下放置2 h后，在25 ℃，4 000 r/min條件下離心30 min。將獲得的沉淀于65 ℃恒溫干燥箱中烘干[11]。

1.3.2 乳液的制備

配制100 mL乳液，首先用大豆分離蛋白溶液與大豆油混合，利用高速剪切機在10 000 r/min下剪切2 min，制成初級溶液。配制SHPP水溶液，繼續利用高速剪切機在10 000 r/min下剪切2 min，與初級溶液完全混合，最終使乳液包含20%油，3%大豆分離蛋白和2% SHPP，向最終乳液中添加0.02%疊氮化鈉來抑制微生物生長，制成的乳液4 ℃下儲存，備用[12]。

1.3.3 環境因素對SHPP乳化性質的影響

1.3.3.1 pH對乳液穩定性的影響

調節乳液的pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)，以未對溶液進行pH調節的溶液作為空白對照并對其穩定性進行分析，探討pH值對乳液穩定性的影響。

1.3.3.2 陽離子存在對乳液穩定性的影響

Dario等[13]研究大豆皮可溶性多糖(HSPS)的乳化性能時，發現乳液含有0.2 mol/L Na+和0.05 mol/L Ca2+時液滴粒徑最小，乳化穩定性最好。本實驗借鑒Dario M.Cabezas的實驗結果，將0.2 mol/L的氯化鈉溶液和0.05 mol/L的氯化鈣溶液與SHPP水溶液混合，制成乳液后對其進行分析，重點討論0.2 mol/L Na+、0.05 mol/L Ca2+存在對乳液穩定性的影響。

1.3.4 總糖及蛋白質含量測定

總糖含量采用苯酚-硫酸法[14]，以葡萄糖為標準，在490 nm波長處測定。蛋白含量根據 GB/T 50095-2010 食品安全國家標準—食品中蛋白質的測定。

1.3.5 粒徑分布的測定

采用激光粒度分布儀測定乳液粒徑[15]，取200 μL乳液加入激光粒度分布儀進行分析，參數設定為：激光波長633 nm，散射角度90°，溫度25 ℃，顆粒吸收率0.001，顆粒折射率1.52；遮光率范圍為5～20，折射率1.333。

1.3.6 流變分析

穩態流變分析：采用DHR-1旋轉流變儀測定，取1 mL乳液加在測試臺上，于25 ℃條件下采用40 mm平行板夾具，狹縫距離設置為0.5 mm，剪切速率0～200 s-1，檢測樣品流變特性[16]。

振蕩流變分析：將1.5 mL乳液加在測試臺上后，進行動態頻率掃描，掃描頻率范圍設定為0.01～3 Hz，檢測整個過程的模量變化。40 mm平行板夾具，狹縫距離為0.5 mm，應力為1.0 Pa，所有的測量均在25 ℃下進行，實驗過程中加蓋密封圈以避免水分過度蒸發[17]。

1.3.7 光學顯微觀察

將乳液稀釋10倍后，滴于載玻片上，待液滴均勻鋪展，為避免氣泡產生，將蓋玻片輕輕覆蓋于乳液液滴表面，置于(10倍、100倍)光學顯微鏡下觀察液滴的形態[18]。

1.3.8 脂肪上浮率

脂肪上浮率的測試參照 Karimi 等[19]的方法，略有改動。吸取 10 mL 剛制備的乳液樣品于玻璃管中(直徑1.5 cm，高度12 cm)，并用塑料蓋密封，防止乳液揮發。同時記錄不同條件下乳液的清液層高度(Hs，下層)和總高度(Ht)。

脂肪上浮率(CI)定義為：CI=(Hs/Ht)×100%

1.4 數據處理

每個實驗均重復3次，結果表示為平均數±標準差，用SPSS19.0 統計軟件進行方差分析，以P<0.05為顯著性檢驗標準。用origin8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 總糖及蛋白質含量

測定SHPP總糖含量約為52.09%，蛋白含量約為6.93%。

2.2 pH對乳液穩定性的影響

2.2.1 pH對乳液粒徑的影響

如表1所示，pH值對乳液的粒徑有顯著影響(P<0.05)。隨著pH值升高，乳液D3,2和D4,3逐漸減小，當pH值達到4.0時最小。當pH>4.0，乳液的D3,2和D4,3逐漸升高。當pH<4.0，乳液pHpI，蛋白質自身帶靜電或負電，與陰離子多糖形成較弱的可逆復合物，兩者間從靜吸引到靜排斥[21]，油滴表面吸附層結構不致密，顆粒粒徑增大，乳液穩定性減弱。

表1 不同pH對乳液平均粒徑的影響

注：每列標注不同小寫字母表示存在顯著差異P<0.05。

2.2.2 pH對乳液流動特性的影響

圖1 不同pH對乳液黏度和剪切應力的影響

液滴粒徑大小、連續相的黏度及組成成分等都可影響乳液流變學性質[22]。如圖1所示，乳液的表觀黏度均隨著剪切速率增大而顯著降低，即出現剪切稀化現象。當乳液pH值為4.0時，乳液黏度及剪切應力值最高。圖2中的儲能模量及損耗模量分別反映材料的彈性及黏性大小，其中pH值為6.0，7.0時彈性及黏性較差。反之，pH值為4.0時彈性及黏性最好有利于乳化穩定性增強。在pH值為4.0時，由于大豆蛋白的等電點在4.5左右[23]，SHPP可吸附在蛋白表面形成厚厚的界面膜，致使過剩帶相反電荷的SHPP游離在水相中，且水中游離大量H+，導致-COO-數目減少，SHPP彼此間排斥力減小而團聚，乳液的黏度增大[24]。隨著pH逐漸增大，乳液中OH-增加，一方面OH-與SHPP相互吸引，使多糖分子形態發生改變，另一方面多糖分子自身水解，與H+結合，導致乳液黏度減小，穩定性降低[25]。

圖2 不同pH對乳液儲能模量和損耗模量的影響

2.2.3 pH對乳液微觀結構的影響

從圖2可直觀看出，當pH值為3.0、4.0時乳化顆粒均呈較為規則的圓形，此時，乳液穩定性較好，pH值為5.0時乳化顆粒呈大小不均一的圓形，pH值為6.0、7.0時乳化顆粒呈現較不規則的橢圓形，當pH值為4.0時，如圖2所示，此時乳液的黏彈性最好，在均質過程中，由于增加連續相的黏度，同時增加剪切應力，可以讓液滴碰撞頻率降低，乳液粒徑減小且不易聚集，形成較規則的圓形[26]，在pH高于5.0時，SHPP與界面上的蛋白不發生靜電吸附而彼此排斥，SHPP離開界面而游離在水相中，SHPP無法為蛋白提供足夠的靜電及空間位阻屏障，所以蛋白可發生部分疏水聚集，從而導致液滴間相互聚集，乳化顆粒變大，影響乳液的乳化穩定性[27]。Li[28]利用殼聚糖包埋β-乳球蛋白質穩定的乳液在pH 3.0～6.0范圍內均能夠維持良好的乳化穩定性，而pH高于6.0時相對不穩定，與本研究結果相似。

注：a-e分別表示pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0時油鏡100倍下觀察得到的微觀圖，照片標尺為10 μm；A-E分別表示同等操作物鏡10倍下得到的微觀圖，照片標尺為100 μm。圖3 不同pH對乳液微觀結構的影響

2.2.4 pH對乳液分層穩定性的影響

從圖4可知，乳液 pH值為4.0時脂肪上浮率最小。在pH值3.0～4.0范圍內，隨著溶液pH值升高，乳液的分油率隨之降低，pH<4.0時，低于多糖的側鏈基團的解離常數pKa，—COO-基團部分質子化，導致液滴間靜電斥力減小，油滴發生團聚，上浮[29]。隨著 pH 升高接近蛋白等電點，蛋白質分子本身聚集的趨勢增加，但由于SHPP可與蛋白產生空間排阻及SHPP彼此間會產生靜電排斥，抑制油滴聚集[30]。在pH值4.0～7.0范圍內，隨著pH值升高，乳液的脂肪上浮率逐漸增大，乳液的穩定性逐漸下降，pH值達到6.0時趨于平緩。

2.3 陽離子存在對乳液穩定性的影響

2.3.1 陽離子存在對乳液粒徑的影響

從表2可知，與未加陽離子的乳液相比，不同陽離子對乳液粒徑有顯著影響(P<0.05)。向乳液中添加0.2 mol/L Na+，乳液D4,3和D50分別為74.52 μm和47.62 μm，大于未加陽離子的乳液，說明添加高濃度的Na+可促進液滴的絮凝和聚集，可能是高濃度陽離子游離在水相，帶相反電荷的離子在SHPP和蛋白表面積累，通過屏蔽蛋白和SHPP自身帶電量，降低了彼此間的靜電吸引力，同時，大量的鹽離子加入到體系中蛋白會發生鹽析而沉淀[31]，導致粒子變大。乳液中添加0.05 mol/L Ca2+，乳液的平均粒徑略大，Ca2+的存在，一方面可降低蛋白的溶解度，另一方面可與SHPP分子局部交聯，增加了SHPP分子的剛性，液滴之間更容易發生沉淀聚集。但是，由于添加Ca2+的濃度過低，可能只是屏蔽蛋白與SHPP的部分帶電量，蛋白與多糖之間會繼續發生靜電吸附作用，同時液滴之間也會產生靜電排斥，阻礙顆粒的進一步聚集，所以液滴粒徑略有增大。

表2 陽離子對乳液平均粒徑的影響

注：(1)每列標注不同小寫字母表示存在顯著差異P<0.05。(2)空白樣為未添加陽離子的樣品。

2.3.2 陽離子存在對乳液流變特性的影響

由圖5可知，空白及含陽離子的乳液表觀黏度均隨著剪切速率增加而降低，表現出剪切變稀的流體特性，未添加陽離子時，乳液的黏度及剪切應力高于含Na+和Ca2+的乳液，含Ca2+的乳液起始黏度最低為0.56 Pa·s。圖6反映出不含陽離子的乳液彈性及黏性相對較大。其原因可能在于Na+和Ca2+對SHPP的黏度行為具有很大影響，多糖的特性黏度受多糖分子間的靜電相互作用而降低，Na+、Ca2+作為反離子與SHPP分子中的羧基相互作用，改變了多糖分子的構象，受到鹽橋作用，使分子鏈由舒展到緊縮[32]。因此Na+和Ca2+存在會降低SHPP的黏度，從而降低其乳化穩定性。

圖4 不同pH對乳液分層穩定性的影響

圖5 陽離子存在對乳液黏度和剪切應力的影響

圖6 陽離子存在對乳液儲能模量和損耗模量的影響

2.3.3 陽離子存在對乳液微觀結構的影響

由圖7可知，未添加陽離子乳液的乳化顆粒均呈較為規則的圓形，而添加Na+和Ca2+乳液的乳化顆粒呈現較不規則的橢圓形，乳化顆粒大小：B>C>A，與表2結果一致。因為Na+和Ca2+帶正電荷，而SHPP自身帶負電荷，隨著乳液中帶相反電荷的離子增加，屏蔽多糖自身的帶電量，從而減小分子與分子間的靜電斥力，液滴間發生聚合，同時，鹽的相互作用會促進產生絮凝，有效的降低蛋白質的溶解度，由于形成一個三維的聚合液滴網絡進而阻礙乳化過程[33]，因此，陽離子存在可降低乳液乳化穩定性。

注：a-c分別表示乳液中未添加陽離子、添加Na+、Ca2+時油鏡100倍下觀察得到的微觀圖，照片標尺為10 μm；A-C分別表示同等操作物鏡10倍下得到的微觀圖，照片標尺為100 μm。圖7 陽離子存在對乳液微觀結構的影響

2.3.4 陽離子存在對乳液分層穩定性的影響

如圖6所示，未添加陽離子時，乳液的脂肪上浮率最低為37%，向其中添加Na+，脂肪上浮率最高為56%，此時由于大量鹽離子存在，使水的活度降低，蛋白表面的疏水殘基充分暴露，蛋白與蛋白發生聚而沉淀[34]，同時油滴界面電荷減少，油滴與油滴聚集，由于重力作用，油脂上浮析出。向其中添加Ca2+時脂肪上浮率為38%，說明0.05 mol/L Ca2+的存在對乳液乳化穩定性影響不顯著，可能由于Ca2+是高價離子，屏蔽蛋白和SHPP的部分電荷，使蛋白與多糖之間靜電斥力減弱，但粒子與粒子間仍然存在靜電互斥作用，所以有效緩解了油滴的上浮。

圖8 陽離子存在對乳液分層穩定性的影響

3 結論

大豆種皮果膠類多糖具有良好的乳化性質，其乳化穩定性隨pH值和陽離子存在的變化差異顯著。pH 4.0時，乳化顆粒粒徑最小，黏度及剪切應力最大，脂肪上浮率最低，乳化性最佳。添加0.2 mol/L Na+可促使乳液乳化穩定性降低，而添加0.05 mol/L Ca2+對降低乳液乳化穩定性作用較小。本研究結果表明，SHPP在酸性介質中可吸附在油-水界面形成黏彈性膜，因此可用作酸性O/W乳液中有效的乳化劑，同時，應避免添加金屬離子屏蔽SHPP自身帶電量。