重組酶聚合酶等溫擴增技術在食品安全檢測領域的應用

蘭海鷗，柯義強，馬咸瑩，程浩，丁功濤，李明生，陳士恩，馬忠仁，魏嘉*

1(西北民族大學，生物醫學研究中心，中國-馬來西亞國家聯合實驗室，甘肅 蘭州，730030)2(西北民族大學 生命科學與工程學院,甘肅 蘭州，730030)

隨著全球經濟的發展，進口貿易的增多，食品安全檢測也日趨嚴格。常用于食品安全檢測的聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)技術，是目前大部分檢測機構及醫學實驗室都在使用的常規技術。然而該技術需要昂貴且精密的控溫設備，耗費較長時間，在現場檢測中不具備優勢，因此，我們需要更加簡便的技術來提高檢測效率。

等溫核酸擴增技術的問世為快速檢測帶來新的曙光。目前開發出來的等溫擴增技術包括環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification method, LAMP)、自主序列復制與依賴核酸序列性擴增技術(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)、單引物等溫擴增(single primer isothermal amplification, SPIA)、鏈置換擴增技術(strand displacement amplification,SDA)、信號介導的核糖核酸擴增技術(sigal-mediated amplification RNA technology,SMART)、依賴解旋酶的等溫擴增技術(helicase-dependent isothermal DNA amplification, HAD)、滾環擴增技術(rolling circle amplification,RCA)、快速等溫檢測放大技術(rapid isothermal detection and amplification,RIDA)、切刻內切酶核酸恒溫擴增(nicking enzyme mediated isothermal amplification, NEMA)和重組酶聚合酶擴增技術等[1]。文章對重組酶聚合酶等溫核酸擴增技術(recombinase polymerase amplification, RPA)及其在食品安全檢測方面的應用進行綜述。

RPA技術是聚合酶鏈式反應(PCR)的一種替代品，可快速、便捷地進行核酸檢測分析[2]。RPA與PCR擴增一樣具有特異性，但速度更快，結果通常在3～10 min生成。與PCR不同的是，RPA反應不需要熱變性，因此不需要昂貴的熱循環設備。RPA對操作溫度要求并不嚴格，反應在37～42 ℃下工作最優，比其他等溫擴增技術需要的溫度要低，能在廣泛的環境溫度下工作[3]。RPA可以在多種應用中取代PCR，如傳染病診斷和食品安全檢測，它非常適合于現場、護理點和其他設備缺乏的環境，特別是對于檢測速度需求較高的情況下。

1 RPA技術介紹

1.1 反應原理

RPA技術的整個反應體系包含噬菌體重組酶UvsX及其輔助因子UvsY、寡苷酸引物、單鏈核酸結合蛋白(single-stranded DNA-binding proten,SSB)、DNA聚合酶，DNA模板、ddH2O和Mg2+等[4]。其擴增原理是恒溫條件下，重組酶與長約 30～35 nt的寡核苷酸引物結合形成復合物，并在雙鏈DNA模板中尋找靶位點，重組酶打開雙鏈DNA，引物與同源序列發生鏈交換反應形成D狀環，SSB隨即結合到被置換的DNA鏈，防止引物解離，重組酶解離后引物3’端暴露并被鏈置換DNA聚合酶識別，在DNA聚合酶的作用下DNA擴增反應啟動；引物與雙鏈DNA配對形成復制所需的3’羥基末端，并在聚合酶的作用下進行復制延伸，繼續DNA合成過程并完成2個引物的擴增，最后形成完整的擴增子。

1.2 引物設計

RPA引物設計原則：

(1)引物長度最長是45 bp，最好為30～35 bp，過短會影響重組酶活性。

(2)5’端為3～5個核苷酸，且避免出現連續的聚鳥嘌呤，最好是胞嘧啶，能促進擴增片段的重組。

(3)3’端最好為胞嘧啶和鳥嘌呤，有助于聚合酶的穩定結合，提升引物擴增性能。

(4)引物中避免出現特殊序列，如避免出現回文序列和連續的重復結構。

(5)引物設計時盡量避免容易形成發夾結構的序列，減少引物二聚體的形成。

(6)GC含量過高(>70%)或過低(<30%)都不利于RPA擴增[6-8]。

1.3 技術特點

RPA技術與傳統的PCR擴增相比,在便捷性以及高效性上有顯著的優勢，與PCR技術相比有以下特點：

(1)反應能夠在恒溫條件下進行。盡管RPA的反應模式與PCR相似，但不同的是PCR反應需要加熱使DNA模板變性，而RPA不需要，在37～42 ℃的條件下，利用重組酶引物復合體掃描雙鏈DNA，促使DNA鏈上同源位點的互換。

(2)耗時短。RPA反應速度快，能在5～10 min完成檢測。在許多情況下，沒有經過專門訓練的人就可以采集樣本，進行實驗，并在半小時內得到結果。檢測速度遠勝于其他等溫擴增技術。

(3)操作簡單。RPA擴增的基礎體系含有DNA擴增所需的所有試劑，只需加入引物和模板就可以反應，不需要復雜的樣品前處理，這大大提高了操作效率，避免繁瑣的實驗步驟帶來可能性的誤差。

(4)不受場地的限制。PCR擴增需要專門的PCR儀，RPA技術由于對溫度要求低，甚至可以用人體溫度進行，并可以在條件較為簡陋的地方進行檢測。

(5)高靈敏性。在復雜樣品中，RPA技術可以檢測單拷貝的DNA和幾十個或更少拷貝數的RNA分子，而不需要事先進行核酸純化和富集[9-11]。

1.4 操作過程

含有重組酶及聚合酶干粉的反應管中分別加入反應緩沖液、上下游引物以及模板DNA，用蒸餾水補至總體積，充分混勻，加入醋酸鎂溶液，上下顛倒8～10次混合均勻，瞬時離心后，放置于所需溫度的水浴鍋中反應10～15 min[12-15]。

2 RPA及衍生技術

2.1 直接重組酶聚合酶擴增技術(Direct-RPA)

Direct-RPA是一種快速、靈敏的檢測方法。該技術不需要復雜的樣品前處理環節，常溫下就能夠對樣品中的目標基因進行擴增，簡化了過程分析，在15～40 min的反應時長內能完成實驗要求，遠低于NASBA、HDA等技術的時長要求。它既不需要PCR所依賴的熱循環儀器,也不像環介導等溫擴增技術(LAMP)需要提前準備預變性的模板[16]。Direct-RPA具有快速、靈敏、簡單等優點，是RPA系列技術的基礎，但也有較明顯的缺點，如產物的檢測需要進行凝膠電泳，與其他等溫擴增技術相比，檢測步驟比較麻煩。

2.2 重組酶聚合酶擴增側流免疫技術(RPA-LFD)

側向流動免疫試紙條(lateral flow device，LFD)是目前用于定性和半定量檢測的簡單裝置。RPA-LFD是指在RPA技術結合LFD的一種聯用技術，兩者相結合可建立一種快速靈敏的現場檢測系統[17]。RPA-LFD基于RPA擴增原理，用帶生物素標記的引物和6-羧基熒光激素(6-FAM)標記的探針與靶核酸進行擴增反應[18]，最終形成的擴增子既帶有FAM基團又被生物素標記。LFD前端帶有FAM抗體的納米金粒，檢測線上帶有生物素抗體，將產物滴到試紙條上，擴增子上的FAM基團與FAM抗體反應，檢測線處的生物素抗體與擴增子上的生物素結合。最終，檢測線上顯示深紫色條帶，未被捕獲的產物與質控線線處的特異性抗體結合顯示深紫色條帶。RPA-LFD檢測能在15～20 min完成，25～45 ℃的環境中便可進行，因此，可用一些簡單的加熱裝備，如電熱水器等便可實現精確檢測。RPA-LFD檢測結果能在橫向流動試紙條上顯示，裸眼便可觀察，即使是非專業人員也可以直接分析結果，非常適用于現場快速檢測，尤其在經濟條件差資源缺乏的區域，具有更好的應用前景[19]。

2.3 重組酶聚合酶擴增酶聯免疫吸附技術(RPA-ELISA)

酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是抗原抗體的特異性反應，指將可溶性的抗原或抗體吸附到聚苯乙烯等固相載體上，進行免疫反應的定性和定量方法[20]。RPA-ELISA技術是在RPA技術的基礎上結合ELISA技術發展起來的用于檢測核酸擴增產物的新型分析檢測手段，綜合了RPA、ELISA兩種技術的特點，在特異性、靈敏性等方面表現出優異的特點、而且操作過程簡單，結果不需要電泳檢測和RPA產物純化，較短時間內可以完成整個檢測過程[21]。同時，能在數小時內對大量待檢樣品進行篩選和鑒定，適用于資源匱乏的現場快速檢測，是一種有效的聯用檢測技術。但RPA-ELISA也存在缺陷，如重復性差，容易出現假陽性等[22]。

2.4 實時重組酶聚合酶擴增技術(real-time RPA)

Real-time RPA，即實時熒光定量RPA，是RPA基礎反應體系與熒光探針結合起來的一種聯用技術。與實時定量PCR比較，兩者具有相同的靈敏度與特異性，然而實時熒光定量RPA的檢測過程所需時間明顯短于實時熒光定量PCR，即實時熒光定量RPA所需時間是7～15 min，實時熒光定量PCR則需耗時約90 min，且實時熒光定量PCR的實驗操作設備較復雜、昂貴，而且所占空間大、不便攜帶。此外，實時熒光定量PCR不僅需要一個熱循環過程而且實驗操作步驟復雜，而實時熒光定量RPA實驗操作 37～42 ℃ 的恒溫條件下就可進行，不需復雜的操作程序[23]。用雙標記寡核苷酸探針檢測目標擴增產物，該探針的5’末端含有熒光基團Tamra或FAM)，3’末端含有猝滅基團。當探針與被擴增的靶DNA結合時，外切酶Ⅲ切割基本位點，熒光基團和猝滅基團被分離，從而產生出與擴增目標DNA數量成正比的熒光信號，熒光強度也會隨著其擴增而增強[24]。熒光強度信號實時檢測由熒光信號檢測器或掃描儀完成，目前有針對熒光定量RPA技術的簡易便攜熒光檢測設備。該技術敏感性強、特異性高，檢測時間短，已有不少報道利用該技術建立食品安全快速檢測的方法。

3 RPA技術在食品安全檢測領域的應用

目前，RPA技術在國內外已經有大量的報道，涉及食品安全檢測以及臨床診斷等方面，并且在快速便捷檢測等方面優于PCR檢測。RPA技術在食品安全領域的應用主要包括食源性病毒、食源性致病菌、動物源性成分及轉基因成分檢測等方面。

3.1 食源性致病菌的RPA檢測

沙門氏菌是引起世界各地食源性疾病暴發的最常見病原，許多流行病學調查將沙門氏菌爆發的源頭歸咎于家禽和家禽副產品，包括蛋類[25]。GAO等[26]建立了一種快速檢測貝類中沙門氏菌的RPA-LFD檢測方法，在30～45 ℃下，僅需要8 min的擴增就能達到擴增子的檢測閾值。該方法具有良好的特異性，每次反應都能達到100 fg DNA(20 μL)的靈敏度。且不需要昂貴的設備，可作為野外條件下貝類和其他食物中沙門氏菌的檢測試劑盒。KERSTING等[27]將芯片技術與RPA技術結合，建立了一種能夠在芯片表面檢測淋球菌、腸道沙門氏菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的方法，酶反應在20 min完成，檢出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、腸道沙門氏菌10個菌落形成單位和淋球菌100個菌落形成單位，該方法對于護理點檢測和基于核酸的簡化和小型化診斷是有效的。KIM等[28]以牛奶為研究對象，建立了RPA方法檢測其中的沙門氏菌，5 min后裸眼觀察檢測結果。整個實驗過程在30 min即可完成，得出牛奶中的沙門氏菌檢出限為100 CFU/mL(每毫升樣品中含有的細菌菌落總數)，再次印證了RPA具有高靈敏度的特點。LIU等[29]以牛奶和雞胸肉為研究對象，建立了一種RPA-LFD快速檢測方法，檢測樣品中的沙門氏菌，并與PCR-LFD的檢測結果比對，結果顯示RPA-LFD的檢出限為1.05×10 CFU/mL，而PCR-LFD的檢出限為1.05×105CFU/mL，因此RPA-LFD的檢出限比較低，靈敏度高。由此可見，RPA技術能夠為食源性致病菌的檢測提供一種簡便的方法。

3.2 食源性病毒的RPA檢測

食源性病毒指以食物為載體并經糞口途徑傳播而導致人類感染、患病的病毒。作為食源性疾病的重要病原體，微量的病毒即可引起相關疾病的發生，其中不乏傳染性強、流行范圍廣、危害嚴重的疾病。WANG等[30]基于RPA技術結合側流層析技術LFD建立了一種檢測口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)的方法。在38 ℃ 條件下，用特異性引物和探針，在20 min成功擴增了口蹄疫病毒基因組2B基因的一個區域。該方法進一步驗證了RPA技術具有操作簡便、特異性好、靈敏度高等的優點，且不需復雜儀器，適用于基層實驗室和現場的口蹄疫病毒快速篩查檢測。YEHIA等[31]開發了用于檢測H5亞型流感病毒的血凝素基因的定性逆轉錄重組酶聚合酶擴增(reverse transcription recombinase polymerase amplification,RT-RPA)測定法。將結果與實時逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)進行比較，前者在7 min能完成檢測，而后者至少需要90 min才能完成。總之，RT-RPA比RT-PCR更快，并且易于在便攜式設備中操作。而且，它們具有同等的敏感性和特異性。EI等[32]以家禽及肉制品中H7和N9亞型流感病毒為研究對象，建立了反轉錄實時熒光定量PCR(RT-qRPA)方法。該方法分別可最低檢測到10個H7亞型病毒RNA或100個N9亞型病毒RNA，進一步表明RPA技術具有高靈敏性的優點。食源性病毒威脅人類健康，因此其檢測對食品安全體系的完善具有重要的意義。RPA檢測方法的建立為食源性病毒的檢測提供了新的方向。

3.3 肉類摻假檢測

肉類食品是人們生活中最重要的生鮮類食品之一，隨著生活水平的提高，對肉品質的需要也越來越高，近年來，國內外市場上的肉制品摻假事件頻繁發生，這些不法行為不僅破壞了公平貿易，給消費者帶來經濟損失，更重要的是引起了食品安全等方面的問題。郭燕華等[33]根據豬源線粒體細胞色素B基因序列設計了2對RPA引物，篩選了1對可用于擴增的引物，建立了基于重組酶聚合酶介導的等溫核酸擴增檢測方法，結果顯示，30 ℃等溫擴增條件下，RPA引物的特異性良好，檢測靈敏度可達0.1 ng/μL，該方法快速簡便，具有較高的特異性和靈敏性，適用于快速檢測市售生鮮肉中的豬源性成分。吳昊等[34]根據家豬線粒體細胞色素B的核苷酸序列建立了一套利用Real-time RPA技術進行肉及肉制品中豬源性成分的檢測方法。此方法能夠檢測出肉及其制品中低至0.2% 的豬源性成分，且能夠在恒溫條件下(40 ℃)15 min內完成反應，是一種新型、簡單、高效的檢測方法，對實現快速便攜式的豬源性成分檢測具有重要意義。綜上所述，RPA技術在動物源性檢測方面具有簡單高效等優點，為市售生鮮肉制品摻假提供了快速便捷的檢測方法。

3.4 轉基因檢測

隨著轉基因技術的不斷發展，其在農業技術方面的應用也越來越廣泛，轉基因食品也走向市場，在轉基因食品的監測方面，監管部門也面臨越來越大的壓力。賈玄[35]針對轉基因水稻建立了一套利用RPA技術的檢測方法，包括RPA-Basic、RPA-LFD、實時熒光定量RPA(RPA-Exo),結果顯示，該檢測方法相較于傳統的PCR具有更高的靈敏性，檢測速度方面也優于傳統PCR，在15～40 min能夠檢測出結果。李凱等[36]以轉基因玉米TC1507和MON89034兩個品種為研究對象，在實時熒光定量RPA檢測方法的基礎上，建立了雙重RPA檢測方法，結果顯示，RPA熒光檢測方法可以對這兩種轉基因玉米進行雙重檢測。XU等[37]基于花椰菜花葉病毒35S(camv-35S)啟動子和農桿菌NOP合成酶基因(NOS)終止子等在轉基因作物中的調控序列，設計了兩套RPA引物，建立了用于轉基因作物篩選和檢測的實時RPA檢測方法。該方法可在15～25 min可靠地檢測出樣品中的100個拷貝的目標分子。此外，還成功地將實時RPA檢測方法用于4種主要轉基因作物(玉米、水稻、棉花和大豆)的DNA擴增和檢測。這種新的擴增方法大大縮短了檢測時間，簡化了反應過程，為轉基因作物的快速檢測提供了一種有效的方法。CHANDU等[38]以轉基因RR2Y大豆為研究對象，建立了一種RPA的現場檢測方法，以大豆樣品中內源Lec基因作為對照，反應開始后大約5～7 min，Lec調控的反應在所有情況下均產生陽性信號。研究表明，這種現場檢測方法同樣適用于未經訓練的人員對樣品進行快速簡單的測試。RPA技術為轉基因食品的檢測提供了快速便捷的方法。

3.5 過敏原基因檢測

隨著食品行業的發展，過敏食物的增多，過敏性疾病已經成為全球性的問題，并引起各界廣泛的關注，據報道，約有90%的過敏反應是由花生、雞蛋、牛奶、果仁、貝類、大豆和小麥引起的，其中以花生為過敏原引起的過敏反應最為嚴重，SANTIAGO-FELIPE等[39]建立了一種RPA-ELISA檢測技術，同時檢測榛子、花生、大豆、番茄和玉米中的過敏原結果表明，每個分析物的檢出限為 1.3～5.3 μg/g，與PCR-ELISA的靈敏度和重復性相比，RPA-ELISA都優于前者，且RPA-ELISA技術更適合應用于偏遠地區等資源匱乏的環境。JAUSE-TRUBIO等[40]以羽扇豆為研究對象，建立了核酸適體-重組酶聚合酶等溫擴增(Apta-RPA)的方法，利用選擇的DNA適體的親和力和特異性，對抗過敏性β-凝集素過敏原進行等溫擴增超靈敏檢測。將磁珠作為固相與Apta-RPA檢測相結合，總測定時間從210 min減少到僅25 min，檢測限為3.5×10-11mol/L，證明了快速和超靈敏的通用方法可以與任何適配器一起使用。RPA方法的建立為食品中過敏原的檢測提供了新的思路。

4 結論

RPA等溫擴增技術具有許多優點。這種反應沒有熱循環的需要，可使用簡單設備，如加熱器或烤箱，價格低廉，可以進行最低限度的維護控制。具體來說，RPA具有恒溫、較低溫度、擴增時間短、可靠性和簡單性等特點。核酸擴增產物的測定還具有靈敏度高等優點，在食品安全檢測領域具有一定的應用價值。它提供了一種能夠檢測潛在食物威脅因素的方法，如過敏原、轉基因生物或病原體。傳統檢測技術由于耗時長，設備復雜，因此不利于現場快速檢測，已不能滿足食品安全檢測的更高需求，因此建立一種快速、便捷、靈敏、特異的檢測方法十分重要。RPA作為一個新興的分子檢測技術，迄今為止，不僅在醫藥學等方面應用較多，而且在食品安全檢測方面的研究也初有成效，隨著RPA技術不斷應用與研發，未來RPA將朝更加快速、便捷、敏感、特異的方向發展，給食品安全檢測的研究帶來新的曙光。