食品中植物源成分分子生物學檢測技術及應用研究進展

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(1.華南理工大學生物科學與工程學院,廣東廣州 510006;2.廣州海關技術中心,動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室,廣東廣州 510623)

我國第一本醫學專著《黃帝內經》明確提出“五谷為養”、“五果為助”、“五菜為充”,以植物為主要組成的膳食理念早在戰國時期就已植根于華夏民族的飲食思想當中[1]。現代食品工業的發展和人民生活改善的需要,催生出五花八門以植物原料為主要成分的加工食品。植物源性加工食品龐大的消費市場,吸引了各種各樣“經濟利益驅動摻假”(Economically Motivated Adulteration,EMA)[2]的不法逐利行為:不含植物源性成分的植物蛋白飲料[3]、以蕓豆為原料制成的“蓮蓉”月餅[4]、以綠豆為原料制成的板栗酥餅[5]、貴價養生五谷粉和代餐粉中摻入廉價淀粉[6-8]、扁桃仁偽充杏仁制作糕點[9-10]。層出不窮的EMA行為引發社會廣泛關注,也對食品安全監管提出了新的挑戰,為此國內外研究出了大量的針對食品中植物源成分鑒別的檢測技術。

除少量的輕加工植物源性食品可采用肉眼或顯微學判別外,市場上存在的植物源性加工食品大部分難以采用傳統的形態學方法進行鑒別檢測。利用植物源性加工食品中或多或少殘余植物細胞成分,采用分子生物學方法對特定植物種類保守基因或蛋白質進行檢測是國內外植物源性成分鑒別及加工食品鑒偽的重要技術手段。常規PCR(Polymerase Chain Reaction)和實時熒光PCR是行業應用主流,新型的數字PCR技術為定量檢測提供了新的方案,恒溫擴增技術有效補充了現場快篩和基層實驗室檢測能力,DNA條形碼因實現高效篩檢樣品中多物種成分而成為新興發展方向。

本文從基因水平和蛋白質水平兩個方面對食品中植物源性成分的分子生物學檢測技術及應用研究進展進行綜述,并對將來的發展趨勢進行展望,以期為食品中植物源性成分鑒假監管提供技術參考。

1 基于基因水平的檢測

1.1 核酸的提取和純化

食品中植物源性成分基因檢測技術創新發展的物質基礎,是獲得適合于下游檢測的優質足量核酸。如何獲得高純度的植物DNA,是技術研發和應用中需要突破的瓶頸[11]。植物物種的復雜性以及大量次生物質的存在,對植物DNA提取造成困難[12-15]。作為食品原料的植物組織中往往富含碳水化合物和次生物質如多糖、酚類、色素以及果膠等,會造成比較大的背景干擾。此外DNA提取過程中一些提取試劑的殘留也會影響后續的分子操作[16]。此外,從粗加工到深加工,食品中的DNA破損程度不斷加深,核酸的提取和純化也需充分考慮對小片段DNA的回收效率。

1.2 基于聚合酶鏈式反應的特定基因檢測

1.2.1 常規PCR(Conventional PCR) 常規PCR是在熱穩定DNA聚合酶的作用下,以脫氧核糖核苷三磷酸(Deoxy-ribonucleotide triphosphate,dNTP)為原料,在嚴格的變溫程序中通過特異性引物對目的片段進行體外擴增,經過DNA雙鏈變性、引物退火、聚合酶延伸等環節,由單個核酸分子擴增生成數十億個拷貝,實現基因檢測信號的放大,通過瓊脂糖凝膠電泳可以對檢測結果進行判斷[17]。常規PCR以作為生物遺傳信息載體的DNA為模板,其對物種鑒定的權威性和科學性不容置疑,也是基于聚合酶鏈式反應的特定基因檢測技術中發展最早、應用最廣的檢測技術,已經成為食品檢驗領域的常規技術方法。

Kim等[18]設計了基于ITS2序列的物種序列特征擴增區(Sequence characterized amplified region,SCAR)標記,采用常規PCR對目的序列進行擴增,建立將貴價青花椒和其他3種花椒屬摻偽品種進行區分鑒別的有效方法,其中,青花椒ITS2序列堿基數為385,其他3種花椒屬物種的ITS2堿基數分別為383、388、385,序列比對結果證明ITS2序列的物種特異性優于matK和rbcL。Zhang等[19]設計了油棕屬物種特異基因MT3-B的引物,對食用油中的廉價棕櫚油摻假成分進行鑒定,采用常規PCR方法可實現拷貝數檢測低限低至5個單倍體拷貝,具有較高的靈敏性。Mooney等[20]采用常規PCR對加工橙汁中柑桔源性成分的含量進行測定,針對葉綠體trnT-trnL基因的檢測能有效的區分單獨的橙汁、柑桔汁和兩者的混合物,檢測結果顯示該方法重復性較好,變異系數為7.5%,對加工果汁的盲樣測試中正確識別了20/22個樣品,沒有假陽性結果。常規PCR方法的應用開創了物種鑒別的PCR時代。采用該技術進行檢測時需要通過瓊脂糖凝膠電泳和熒光染色對擴增產物進行分析,操作繁復、耗時較長、未能實現精準定量,且熒光染料試劑對操作員的身體健康有一定的危害,因此,開發檢測手段更加方便快捷、檢測試劑低毒害的PCR衍生技術是PCR技術研究發展的指向標。

1.2.2 實時熒光定量PCR(Real-time Fluorescence PCR,qPCR) qPCR技術在常規PCR反應體系中加入熒光染料(如SYBR GreenⅠ)或熒光探針(如Taq Man),利用熒光信號積累實時監測整個PCR反應進程,實現對目的DNA片段的分析。在植物源性成分檢測方面主要是采用Taq Man熒光探針。利用梯度濃度標準品建立標準曲線后,qPCR還可利用標準曲線對未知模板進行定量分析[21-22]。qPCR與常規PCR相比,由于增加了特異性結合目的基因片段的熒光探針,擴增片段相對更短小,且采用靈敏的光電檢測元件檢測熒光信號,在一個離心管中同時實現目的基因片段擴增和產物分析,因此具有特異性高、靈敏度好、交叉污染風險低、檢測耗時少等特點。特別是qCPR檢測靈敏度可達到0.01%,對于背景物質干擾多、細胞殘余少、核酸破壞程度高的植物源性加工食品具有更好的檢測效果,是目前食品安全監管檢驗和食品行業生產質量控制中主流的檢測技術。

Brzezinskib等[23]根據芝麻2S白蛋白基因設計特異性引物探針,利用qPCR法能夠特異性的檢測芝麻樣品,對扁桃仁、腰果、榛子、胡桃、巴西胡桃、花生、南瓜籽、葵花籽、罌粟籽等無交叉反應,靈敏度可達5 pg DNA。Elisa等[24]根據醇溶蛋白基因設計了雙重qPCR用于鑒別硬質小麥和普通小麥,首次實現面粉中摻雜/摻偽的分子生物學分析,檢測靈敏度達0.15%,符合相關法律3%的檢測靈敏度要求,可用于檢測部門對意大利面進行成分鑒偽。孫良廣等[4]以蕓豆pvsbe2基因高度保守區域設計特異性引物探針,建立蓮蓉制品中蕓豆成分qPCR檢測的方法,DNA質量濃度的檢測靈敏度達到1 pg/μL,質量百分比檢測靈敏度可達0.01%。Ferreira等[25]設計了咖啡及其摻偽物種大麥、玉米、水稻等谷物的特異性引物,通過連續稀釋咖啡、大麥、玉米、水稻的DNA溶液,分別建立4個物種的標準曲線,線性相關系數R2均達到0.99,結果顯示這些物種DNA的定量檢測限分別達到0.4、0.6、14、16 pg,由此開發了一種較好的基于qPCR檢測烘焙咖啡、可溶咖啡中谷物成分摻假的方法。Soares等[26]基于大豆凝集素基因Lectin gene建立肉制品中大豆添加量測定的qPCR方法,利用正態校正曲線對豬肉中的大豆蛋白進行添加量測定,線性相關系數R2達到0.998,可檢測添加量在0.01%～6%范圍內的干大豆蛋白,該方法為食品檢測相關部門規范和管理加工肉制品中大豆成分的過量添加現象提供了借鑒。qPCR是目前成分鑒定方法中最主要的技術之一,已廣泛用于植物源性食品的定性和定量檢測,尤其在食品中植物源性過敏原成分和轉基因成分的相關應用實例眾多。但是qPCR在進行定量分析時對標準曲線有較大的依賴性,且標準品與實際樣品在DNA提取、PCR擴增等方面存在著不容忽視的巨大差異,因此限制了qPCR在食品樣品定量分析領域的應用。

1.2.3 數字PCR(Digital PCR,dPCR) dPCR是一項基于單分子目的序列PCR擴增的拷貝數定量技術,根據泊松分布(Poisson distribution)統計學原理對大量反應室中單分子核酸的PCR擴增結果進行分析,從而計算出初始樣品中目的序列的精確拷貝數[27-29]。dPCR擺脫了依賴系列梯度標準品繪制標準曲線的基因定量方式,直接對樣品中的目的序列進行拷貝數準確定量[30-31]。商業化dPCR儀的出現,克服了dPCR技術在實際應用中面臨的操作復雜、重復性差、通量低等困難,實現了自動化和高通量的應用。主流dPCR分為芯片式數字PCR(chip digital PCR,cdPCR)和微滴式數字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)。dPCR的優勢推動和擴大了其發展與實際應用范圍,近年來該技術在食品中動植物源性成分鑒別檢測方面取得了不少研究成果[32]。

在食品中植物源性成分方面,郭楠楠等[33]基于ddPCR技術,建立了定量分析市售杏仁露中杏仁源性成分和摻假花生源性成分的含量的檢測方法,通過建立兩物種的質量與拷貝數之間的計算公式進行特異性、人為摻假樣品和市售樣品的檢驗,定量方法的建立、驗證和實際應用中各重復實驗之間變異系數均小于15%,可以較好地達到定量分析和甄別摻假的目的。Scollo等[34]建立了ddPCR定量檢測橄欖油DNA的方法,結果顯示檢測靈敏度為10-3,線性擬合相關系數R2為0.9972,相關性比較理想。在食品中動物源性成分方面已有較多采用cdPCR或ddPCR建立鑒偽定量檢測方法的研究報道,可檢測低至10 pg的DNA,且定量檢測限達8拷貝[35-38]。

現有報道顯示,ddPCR可以顯著排除干擾背景的影響[39-40],有效提高了檢測性能。有學者認為,ddPCR不依賴于標準曲線,對稀有事件檢測準確靈敏,具有較好的準確性和應用性[41]。目前,ddPCR以其通量高、操作便捷、定量檢測精準等突出優勢,已經成為dPCR檢測技術的主要技術。dPCR搭建精準定量平臺,為判別食品中物種源性成分無意摻雜和有意摻偽提供了新的研究思路。

1.3 基于恒溫擴增的特定基因檢測

1.3.1 環介導等溫擴增(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP) LAMP通過對目的基因的6個特定區域進行4種引物設定,在60～65 ℃恒溫條件下利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶對目的基因進行高效擴增,從而實現高效靈敏的檢測[42]。與PCR技術相比,LAMP無需提供精確的變溫反應條件,反應時間可短至30～60 min,檢測結果判讀可視化。而且由于引入多條引物對目的序列多個特定區域識別匹配才能發生反應,因此LAMP具有很高的特異性[43-45]。由于LAMP技術特異性強、檢測效率高、操作簡便、對儀器設備要求低、結果判讀簡單,已經在食品檢測中得到越來越廣泛的應用[46-47]。

Focke等[47]以rDNA的ITS1區域為模板設計引物,采用LAMP技術檢測面包混合物中的植物源性成分,檢測出黑芥、白芥和芹菜,定性檢測限為16 mg/kg,定量檢測限分別達到16 mg/kg,與qPCR實驗結果進行對比發現。Vaagt等[48]采用LAMP方法對親緣關系密切的食用菌和來路不明甚至有毒性的蘑菇進行鑒別,通過蘑菇樣品(原料和油炸原料)的交叉反應研究和分析驗證了該方法的適用性,在不同的蘑菇混合物中,可以檢測到2%(w/w)的摻雜污染,為食用菌的現場快速鑒定提供技術手段。目前LAMP在食品領域中關于轉基因成分和過敏原的檢測應用已較成熟[49-51],在動物源性成分檢測方面的應用也較為廣泛[52-53]。但是該技術在引物設計時,其對應的序列均為較大的片段,而深度加工食品中的DNA片段較小,因此,其在深加工食品檢測領域的應用受到了限制。在較小的目的序列區域設計高靈敏度和特異性的引物也是LAMP亟需突破的技術難點[54]。

1.3.2 重組酶聚合酶擴增(Recombinase polymerase amplification,RPA) RPA通過設計2種特異性引物(可增加1種探針),在25～42 ℃恒溫條件下,重組酶與寡核苷酸引物結合形成酶-引物復合體,復合體在重組酶催化下以及單鏈DNA結合蛋白(Single-strand DNA binding protein,SSB)協助下,定位到模板的目的序列,使DNA雙鏈解旋,并在DNA聚合酶催化下形成新鏈[55]。與LAMP檢測方法相比,RPA具有更短的反應時間,一般5～20 min即可完成反應,且反應溫度條件更低,接近人的正常體溫。RPA靈敏度高、成本低、反應速度快、樣品預處理要求低、引物設計更靈活便捷,可以在條件簡陋的實驗室和資源不足的戶外等地實現應用,近年來RPA技術在食品檢測中的應用越來越廣泛[56-57]。

Nosi等[57]基于RPA對加工食品中的芒果肉進行檢測,建立食品中芒果成分摻假的鑒偽方法,檢測低限為1 copies/μL。Liu等[58]采用RPA建立了鑒別草本銀杏葉及其摻偽物種槐樹葉的方法。RPA以其獨特的優越性引起了廣泛的關注,近年來發展迅速。但是該技術本身還存在著許多缺點和不足,比如所需的探針(46～52 bp)和引物(30～35 bp)比其他核酸擴增技術的探針和引物長,增加了設計的難度,限制了其深加工食品中的應用范圍。

1.4 基于基因序列多態性分析的通用基因檢測

DNA條形碼(DNA barcoding)是一種新興的基因序列分析技術,其基本原理是利用DNA序列“低的種內變異”且“高的種間變異”的特點,通過分析一段較短的DNA標準序列的多態性來實現快速、準確的物種鑒定[59]。目前,DNA條形碼已經被認為是一種強大、快速、成本低廉且用途廣泛的物種鑒別檢測技術,在食品真偽鑒別技術領域已經成為有效的檢測工具之一。

Kumar等[60]以DNA條形碼技術對橄欖油及其假冒樣品蓖麻和向日葵的識別區域進行單核苷酸多態性分析,通過擴增目標區域,將所得序列同蓖麻和向日葵的DNA序列相匹配,檢測出橄欖油中存在5%的摻假成分。Madesis等[61]利用植物通用條形碼trnL結合高分辨率溶解曲線(High-resolution melting,HRM)對希臘和地中海地區常見豆科作物的識別和摻假進行檢測,檢測結果發現大豆粉中存在1%的羽扇豆屬摻假成分。Uncu等[62]通過與氣相色譜分析方法作比較,發現PCR毛細管電泳條形碼(PCR-CE barcode)在鑒別橄欖油的植物來源摻假物種時,表現出更好的靈敏度和檢測效率,驗證了PCR-CE條形碼技術在檢測橄欖油中成分摻假現象的可行性。韓晴等[63]設計并篩選同時能對杏仁、花生、核桃、大豆、芝麻和榛子六個物種進行擴增的通用引物,試驗表明引物ITS2-2和trn H-psb A-1分別對六個物種的擴增成功率和測序成功率均較高,且引物ITS2-2對于摻入85.80%的花生檢測結果為杏仁,trn H-psb A-1對于摻入6.94%的花生檢測結果為花生,這兩種引物可作為鑒別杏仁露中花生源性成分的植物DNA條形碼組合。Bruni等[64]使用rbcL和trnH-psbA質體區域作為條形碼標記,對意大利北部阿爾卑斯山區的植物區系中不同地方產生的4種多花蜂蜜的植物來源進行檢測,在4種蜂蜜樣品中鑒定出39種植物物種,發現樣品均來自于栗屬、櫟屬和幾種草本植物分類群的常見植物的混合物,且在所檢測的4種蜂蜜樣品中都發現了至少1種特有植物,為這些產品的地理特征提供了明確的標識,同時也可以對蜂蜜植物來源的毒性進行安全性評估。

2 基于蛋白質水平的檢測

基于蛋白質水平的分子生物學檢測技術,主要依據免疫學原理,通過植物源性成分中具有抗原活性的特定蛋白質與特異性抗體的結合為基礎開展定性或定量檢測。確保進行免疫特異性反應的蛋白質抗原表面決定簇不受破壞、蛋白質濃度適宜以及干擾雜質較少的反應背景[65-67]是蛋白質水平免疫學檢測技術的關鍵。植物組織細胞中的次生物質會對蛋白質免疫反應的背景和結果讀取造成極大干擾,反應體系中的RNA、DNA和其他抗原表面決定簇相近的蛋白質可能會產生競爭性結合[67]。深加工植物源性食品具有抗原活性的特定蛋白質可能因為加工過程的溫度、酸堿度、高鹽高糖等因素而發生蛋白質變性,失去進行免疫學特異性反應的特定結構,影響抗原和抗體之間的結合力,會造成假陰性檢測結果[68]。有些蛋白質難以制備合適的血清抗體。有些蛋白質的表達具有時空或組織特異性等。這些因素都會制約蛋白質水平檢測技術在食品中植物源性成分鑒別檢測領域的應用。

食品中植物源性成分蛋白質水平的檢測技術主要分為免疫膠體金技術(Immune colloidal gold,ICA)和酶聯免疫吸附分析(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)兩大類型,集中應用于食品致敏原成分如芝麻[69]、杏仁[70]、花生[71-72]和轉基因成分如大豆[73]的檢測。ICA操作簡便,可以快速得到定性檢測結果[74];ELISA通過引入系列濃度標準品和顯色生化反應,利用光學檢測設備實現定量檢測目的,具有高通量的優勢[75-76]。

3 展望

與蛋白質相比,核酸對溫度、化學物質、酸堿度、紫外線等具有更好的穩定性,且所具有的物種保守性更為理想,因此基因檢測成為食品中動植物源性成分分子生物學檢測技術研究和應用的主要方向。食品摻假時有發生,食品成分檢測技術的應用范圍也不同。原料經過破碎、攪拌、高溫、高壓等加工過程,殘余植物源性特征成分的質與量發生了極大下降,檢測技術應能夠適用于核酸含量低、破碎程度高的樣品;有意摻假和無意混雜在性質和安全風險上差別巨大,檢測技術應能夠為評價和區分的解決方案提供技術依據;食品生產、流通和安全監管對要求檢測時長不斷縮短,快速檢測甚至是現場檢測將會是未來一個重要的發展方向。

目前,食品中植物源性成分基因檢測技術的發展趨勢,一方面以dPCR為代表,正在逐步實現精準定量的目標,從而為有意摻假和無意混雜提供可靠的評價依據;另一方面以DNA條碼技術為新興發展方向,對復雜樣品中未知物種成分鑒別從“大海撈針”轉變為“撒網捕魚”,改變以往PCR技術只能針對已知特定物種的保守基因進行逐個檢測、對未知物種成分無能為力的窘況,實現高效篩檢樣品中多物種成分的目的。