調節性B細胞在妊娠過程中的免疫調節研究進展

陳現，何書貴，林蓉，何來賓，曾勇

(深圳中山泌尿外科醫院生殖醫學中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045)

正常妊娠是一個復雜的生理過程，依賴于母體內由眾多免疫細胞及細胞因子參與的精密免疫調控，使得母體對胎兒產生免疫耐受，維持妊娠，一旦這些調控失衡就可能導致不良妊娠[1]。一般認為B細胞可通過產生特異性抗體或多種細胞因子上調免疫反應，也可作為專職抗原呈遞細胞參與免疫應答。然而，近年來人們發現了一類具有負向免疫調節功能的B細胞新亞群，即調節性B(Regulatory B，Breg)細胞，可通過分泌抑制性介質如白細胞介素-10(IL-10)，或作用于其它免疫細胞等機制發揮免疫抑制功能，在免疫耐受中起著關鍵的作用[2]。在自身免疫性疾病、腫瘤、移植耐受及抗感染免疫中，Breg都發揮著重要的免疫調節功能[3]。隨著生殖免疫學的發展，免疫因素在成功妊娠過程中的作用受到越來越多的關注。因此本文將簡要介紹Breg細胞的表型和功能特征，以及其在妊娠過程中免疫耐受的可能機制，將為進一步探索Breg細胞在妊娠過程中的作用提供新的思路。

一、Breg表型與作用機制

有關Breg分類標準，目前尚不統一，且Breg細胞表面標志物在人類與實驗動物中具有不同表達。多數文獻根據其分泌的細胞因子以及B細胞的起源和表面標志，將Breg細胞分為3類，即IL-10相關Breg細胞(Br 1)、轉化生長因子β(TGF-β)相關Breg(Br 3)以及Foxp3表達相關的Breg細胞[4]。根據Breg細胞分化和激活方式，Breg又可以分為固有型(多克隆刺激誘導IL-10生成)和獲得型(抗原特異性IL-10生成)，固有型Breg來源于邊緣性B細胞和B-1a細胞，而獲得型Breg來源于成熟濾泡性B細胞[5]。此外，學者發現人類周圍血CD19+CD24hiCD38hiB細胞具有免疫調節功能[6]。

Breg細胞發揮免疫負調節作用，主要通過以下兩條途徑實現：(1)Breg細胞可直接通過細胞間相互作用發揮負性調節作用。Rincon-Arevalo等[7]報道，在CD40、MHC-Ⅱ、CD80、CD86和PD-L1信號的參與下，Breg細胞與CD4+T細胞相互作用進而減少增殖和Th1細胞因子[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ-干擾素(IFN-γ)]的產生。Breg還可通過表達糖皮質激素誘導的TNF受體和配體維持調節性T細胞(Treg)數量，從而阻止自身免疫性疾病的發生[8-9]。(2)通過分泌抑制性細胞因子發揮調節作用。Breg細胞還可通過分泌IL-10、IL-35，抑制Th1細胞(Th1和Th17)的增殖和促炎細胞因子(TNF-α、IFN-γ)的分泌；也能夠誘導CD4+CD25-T細胞分化成分泌IL-10的Treg細胞，并抑制單核細胞分泌TNF-α。由Breg細胞產生的IgM也能夠誘導凋亡體的清除，降調促炎介質的表達[10]。由此可見，Breg細胞主要通過分泌抑炎細胞因子介導各類免疫細胞的增殖和分化，對免疫耐受有著重要的調控作用[11]。

二、妊娠期Breg的變化及其調節

妊娠是一個獨特的生理過程，母體通過復雜的免疫調控機制實現了對帶有異種抗原的胎兒的接納。母-胎免疫耐受涉及復雜的母-胎免疫調節過程及機制，以母-胎界面為中心環節，并向母體外周免疫系統擴展，在妊娠相關激素積極參與下，形成復雜的免疫調節環路。雌激素(E2)和孕激素(P4)是妊娠過程中兩個重要的調控激素，在妊娠建立和維持中發揮關鍵作用，對胎盤和胎兒營養所需的血管生成有著重要的調節作用[12]。研究表明，女性性激素可調節蛻膜免疫細胞，如樹突狀細胞(DC)、子宮自然殺傷性細胞(uNK)，有助于母胎免疫耐受的形成[13]。同樣，B細胞也受雌激素的調控，在淋巴細胞增殖過程中，隨著雌激素水平的升高，前體B細胞比例降低，而成熟B細胞不斷增殖。由此可見，雌激素水平的變化可影響B細胞的成熟，以確保免疫系統能夠在必要時保護母體免受病原體的侵襲[14]。研究還發現E2通過PD-1/PD-L1的作用機制，可促進IL-10+Breg細胞比例的增加[15]，從而降調CD11b+CD45hi活化性巨噬細胞、DC和浸濾性CD4+細胞比例[16]。而且，另有學者發現在腦脊髓炎(encephalomyelitis，EAE)動物模型中，P4治療后可降低EAE的病情，并同時促進IL-10的分泌和CD19+B細胞的數量[17]。這些結果均表明Breg細胞能夠通過對雌孕激素反應的響應而調控機體的免疫炎癥反應，起著一定的保護作用。

此外，人絨毛膜促性腺激素(HCG)是與妊娠密切相關的糖蛋白激素，由胚胎合體滋養細胞分泌，對E2和P4水平的維持是必不可少的。而且，在HCG等激素的作用下，胚胎及子宮內膜均釋放大量細胞因子，構成巨大的信號網絡，不斷完善自身功能以適應彼此，最終達成母體-胎兒之間的交互對話[18]。HCG對T細胞和uNK細胞有重要的調節作用[19]，近年來人們也逐漸關注HCG對Breg細胞的調控作用。研究發現，95%以上的CD19+CD24hiCD27+Breg細胞表達HCG受體，且體外實驗證明向純化分離得到的CD19+B細胞中加入人重組HCG可誘導Breg細胞的增殖，并分泌大量的IL-10[20]。因此，學者們推測在正常妊娠過程中HCG可促進表達IL-10的Breg細胞的增殖，從而調控不利于成功妊娠的免疫反應。Fettke等[21]報道B細胞和人類絨毛膜癌滋養層細胞(JEG-3)共培養24 h后，結果發現CD19+CD24hiCD27+IL-10+細胞比例顯著增加，且IL-10的分泌也顯著增加；從分離的CD19+B細胞中，JEG-3細胞懸液能誘導IL-10的分泌。為此，他們使用抗HCG抗體阻斷HCG，結果消除了JEG-3誘導 Breg細胞分泌IL-10的作用。因此，滋養層細胞內的HCG能夠改變B細胞的表型，并使B細胞具有保護作用。

盡管妊娠期相關激素對Breg細胞數量或功能的調控機制仍有待深入闡明，但我們可以推測妊娠期相關激素如E2、P4和HCG對Breg細胞有著重要的免疫調節作用，有助于妊娠期母胎免疫耐受的形成，以保障正確的母-胎交互作用。

三、Breg與妊娠免疫耐受

正常妊娠類似于成功的同種異體移植，母體對攜帶父系抗原的胚胎不僅不排斥，而且通過精細的母-胎對話，建立獨特的母-胎界面免疫耐受微環境，允許胎兒在子宮內生長發育直至分娩。母體來源的細胞、胎兒來源的滋養細胞以及這些細胞產生的各種細胞因子、生長因子、激素等共同構成了母-胎界面特殊的免疫微環境，以維持成功妊娠。Breg細胞在自身免疫性疾病、移植和癌癥中的研究均表明：Breg細胞可抑制局部微環境的炎癥反應，促進穩定的免疫耐受反應的形成?；谀壳皣鴥韧馕墨I報道，可推斷Breg細胞是妊娠過程中的一個重要調節因子。Breg細胞在自身免疫性疾病中抑制炎癥和移植耐受的作用均表明其可能與母體免疫耐受的形成有關，Breg細胞在癌癥中促進腫瘤生成的作用也可適應于妊娠的建立，如母體-胎兒同源交互作用可募集Breg細胞，并訓導它們發育為Breg細胞，確保胎兒的生長不受干擾[22]。國內外學者對妊娠免疫耐受的機理做了部分深入探索，認為Breg細胞能夠調節著床局部免疫功能，通過分泌IL-10和其它的細胞因子誘導免疫耐受的形成，促進胚胎的植入和妊娠的維持。

近年來，對動物實驗的研究可直接證明Breg細胞在母胎免疫耐受的調節作用。在自然受孕和自發流產小鼠模型的研究中發現，在自發流產小鼠中B10(Breg)細胞比例顯著低于自然受孕小鼠的比例；隨后，將B10細胞注射到自發流產的小鼠體內后，結果發現B10細胞可抑制DC的成熟，促進Treg細胞的增殖，從而降調母體對胎兒的免疫排斥反應，可有效降低自發流產的風險[23]。而且，被認為與成功妊娠密切相關的另一種Breg細胞，即邊緣區(MZ)B細胞，在正常妊娠小鼠的脾臟中可被觀察到，而妊娠并發癥的小鼠中則觀察不到。另外，成功妊娠與MZ B細胞表達免疫球蛋白(IgM和IgA)的能力有關，可促進Th1型免疫反應向Th2型免疫反應的轉換[24]。盡管IL-10也具有同樣的作用，但目前尚無證據表明MZ B細胞表達的細胞因子在成功妊娠中的調節作用。

對人類的研究發現，在妊娠早期正常妊娠女性周圍血中CD19+CD24hiCD27+Breg細胞的比例顯著高于自發流產女性的細胞比例[20]。體外研究顯示，從妊娠早期孕婦周圍血中分離得到的Breg細胞可抑制活化的效應T細胞分泌TNF-α[24]。有趣的是，Lima等[25]對35名非妊娠婦女和43名妊娠婦女的研究發現，在脂多糖刺激下，與非妊娠組相比，妊娠組CD24hiCD27+Breg細胞和CD24hiCD38hiBreg細胞絕對值在妊娠晚期和分娩日顯著降低，作者認為這可能與能夠影響B細胞活化有關的性激素水平下降有關。此外，還有研究發現Breg細胞產生的TGF-β能夠抑制CD8+毒性T細胞的增殖和分化，降低母體對胎兒的排斥反應[26]。以上的研究均表明，Breg細胞在妊娠不同階段對母體免疫耐受的建立和維持具有重要的調節作用。盡管目前對Breg細胞功能在人類妊娠過程的作用研究較少，但是Breg細胞介導的免疫抑制作用與在自身免疫性疾病、宿主移植耐受和癌癥中的功能比較相似。基于此，Breg細胞可通過促進Treg細胞的增殖，調控Th細胞反應，抑制效應細胞如細胞毒性T細胞、NK細胞和DC的免疫反應，從而促進免疫抑制性微環境的形成。

雖然妊娠過程中Breg細胞的功能似乎與Treg和DC相互聯系，但明確其作用機制是必要的。Treg細胞和DC對妊娠結局的影響至關重要。在正常妊娠過程中，大部分蛻膜DC細胞處于未成熟狀態以維持局部耐受性微環境的形成。這些未成熟的DC被認為是耐受性的DC[27]。Treg細胞在建立和維持母-胎免疫耐受中同樣有著重要的貢獻。在小鼠發情期可觀察到Treg細胞的增殖，促進同種異體胚胎的植入[28]。在胚胎植入早期，Treg細胞在動脈旁淋巴結中募集，隨后轉移到子宮中[29]。Treg細胞的增殖與成功妊娠率密切相關，在妊娠不同時期中子宮Treg細胞數量不足均可導致流產的發生[30]。因此，在妊娠過程中，耐受性DC和Treg細胞通過分泌抑炎細胞因子IL-10和TGF-β而調節胎兒耐受環境的形成[31]。若抑炎信號IL-10和TGF-β缺失，則耐受性的DC仍可抑制T細胞的活化，從而保護同種異體胎兒免受母體免疫系統的排斥[32]。因此，DC保持其未成熟狀態可有助于耐受性表型的形成。由此得知，IL-10和/或TGF-β必須在妊娠起始時就存在，以備于誘導耐受性DC形成后進而促進Treg細胞的增殖分化，或者直接誘導Treg細胞的增殖分化。然而，基于Breg細胞以下幾點：(1)是分泌IL-10和TGF-β的主要細胞；(2)在正常妊娠過程中Breg細胞數量顯著增加；(3)能響應內分泌調節系統的變化，我們可以推測Breg細胞在妊娠過程中同樣有著重要的作用，尤其是在母體免疫耐受形成的最初階段必不可少。Jensen等[23]研究結果支持這一觀點，即在妊娠小鼠中B10細胞分泌的IL-10通過與富集DC上IL-10受體相互作用后，抑制DC的成熟，進而促進Treg細胞的增殖發育。因此，根據目前文獻所報道的這三種免疫細胞相似的免疫抑制作用及相互調節作用，學者提出Breg細胞在妊娠耐受的建立過程中：通過CD80/CD86共刺激信號或IL-10和TGF-β的表達而直接誘導Treg細胞增殖；或者通過IL-10抑制DC的成熟誘導耐受性DC的形成，進而誘導Treg細胞的增殖；而Treg細胞和耐受性DC也能分泌IL-10，能夠維持妊娠期負性調節的反饋作用[22]。然而，Breg細胞在妊娠期招募Treg和DC的具體作用機制處于未解之謎。

四、展望

Breg細胞在妊娠過程中扮演著重要的作用，主要通過分泌IL-10或TGF-β，抑制母體T細胞產生的不良免疫反應，因此對耐受性的識別非常重要[20]。眾多文獻已證實，Breg細胞免疫抑制作用在妊娠發展過程中起到重要的負性調節作用，Breg細胞的發現和研究為臨床治療不良妊娠結局提供了理論基礎。然而目前關于Breg細胞在妊娠過程中的研究主要關注于周圍血中的作用，對母胎界面局部Breg細胞數量和功能的研究較少，而母胎界面的免疫狀態對胚胎的粘附、生長、發育提供了重要的物質基礎，這一免疫耐受的調節與Breg等其他免疫細胞發揮正常的功能是不可或缺的。同時，Breg細胞表型和在妊娠不同階段細胞數量的變化和具體作用機制，以及與其它免疫細胞的相互作用等尚未闡明，這些問題有待于我們進一步深入思考和探究，期待將來更多Breg的臨床研究能為不良妊娠結局患者帶來治療希望。