去甲雄三烯醇酮檢測技術研究

王淑云

（河南科技學院新科學院，河南新鄉 453000）

去甲雄三烯醇酮（17β-hydroxyestra-4,9,11-trien-3-one）的商品名稱是A-群勃龍（Trenbolone，TRE），是一種人工合成的甾類雄性激素。TRE作為生長促進劑，能夠提高瘦肉產出率和飼料轉化率，在動物飼養中被大量使用。運動員服用TRE可提高體內雄性激素的含量，進而提高運動成績。為避免人類因長期攝入激素殘留物或其代謝物而引起發育、神經、遺傳毒性和癌癥問題[1]，我國農業部第235號文件中規定TRE在動物性食品中不得檢出[2]。

本文就TRE及其同類蛋白同化激素的檢測技術進行闡述，為TRE檢測試紙條和蛋白質芯片等最新技術的探索提供參考。

1 理化分析方法

TRE樣品具有基質復雜、效應明顯、干擾物較多、濃度水平低等特點，為了準確定性且精確定量其殘留量，檢測方法必須靈敏、準確、特異性強。目前TRE樣品的理化檢測檢測方法主要包括:高效液相色譜法（HPLC）、薄層層析法（TLC）、氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質譜法（GC-MS）和液相色譜-質譜法（LC-MS）等。

1.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法具有分離效能高、靈敏度高、應用范圍廣、分析速度快等特點，適合高溫不穩定、沸點高的大分子物質的分析檢測，其缺點是檢測中用到的一些有機試劑對人體有害。19世紀80年代，HPLC開始應用于蛋白同化激素的分析檢測。2008年湯艷榮[3]等介紹了另一種用于激素和抗生素檢測的新方法“超高效液相色譜法”。與傳統高效液相色譜法相比，超高效液相色譜法在速度、靈敏度及分離度方面分別是高效液相色譜法的9倍、3倍及1.7倍，但易出現假陽性結果或產生交叉反應。

1.2 薄層層析法

薄層層析法是一種快速且微量的層析檢測方法，具有高分辨能力、分析速度快、技術簡單、操作容易、結果直觀、不需昂貴儀器設備就可以分離較復雜混合物等特點。這種方法可用于復雜物的分離、提純以及含量測定，適用于殘留物的檢測。1989年VanLook[4]用薄層層析法檢測牛體內包含TRE等30多種激素，檢測限達到1～10μg/kg。

1.3 氣相色譜法

氣相色譜是20世紀50年代出現的一項分離、分析技術，具有樣品用量小、檢測速度快、靈敏度高等優點，在醫藥衛生、食品安全、競技場興奮劑的檢測等方面都有廣泛的應用。1965年，Beckett第一次用GC檢測到運動員濫用藥物；1972年，Donike[5]用氣相層析儀檢測鴉片和興奮劑類等蛋白同化激素；1991年Bagnati[6]用氣相色譜法檢測TRE等蛋白同化激素，其檢測限達到0.02～0.06μg/kg，回收率為35%～87%。

1.4 氣相色譜-質譜法

氣相色譜-質譜法是20世紀50年代開發的一種結合氣相色譜和質譜特性的分析檢測方法。該方法具有定性準確、靈敏度高等特點，主要用于鑒別揮發性和熱穩定性強的物質，是目前檢測蛋白同化激素殘留的最常見方法。GC-MS最早用于檢測蛋白同化激素是在1983年委內瑞拉舉辦的泛美運動會上。1988年，Shih Hsu[9]用GC-MS檢測牛組織中的TRE，在牛肉和牛內臟中的檢出限為0.5μg/kg。2007年，韓麗[8]用GC-MS法檢測TRE在動物組織中的殘留，定量限達1.0 μg/kg。

1.5 液相色譜-質譜法

液相色譜-質譜法可以有效分離和檢測那些不易揮發、易分解的復雜化合物，并且不需要像GC-MS進行衍生化。Hong[9]在2009年采用LC-MS檢測牛肝臟中TRE殘留，其平均回收率是62%～69%，檢測限是1μg/kg 。呂惠卿等用LC-MS測定牛奶中TRE殘留，其檢測限為0.3 μg/L，添加回收率為59.2%～90.7%。LC-MS與GC-MS比較，有效提高了檢測限，是復雜化合物檢測分析的有效手段。

色譜/質譜分析法是檢測TRE殘留的主要方法，但檢測前樣品的處理比較復雜，需要在專業實驗室由專業工作人員操作，且儀器價格昂貴，檢測所需時間較長，平均需要2 d以上，不能滿足養殖戶自檢和現場檢測的需求。

2 免疫學檢測方法

免疫分析方法（Immunnoanalysis，IA）是以抗原抗體的特異性、敏感性、可逆性反應為基本原理，以不同的抗原抗體反應載體為技術建立起來的分析方法。其優點是試樣體積小、靈敏度高、特異性強、檢測速度快、操作簡單且價格低廉，可以實現現場檢測和大批量檢測[10]。免疫學檢測方法包括酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、放射性免疫分析法（radioactive immunoassay，RIA）、膠體金免疫層析技術（colloidal gold immunochromatography assay，CGICA）和化學發光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）等方法。

2.1 酶聯免疫檢測

ELISA是一種固相吸附免疫測定技術，其原理是將已知的抗原（或抗體）包被到固相載體表面，保留包被物、酶標記物免疫活性，利用抗原抗體的特異性反應使酶與待檢物結合，然后根據酶與底物的催化顯色程度，進行定性定量測定。

2004年，Fitzpatrick J[11]等采用基于TRE多克隆抗體的ELISA法對牛膽汁中TRE的殘留進行檢測，檢測限為3 ng/mL；2010年周成林[12]等研究了TRE的化學修飾及其免疫原性的構建，并用ELISA檢測得到TRE特異性抗體，其效價為l∶3.2×105。ELISA免疫學檢測方法研究進展很快，尤其是使用了標記的抗原和抗體的分析技術，在特異性和敏感性方面都要遠遠優于經典的分析技術，這使得ELISA檢測法在生物醫學領域的應用范圍日益擴大。

2.2 放射性免疫分析法

放射性免疫分析法于1960年創立，是以放射性核素為標記物的一種免疫分析法，其基本原理是標記抗原（Ag*）和非標記抗原（Ag）對特異性抗體（Ab）的競爭結合反應，最早被用于測定糖尿病人血漿中胰島素的含量。放射性免疫分析法特異性強、靈敏度高、樣品用量少、操作簡單、精密度高，且大小分子量的物質都可以測定，在醫學上的應用十分廣泛，也常常被用來檢測蛋白同化激素的殘留量。例如，1976年加拿大奧運會上采用RIA來檢測蛋白同化激素（包含TRE）的殘留[13]。但是，RIA的缺點是使用了放射性的核素，有損工作人員的健康，且需要專業操作人員在專業實驗室進行。此外，核素還有半衰期，造成試劑盒有效期較短，有時還會出現假陽性反應和交叉反應，因此大大限制了RIA的使用性。從科技發展前景來看，放射性免疫分析技術將逐步被其他標記免疫分析技術取代。

2.3 化學發光免疫檢測

化學發光免疫分析是將具有高特異性的免疫反應與高靈敏度的化學發光系統相結合，用于抗原、半抗原、抗體、激素、維生素等定性或定量的分析檢測。2003年，Roda[14]報道了一種靈敏、快速、簡單的化學發光免疫檢測方法，該方法可以在幾分鐘內完成檢測，不僅試劑用量只有96孔酶標板的1/5，且檢測費用較低，非常適合大批量檢測。2015年，沈克強[15]用CLIA檢測TRE，TRE多克隆抗體對TRE的50%抑制濃度（IC50）和15%抑制濃度（IC15）分別為0.094 μg/L和0.00330μg/L，與傳統的酶聯免疫吸附分析方法相比,靈敏度提高了5-8倍。近年來，CLIA由于其適用面廣、特異性強、靈敏度高、所需設備簡單等優點，在實際中應用已經越來越廣泛。

2.4 膠體金免疫層析技術

膠體金免疫層析技術就是以膠體金為顯色媒介，利用免疫學原理，在層析過程中完成抗原抗體的特異性結合，從而達到檢測目的的一種方法。1971年，Faulk[16]把膠體金顆粒與兔抗沙門氏菌抗血清結合形成金標抗體，用于檢測抗原在細菌表面的分布，這標志著免疫學研究領域又增加了一種新型的有色標記物——膠體金。2007年，Liu[17]研制出一種免疫層析試紙條，這種試紙條不僅能夠快速定性，在10min內得到檢測結果；且無需設備、靈敏度高，可以用肉眼直觀判定陰性/陽性結果，非常適用于現場的快速檢測。隨著免疫層析技術的快速發展，其在疾病診斷、食品安全、藥物檢測等領域將得到更加廣泛的應用。

2.5 蛋白芯片技術

蛋白芯片技術是一種微型、靈敏度高、特異性強的新興技術。原理是把已知蛋白固定在玻璃等載體上，形成高濃度的分子排列，當芯片上的探針分子與標記物的靶分子結合后，通過激光共聚焦掃描或光耦合元件（CCD）對標記信號的強度進行檢測。2009年，Kloth[18]把蛋白芯片技術應用到食品中藥物污染的檢測中。

3 展望

目前在TRE的檢測方法中，氣相色譜法、液相色譜法等理化檢測方法是定量法，酶聯免疫吸附測定等免疫學檢測方法是篩選法。但隨著TRE高靈敏度、高親和力的單克隆抗體的獲得，免疫學檢測結果與理化檢測方法的相關度越來越高。免疫學檢測方法與理化檢測方法相比具有操作便捷、節約時間、費用低廉、攜帶方便等優點，在TRE殘留的檢測中擁有更廣闊的發展空間，特別是膠體金免疫層析技術和蛋白芯片技術已經成為TRE殘留檢測技術的發展方向和研究熱點。