通過調節蛋白酶K消化時長優化DNA提取方法

吳松芳，陸宜雋

（1.上海市徐匯區中心醫院，上海 200031；2.上海市位育中學，上海 200231）

蛋白酶K在多種環境下都能夠具有一定的活性，同時化學性質也較為穩定，因此在生物工程中的應用較為廣泛。蛋白酶K可以用來進行DNA提取操作，也可以用于對蛋白的修飾。由于蛋白酶K屬于酶類的一種，其活性相對較高，可以用于對蛋白的降解。另外，DNA提取是生物工程和生物技術中較為常用的一種重要的操作，應該采用重要的方法和措施保證DNA提取的質量，保證生物工程的質量。利用蛋白酶K進行DNA的提取就是重要的方法之一，并可以通過調節蛋白酶K的消化時長，從而對DNA的提取過程進行干預，這樣能夠在很大程度上提高DNA的提取質量，本文對此進行了較為詳細的分析。

1 DNA提取概述

1.1 DNA提取原則

采用物理及化學方法提取組織DNA，主要遵循以下提取原則：(1)保證核酸一級結構的完整性；(2)保證其他生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的污染應降低到最低程度；(3)核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；(4)其他核酸分子如RNA等，也應盡量去除。

1.2 DNA提取原理

較為常見的是研溶法提取DNA。首先研磨破壞細胞壁和細胞膜，使得核蛋白和RNA釋放出來；再利用DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液而RNA溶于0.14mol/L的NaCl溶液的性質，將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品破碎細胞液中分開；最后將蛋白的雜質除去。

1.3 DNA提取鑒定方法

1.3.1 分光光度法

在260nm和280nm處測定DNA溶液的光吸收，A260與A280之比應在1.75-1.80之間。低于此值表明制備物中殘留蛋白質成分較高或含有酚，高于此值表明有RNA的殘留。

1.3.2 凝膠電泳分析

影響瓊脂糖凝膠電泳DNA遷移率的因素：①DNA分子大小，DNA分子越大遷移速度越慢。②遷移率與瓊脂糖濃度成反比。③DNA構象：a.相同分子量的超螺旋環狀（Ⅰ型），切口環狀（Ⅱ型），線狀（Ⅲ型）DNA，以不同速率通過凝膠。b.一般情況下，遷移率Ⅰ型＞Ⅲ型＞Ⅱ型。④電壓：遷移率與所加電壓成正比，但是電壓過大有效分離范圍減小。⑤電場方向：單一方向速率均等，改變方向，極大分子DNA遷移更慢。通過脈沖電場凝膠電泳分離極大DNA。

在DNA提取的過程中，為了保證DNA的提取質量，應該遵循一定的原則[1]。DNA提取的原則相對較多，應該對各種原則合理準確把握，保證DNA的提取質量符合相關的要求，對于DNA標本指的是標本的采集、標本的保存、標本的運輸。實驗前的質量控制是整個基因檢測后續運行的保障，其中任何一環出現問題都將影響后續實驗的運行，甚至讓實驗無法進行。DNA提取實驗是將合格樣本的DNA提取出來的一系列操作，實驗中質量控制是DNA提取的核心。

此外，DNA提取全程都要注意防止樣品污染（環境與樣品的污染和樣品與樣品的污染），這將關系到實驗結果的可信度。在DNA提取的實驗后，則是對DNA的保存。DNA的完整保存可以用于進行聚合酶鏈式反應（PCR），進行特殊DNA片段的體外擴增，從而制造特定的DNA序列滿足特定反應。DNA的保存是對PCR的完善[2]，可以隨時查找樣本DNA進行DNA擴增。一般DNA提取出來后，根據特定的DNA應用進行不同程度的保存，制備保存液進行保存內置DNA保存液，短期內使用將放置于4℃進行保存，長期保存將放置于-20℃下進行保存，減緩DNA降解速度。

2 蛋白酶K的反應原理及消化時長

蛋白酶在生物工程中具有重要的應用，是一種常用的酶類，尤其在DNA的提取操作中具有重要的應用。蛋白酶的種類也很多，可以應用在不同的場合中，同時不同酶的反應原理和作用原理也存在一定的差異，對此應該進行差別對待。有些酶是從內部將蛋白質分子切斷，從而實現對DNA的提取，而有些酶則是將蛋白質分解為各個游離的分子，這樣也可以實現對DNA的提取[3]。

另外，采用蛋白酶在DNA的提取中，蛋白酶的反應時長對于DNA的提取具有較大的影響，對此應該重點加以對此。在實際的DNA提取中，可以通過調整和改變蛋白酶的相應的消化時長，從而實現對DNA提取過程中的干預，達到提高相應的提取質量。蛋白酶K是由多種氨基酸所組成的，并具有兩個不同的結合點，這樣的分子結構也決定了這種蛋白質的化學性質較為穩定，也使得蛋白酶K能夠在多種場合中都能得到廣泛的采用。目前，蛋白酶K醫藥、食品等行業中得到了較為廣泛的應用，制備不同材料以應用到各領域中。對于改善相應的勞動環境也具有一定的價值。

蛋白酶對于保證的環境和反應的環境也具有一定的要求，對此在實際的操作過程中，應該加以注意。對于培養基的選取，應該充分保證培養基的溫度在合理的范圍內，同時培養液的pH值也要在一定的范圍之內，這樣才可以發揮出蛋白酶的相應作用，同時也有利于蛋白酶在生物工程中的實際應用。隨著生物技術的不斷發展，蛋白酶的產量已經有了較大的提高，也具有相當的市場。

3 DNA提取的優化方法

3.1 常見的DNA提取方法

在提取DNA的過程中，蛋白酶K的消化時長對于DNA的提取質量有著直接的影響，應對蛋白酶K的消化時長進行合理控制，達到成功提取DNA的目的。DNA提取是基因克隆等研究的第一步，現有的方法主要是CTAB方法，此外還可以采用不同的方法，如玻璃珠法、研磨法、凍融法等物理方式，異硫氰酸胍法、堿裂解法等化學方式，酶法等生物方式。根據核酸分離純化方式的不同，有硅質材料、陰離子交換樹脂等。這些方法種類繁多，提取質量各有不同，還不能完全滿足使用需求。通過調節蛋白酶K的消化時長，可以很好地優化DNA的提取，提高DNA的提取質量，保證DNA提取具有較高的純度，同時DNA自身也沒有受到損壞。

在現代疾病診斷中，核酸占據著非常重要的地位，其中DNA的作用更顯突出，而血液跟組織則是獲取的DNA重要來源。但是，組織提取與血液提取相比較而言，采集動物組織操作簡單、不需要抗凝劑，便于保存和攜帶運輸。所以組織提取DNA更具優勢。但在PCR分子診斷過程中，獲得的DNA的總拷貝數和質量會直接影響到后續檢驗實驗的結果，所以，獲得有效、可靠的DNA是PCR分子診斷的關鍵。雖然傳統的液氮研磨和酚氯仿提取核酸的方法能夠獲得質量較好的核酸，但是其中用到的化學物質卻有著一定的毒性，而且整個提取過程耗時較長，浪費大量的時間和人力物力。進一步來說，現在普遍使用的柱提法核酸提取試劑也能獲得質量很好的核酸，毒性也可以忽略，但是耗費的時間長。除去毒性和時間的因素以外，這兩種試劑提取核酸的操作當中免不了各種洗滌液的添加和丟棄，這個過程極其容易導致樣本之間的交叉污染。當樣本量較多的情況下，還容易出錯，致使工作效率低下。

3.2 DNA提取的影響因素

蛋白酶K的應用范圍較廣，應用于各種生物材料制備工程中能夠在不用的生物工程中都能得到應用，也是重要的蛋白酶類，同時該種酶的活性也十分高，在生物學中具有重要的價值和意義，此外能夠分解多種不同的蛋白質，在采用蛋白酶進行DNA的提取中，首先應該分析各種可能影響DNA提取質量的影響因素，之后對DNA提取的質量進行分析。在分析出各種不同的影響因素之后，應該對各個因素進行采用合理的措施加以處理，保證DNA的提取質量，這樣在生物工程中也具有一定的意義。DNA的提取質量受到影響的因素通常也相對較多，如設備、提取方式都會影響到實際的DNA的質量，故應該對DNA的提取加以重視，這樣才可以保證DNA的提取質量。目前，采用蛋白酶對DNA提取的技術也相對較為成熟，可以在實際的工程中加以推廣。蛋白酶K在高溫(達65℃)和寬pH范圍（pH7.5～12.0）具有高穩定性。在脲、SDS等變性劑存在下其活性得以提高。上述性質使得蛋白酶K在要求非特異性蛋白質降解的生物技術領域中具有很好的應用，特別是從粗提取液中分離核酸（DNA或RNA）以及在DNA分析中預制備樣品，另外蛋白酶K也可應用于蛋白質分析領域，例如結構釋析。其中，用于DNA提取的試液包括鹽酸胍、乙二胺四乙酸二鈉、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸和2-丁氧乙醇，pH值為6.8～7.2。本發明所述的洗滌液能夠廣泛去除不同植物在基因組純化過程中的多糖、多酚等污染，提高純化所得DNA的純度與濃度，有利于下游應用，提高檢測靈敏度。

3.3 DNA提取的優化方法

DNA的提取方法較多，不同的提取方法具有不同的特點，對此應該合理差別化對待。采用蛋白酶K進行DNA的提取，其反應的原理不復雜，一般是通過蛋白酶進行反應，從而將DNA加以分離將DNA分解出來，實現對DNA的提取。但蛋白酶不同的反應時長，對于DNA的提取具有較為顯著的影響，對此應引起重視，同時在實際的DNA提取操作中，也可以通過調整和改變時長，通過采用不同的反應時長，達到對DNA提取操作過程中的實際控制，提高對DNA提取的實際控制。蛋白酶K應在真空或37℃溫箱或室溫干燥，加TE緩沖液20μL。溶解后，取3～8μL 用于PCR擴增，或放-20℃保存，具有良好的重復性與穩定性。但操作繁復，技術要求高。用于蛋白酶K保存的緩沖液，所述緩沖液中，除水外，還包括下列組分：Tris 10 mmol/T-500 mmol/LCa2+2 mmol/L-50 mmol/LHCl調節pH值至7.5-8.4，甘油30%～60%。在提取DNA時，可以通過調節蛋白酶K的消化時長，以提高對DNA的提取質量。

4 結語

隨著生物技術的不斷發展，生物產品的質量也會得到較為明顯的提高，本文主要對DNA的提取進行了分析。在DNA的提取過程中，采用不同的提取方法對于提取的DNA的產品質量具有較為明顯的影響，當采用蛋白酶K對DNA進行提取時，應該對蛋白酶的消化時長進行控制，保證DNA的提取具有較高的質量，這樣才可以達到對DNA成功提取的目的，保證產品的質量符合相關的要求。

蛋白酶K在生物工程中具有重要的應用，在DNA的提取中常采用蛋白酶K進行輔助操作。在提取DNA時，如不加蛋白酶K的話細胞是很難裂解釋放DNA的，DNA濃度會很低，除非使用煮沸法或超聲破碎法，本文對通過調節蛋白酶K消化時長進行DNA提取的方法進行了詳細的分析，對于提高DNA的提取工藝具有一定的價值。