重建人類免疫系統的人源化小鼠模型及其在血液系統疾病研究中的應用*

龍 杰 楊志剛

(1. 廣東醫科大學，湛江 524023)(2. 廣東醫科大學附屬醫院，湛江 524001)(3.廣東省實驗動物監測所，廣州 510663)(4.廣東醫科大學附屬湛江中心人民醫院，湛江 524045)

實驗動物學在醫學研究中發揮重要作用，實驗動物模型可以用于模擬人類疾病發病以及藥理學實驗研究。其中靈長類動物在遺傳學上與人類接近，曾在醫學研究中有著舉足輕重的地位，但由于靈長類動物價格昂貴及存在倫理學方面的限制，近年來逐漸減少在醫學研究上的應用。小鼠作為實驗動物的歷史源遠流長，但小鼠的遺傳學背景與人類相差較大，為解決該問題，研究人員將人類細胞或組織植入免疫缺陷小鼠體內構建免疫系統人源化小鼠模型及人源化小鼠疾病模型，在這種人源化的小鼠動物模型中進行的研究更能模擬人類免疫系統及人類疾病實際情況。

1 免疫系統人源化小鼠模型的建立及優化

1.1 人源造血干細胞來源的選擇

根據造血干細胞不同的起源部位，可分為胎肝造血干細胞、骨髓造血干細胞、粒細胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)動員的外周血造血干細胞、臍帶血造血干細胞。其中，胎肝造血干細胞來源于胎兒，人類胎兒肝臟在妊娠第10周至第20周的大部分時間里是主要的造血器官。Kuchma等[1]在免疫表型的研究中，發現胎肝比臍帶血含有更豐富的人類造血干祖細胞。Roncarolo等[2]從胎肝中獲得的HSC免疫原性較弱，植入人類白細胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)不匹配的胎兒中也不會產生移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease，GVHD)。Lepus等[3]在幾個不同品系的免疫缺陷小鼠身上比較胎肝、臍帶血、成人外周血來源的造血干細胞的植入率，結果表明，胎肝來源的CD34+造血干細胞植入率最高。但胎肝來源于流產的胎兒，各項病原學陰性的流產胎兒的肝臟才成為收集的對象，另外，目前胎肝干細胞庫極少，并且，胎肝的應用存在一些倫理相關的問題，使其在應用上受到較大的限制。

與胎肝相比，臍帶血的來源更豐富、采集更方便，采集過程對母嬰均無危害，也不存在應用胎肝造血干細胞所產生的倫理問題。臍血中T淋巴細胞數較少且較原始，使用HLA不匹配的臍帶血造血干細胞移植后GVHD發生率低[4]。這些優點都是骨髓和外周血來源的造血干細胞所不具備的。

造血干細胞選擇時，還要考慮T細胞的植入有產生GVHD的風險。但是，另一方面，適量的T細胞又具有促進移植物植入的優點，這在人類造血干細胞移植領域已經得到了證實[5]。Hexner等[6]分別在等劑量臍帶血單個核細胞與去除T細胞的臍帶血單個核細胞中，加入了抗CD3/CD28單克隆抗體刺激T細胞增殖，然后注入NOD/SCID-β2m-/-小鼠體內。結果表明，未去除T細胞組人源CD45+細胞的植入率明顯比第二組高(5.94%±1.65% VS 0.29%±0.79%)，證明了在小鼠體內人源臍帶血中T細胞有克服免疫屏障促進植入的作用。Hayakawa等[7]用CD34+分選的臍帶血單個核細胞與未分選的臍帶血單個核細胞分別經白消安預處理后輸注入NSG(NOD/SCID/IL-2Rγnull)小鼠體內比較，發現CD34+分選的臍帶血單個核細胞組植入率明顯高于其他組，且植入率長期維持在高水平狀態。所以，目前主要選擇臍帶血CD34+單個核細胞進行人源化小鼠模型的研究。

1.2 免疫缺陷小鼠的選擇

小鼠的異種造血干細胞移植如同人類同種異基因造血干細胞移植一樣，供者干細胞的植入需克服受者的免疫屏障，而這些免疫屏障就是受者本身的免疫狀態，受者免疫缺陷程度越高，更利于供者的細胞植入[8]。基于上述理論，人源化免疫小鼠通常選擇免疫缺陷小鼠。

利用免疫缺陷小鼠進行人源化小鼠的研究經歷了幾個階段。最早發現的免疫缺陷小鼠是裸鼠，由于foxn1基因的缺陷導致該小鼠胸腺發育受損[9],從而沒有成熟T細胞產生導致該小鼠T細胞依賴的免疫排斥幾乎消失。但人源免疫細胞依然無法在該小鼠體內生存[10]。

1983年，研究人員發現C.B-17純系小鼠16號染色體上的重癥聯合免疫缺陷(Severe combined immunodeficiency,SCID)基因發生隱性突變后,小鼠缺乏功能成熟的T和B淋巴細胞,由此得到了SCID小鼠[11]。1988年，Mccune等[12]用SCID小鼠植入人胎肝干細胞、胎胸腺、胎淋巴結，可使人源T細胞和B細胞重建。但由于SCID小鼠的免疫缺陷程度不高，體內殘留較多NK細胞及部分T細胞和B細胞，人源免疫細胞重建水平不高。由于SCID小鼠對放射高度敏感，為降低放射敏感性，有學者通過敲除Rag1[13](Recombinant activating gene)或Rag2[14]基因產生Rag-/-小鼠。Rag1和Rag2基因在TCR的重排和抗體生成方面發揮重要作用，是T細胞和B細胞成熟所必需的基因，因此，Rag1-/-小鼠及Rag2-/-小鼠均缺乏功能成熟的T細胞和B細胞，但是也因它們的高NK細胞活性阻礙了人源細胞的植入[15-16]。

隨后通過NOD(Non-obese diabetic)背景小鼠與SCID小鼠回交得到免疫缺陷程度更高的NOD/SCID小鼠[17]。這種小鼠的特點除了T細胞和B細胞等免疫細胞的功能喪失以外，還影響了部分NK細胞的功能，所以免疫缺陷程度比前述的小鼠更高。楊海燕等[18]利用臍帶血CD34+單個核細胞注入TBI預處理的NOD/SCID小鼠，在第8周行流式細胞術檢測，發現人源CD45+細胞植入達到(12.34 ±2.38)%，遠高于Lewis等[19]定義的0.5%的植入標準。但NOD/SCID小鼠隨著年齡的增長，會出現“免疫滲漏”，即部分T和B細胞的功能恢復，且本身仍有NK細胞功能殘留，使得其植入效率不高。

在此基礎上，使NOD/SCID小鼠編碼白介素2受體γ鏈的基因發生無效突變，產生NSG[20](NOD/SCID/IL-2Rγnull)小鼠。因為該受體的γ鏈是白介素2、白介素4、白介素7、白介素9、白介素15、白介素21等細胞因子的共同受體，所以該基因的突變導致NK細胞成熟障礙和功能喪失，并且消除了T和B細胞的免疫滲漏現象，使得小鼠的免疫缺陷程度更高。McDermott等[21]比較了NSG小鼠與NOD/SCID等品系的小鼠外周組織的人源細胞植入率，結果表明，NSG小鼠和NOG(NOD/Shi-scid /IL-2Rγnull)小鼠明顯比NOD/SCID等品系小鼠的人源細胞植入率要高，而NSG小鼠在骨髓中人源細胞的植入率比其它品系的小鼠要高，雌性尤甚，所以NSG小鼠是目前人源化小鼠模型的最佳受鼠。

1.3 預處理方式的選擇

預處理是輸入人源細胞前的附加處理方式，目的是：1.產生骨髓抑制從而騰空骨髓龕及負反饋刺激造血再生，促進造血干細胞歸巢骨髓龕并自我更新、增殖及分化[22]；2.產生免疫抑制預防移植物被排斥，這些作用都有利于人源細胞植入。由于目前接受移植的小鼠主要為NOD/SCID小鼠等免疫缺陷鼠，本身由于缺乏T細胞和B細胞等免疫細胞已產生明顯免疫抑制，所以預處理的策略主要是使小鼠產生骨髓抑制[23]。

傳統小鼠移植的預處理方式有全身射線輻照(Total body irradiation， TBI)等，預處理后，人源細胞植入率比沒有接受預處理的組別要高。其主要原因是使受者體內基質細胞衍生因子(Stromal cell-derived factor-1，SDF-1)、干細胞因子(Stem cell factor,SCF)等細胞因子水平的升高，SDF-1[24]是C-X-C 趨化因子受體4[25](C-X-C chemokine receptor type 4, CXCR4)的配體，在人鼠之間可以發生交叉反應[26]，而人源造血干細胞表面表達CXCR4分子，通過CXCR4—SDF-1軸可以使經尾靜脈注入的人源造血干細胞定向歸巢到骨髓里，人源造血干細胞只有歸巢到骨髓環境里才能自我更新、增殖及定向分化。SCF[27]是干細胞生長因子，主要生理作用是促進早期造血前體細胞的增殖和分化，Zheng 等[28]利用重組人SCF與臍帶血CD34+細胞體外培養植入NOD/SCID小鼠體內的植入率明顯比未經處理的臍帶血CD34+細胞的組別要高。這些細胞因子、趨化因子的水平的上升可以使外源性人源細胞的植入率增高。傳統的以TBI為主要手段的預處理策略的弊端是小鼠的死亡率較高，小鼠的生存條件要求苛刻，需嚴格的無菌環境和配備獨立通氣籠(Individual ventilated Cage，IVC)，TBI設備需遠離小鼠飼養的場所等，這些都使得人源化小鼠模型應用受到限制。

白消安是一種烷化劑，較早前已應用在人類骨髓移植上，它的特點是強烈的骨髓抑制作用但免疫抑制作用較弱[29]，其作用與TBI相似，但高劑量的TBI常導致高死亡率，而低劑量的TBI導致人源細胞植入率不高。Robert-Richard 等[23]在NOD/SCID小鼠回輸人源造血干細胞前分別用白消安及TBI作預處理的比較，結果表明SRC(scid repopulating cells)數目沒顯著差異。Choi 等[30]發現接受2.4Gy劑量TBI的NSG小鼠組第24周的存活率只有33%，而接受20 mg/kg 和30 mg/kg單劑量的白消安的NSG小鼠組第24周的存活率是100%。接受30 mg/kg單劑量的白消安的NSG小鼠組重建人源B細胞亞群的程度比接受2.4Gy劑量TBI的NSG小鼠組高，而接受40 mg/kg單劑量的白消安的NSG小鼠組在7周內全部死亡。也有研究報道相隔24 h給予兩次25 mg/kg劑量的白消安預處理在NOD/SCID小鼠[31]和在NSG小鼠[22]上都達到最佳人源細胞植入率。使用白消安預處理的小鼠存活率高，不需要極度嚴格要求的小鼠飼養環境，操作簡便，近年來逐漸取代TBI，成為小鼠移植研究的主要預處理方式。

1.4 輸注造血干細胞方式的選擇

目前使用最廣泛的輸注造血干細胞的方式是小鼠尾靜脈注射，這種方式主要特點是便于操作，但造血干細胞經尾靜脈進入血液循環后大多數的造血干細胞都被滯留在外周器官，僅有少數造血干細胞在各種趨化因子等介導下歸巢骨髓。Yahata等[32]比較骨髓腔內輸注與尾靜脈輸注兩種方法，發現經骨髓腔內注射產生的SRC是經尾靜脈注射的15倍，因為骨髓腔內輸注造血干細胞避開了各種外周器官滯留及各種細胞因子、趨化因子等因素的影響而直接歸巢骨髓。但骨髓腔內注射技術要求較高，注射成功率不高，目前在做人源化小鼠各方面研究時兩種方法均有研究人員使用。

2 人源化小鼠模型在血液疾病上的應用

2.1 人源化小鼠在研究GVHD上的應用

GVHD是異基因造血干細胞移植后非復發死亡的主要原因之一，目前GVHD的發病機制仍未完全明確及治療手段有限[33]，所以，利用人源免疫細胞注入免疫缺陷小鼠，并在此基礎上誘導出GVHD對其發病機制的研究及指導臨床治療意義重大。

利用人源細胞注入免疫缺陷小鼠構建異種GVHD模型已有多年歷史。大約30年前，Mosier等[34]率先利用人的外周血單個核細胞腹腔注射入經TBI預處理后的SCID小鼠體內，成功誘導出類似GVHD樣的癥狀。但這種方法誘導的GVHD的發病的異質性很大，需大量的外周血單個核細胞誘導，經腹腔注射的方式也不能模擬人類骨髓造血干細胞移植，因為所有的骨髓造血干細胞移植都是經靜脈輸注的。

隨著Rag-/-γC-/-小鼠的出現，Van Rijn等[35]第一次利用靜脈注射30×106個人外周血單個核細胞到Rag-/-γC-/-小鼠內誘導出GVHD，但仍需要大量的單個核細胞及TBI預處理。

Ito等[36]利用NOG小鼠、NOD/SCID小鼠及Rag2nullIL-2Rγnull小鼠進行比較，結果表明，NOG小鼠輸注人源外周血單個核細胞后誘導GVHD的發病時間最快，死亡的時間較統一，當使用10×106個人源外周血單個核細胞移植時，只有NOG小鼠在沒有使用TBI預處理的情況下能誘導出GVHD。King 等[37]的研究發現，在使用5×106個人源外周血單個核細胞情況下，所有NSG小鼠在2Gy劑量的TBI預處理后都能誘導出GVHD樣的癥狀。

綜上述，通過將人源外周血注入預處理或未預處理的免疫缺陷小鼠體內，可誘導出GVHD樣癥狀，小鼠的免疫缺陷程度越高，誘導出GVHD需要的人源外周血細胞數量就越少。

目前，人源化GVHD小鼠模型主要應用在研究GVHD的發病機制及開發臨床新型治療藥物。Wu等[38]通過尾靜脈高壓注射質粒的方法，把人類IL-21基因導入BRG(BALB/c-Rag2-/-IL-2Rγnull)小鼠的基因組中，然后分別利用人源外周血單個核細胞注入轉基因表達人類IL-21的BRG小鼠和對照組的BRG小鼠，在移植后第6天發現轉基因表達人類IL-21小鼠脾臟聚集大量的CD19+的細胞，并觀察轉基因表達人類IL-21的BRG小鼠死亡時間明顯縮短；同時將去除供者B細胞單個核細胞注入BRG小鼠，長達25天內沒有GVHD癥狀，結果表明IL-21和B細胞可能參與GVHD的發病，靶向供者B細胞的治療有可能成為預防和治療GVHD的一種新方法。也有Ito等[39]分別利用CD4+人源外周血T細胞和CD8+人源外周血T細胞注入NOG小鼠，結果發現，只有注入CD4+人源外周血T細胞的NOG小鼠發生嚴重的皮膚GVHD；然后利用CD8+人源外周血T細胞與至少0.5×106個CD4+人源外周血T細胞一起注入NOG小鼠，或者CD8+人源外周血T細胞直接注入轉基因表達人類IL-2的NOG小鼠內，都能誘發嚴重的皮膚GVHD，結果表明CD4+細胞可能通過IL-2的信號通路促進CD8+細胞植入和擴增，并證實皮膚GVHD的病理結果是由TH17細胞分泌的IL-17和IFNγ所介導的，使用抗IL-17抗體可明顯減輕皮膚GVHD。

雖然人源化GVHD小鼠模型為人類造血干細胞移植后產生的GVHD的發病機制和治療提供了新思路。但由于種屬差異性，異種移植產生GVHD的發病機制不完全等同于同種移植。于是，Covassin等[40]將HLA-DR4陰性供者的人源CD4+外周血單個核細胞注入缺失小鼠MHC分子及轉基因表達HAL-DR4的NSG小鼠中，可構建同種異基因GVHD模型。這種GVHD小鼠模型比異種GVHD小鼠模型，更好地模擬人類GVHD的發病。

2.2 人源化小鼠在研究白血病上的應用

白血病是血液系統最常見的腫瘤之一，該病的預后與白血病細胞的形態、免疫分型、遺傳學、分子生物學等因素有很大的相關性，且異質性很大。因此建立一種穩定的人源化的白血病小鼠模型對于抗白血病藥物研發及白血病的免疫治療具有重要意義。

縱觀白血病人源化小鼠模型的歷史，最早使用裸鼠行白血病模型研究。Potter等[41]使用HL-60細胞系皮下注射經環磷酰胺預處理的裸鼠內，能夠在裸鼠局部長出急性早幼粒細胞肉瘤。但這種動物模型的白血病表現與人類白血病相差較大，應用意義不大。

1989年，Kamel-Reid等[42]使用急性淋巴細胞白血病細胞系注射入SCID小鼠內，成功重建白血病小鼠模型。這種小鼠模型中的白血病細胞在各器官的分布與兒童急性淋巴細胞白血病類似，基本重現了白血病細胞的生物學行為，對白血病的生長和發展的研究有一定幫助。但這種白血病細胞系無法保留腫瘤的異質性，為了體現出腫瘤的異質性，Uckun[43]使用患者來源的高危B細胞譜系急性淋巴細胞白血病細胞注入SCID小鼠內，結果表明，白血病細胞在SCID小鼠內生長越快，患者的預后就越差。

隨后，Steele等[44]將19例患者來源的急性T淋巴細胞白血病細胞注射入SCID小鼠內，只有12例白血病細胞能在小鼠內生長，且進展的速度與患者的預后相關；剩余未能在SCID小鼠內生長的7例白血病細胞，再次注射入NOD/SCID小鼠體內，均能在小鼠內生長，但進展與患者預后無相關性。結果表明，小鼠免疫缺陷程度越高，白血病細胞越容易植入，但白血病細胞在NOD/SCID小鼠內的進展不能作為患者預后的一項指標。

為了進一步提升人源白血病細胞的植入率，也隨著免疫缺陷小鼠的發展，有學者逐漸使用NSG小鼠等新一代免疫缺陷小鼠行人源化白血病小鼠模型研究。Diamanti等[45]利用NOD/SCID小鼠及NSG小鼠分別注入兒童患者的急性淋巴細胞白血病細胞，并比較了這兩種品系小鼠之間的白血病細胞植入率，結果表明，不管患者的白血病亞型及危險度分層如何，NSG小鼠的白血病細胞植入率是NOD/SCID小鼠的1.2～7.7倍。Woiterski J等[46]將200多只NSG小鼠分別注入54名原發兒童急性白血病患者來源的骨髓細胞，結果表明，植入中位時間為7～10周，90%的小鼠植入，雄性小鼠比雌性小鼠具有顯著更高的植入水平，NSG小鼠的植入水平及總生存時間與患者白血病危險度分層有關。

人源化白血病小鼠模型主要應用在臨床前藥物試驗及研究白血病的發病機制。Her 等[47]利用新生的NSG小鼠經肝內注入FLT3突變的急性髓系白血病細胞，成功建立白血病小鼠模型，并行索拉菲尼、瑞戈非尼臨床前藥物試驗。Willmann等[48]利用NSG小鼠植入CD34+分選的慢性粒細胞白血病細胞，成功建立慢性粒細胞白血病動物模型，并在其基礎上評價伊馬替尼、尼洛替尼、維達列汀等藥物療效。.這種疾病模型雖然可以行藥物篩選實驗，但不能反映人類白血病的發病情況。

為了解決這一問題，Trivial等[49]和Tezuka等[50]以病毒為載體將白血病致病基因導入人類造血干細胞，進一步在免疫缺陷小鼠中誘發白血病的人源化小鼠模型逐漸發展起來。這種模型彌補了上述小鼠模型在白血病發病機制研究上的不足。

3 小結與展望

人源化小鼠是一種很好的反應人類的免疫系統及某些疾病狀態的工具。通過對人源造血干細胞來源、免疫缺陷小鼠品系、預處理方式等各方面因素的優化，可能建立一種免疫系統人源化程度較高的小鼠模型。過去的10余年人源化小鼠在血液學、免疫學等方面取得了令人矚目的進步，多種人源化小鼠模型可以直接對人類疾病進行模擬，這在以前的免疫缺陷動物身上是不可能完成的。

但是，目前的人源化小鼠模型仍有幾方面的不足之處。首先，人源化小鼠模型的免疫缺陷小鼠的體內環境與人類的體內環境存在差異；其次，人源造血干細胞分化出來的各種免疫細胞存在不完整、不成熟、細胞間的接觸不足等劣勢。為了解決這些存在的問題，目前正在嘗試研究出可以在免疫缺陷小鼠體內促進人源造血干細胞定向分化、成熟的基因工程方法，可能產生更適合應用于醫學研究的人源化小鼠模型。