牛磺酸提取及檢測方法的研究進展

謝昭鵬,姚昱錕,劉斌雄,陳小藝,方 婷

(福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002)

牛磺酸(Taurine)是一種含硫的β-氨基酸,其化學名稱為2-氨基甲烷磺酸(NH2CH2CH2SO3H),于1872年因最先從牛膽汁中發現而得名。牛磺酸不參與蛋白質的生物合成,其化學結構中不含羧酸部分,而是由一個磺酸基取代,以自由狀態遍及生物體內的各類組織、器官[1-3]。研究發現,牛磺酸是維持生物體機體正常生理活動的重要活性物質,它可調節多種細胞功能,包括抗氧化、滲透調節、神經調節、抗炎癥以及保持細胞的穩定性[4-5]。牛磺酸被認為是治療慢性炎癥和感染的潛在藥物,因為它對心血管系統、免疫系統、神經系統和消化系統有一定的保護和治療作用[6-7]。

人體除通過膳食攝入牛磺酸外,還可自身生物合成,主要途徑是蛋氨酸和半胱氨酸代謝的中間產物半胱亞磺酸經半胱亞磺酸脫羧酶(CSAD)脫羧成亞牛磺酸,再經氧化成牛磺酸。人類CSAD的活性較其他哺乳動物低,可能自身牛磺酸的合成能力也較弱[8]。牛磺酸在動物中的含量遠高于大部分的植物,其中海洋生物是牛磺酸的天然寶庫,特別是貝類、螺類等軟體動物,其牛磺酸含量十分豐富[9]。

本文簡要概述了牛磺酸的生物活性功能及其在海洋生物中的分布情況,對現有的天然牛磺酸的提取檢測技術進行介紹分析,為未來天然牛磺酸的研究方向及其提取、檢測技術的研究開發提供了一些新思路。

1 牛磺酸的生物活性功能

1.1 牛磺酸對中樞神經系統的影響

牛磺酸是存在于中樞神經系統中最豐富的一種游離氨基酸,在大腦發育過程中有神經營養因子、神經保護因子的作用[3]。牛磺酸缺乏會導致大腦發育受阻,智力低下。早產兒腦中的牛磺酸含量明顯低于足月兒,生長受限胎兒在產前補充牛磺酸能夠顯著促進其腦發育、白質纖維發育及髓鞘化[10-12]。歐美等一些發達國家早已經明確規定,嬰幼兒食品(如奶粉等)中必須添加牛磺酸。研究表明,適當補充牛磺酸可以提高學習記憶速度及準確性,并且有效延緩神經系統的衰老程度[13-14]。

1.2 牛磺酸對視覺系統的保護作用

牛磺酸約占視網膜中氨基酸總量的一半,促進光感受器營養發育,在防止神經節細胞(RGC)凋亡,減少青光眼的視神經傷害的同時,有促進視神經再生的功能[15-16]。牛磺酸是晶狀體內重要的非酶系統抗氧化劑,有調節晶體滲透壓和抗氧化等功能,保護晶狀體免受氧化損傷,晶狀體透明性受兔晶狀體上皮細胞影響,牛磺酸可抑制其凋亡,延緩白內障疾病的發生[17-18]。此外,牛磺酸還可以提高角膜的修復能力。

1.3 牛磺酸對肝膽系統的作用

在肝臟中,膽固醇轉化成膽汁酸,牛磺酸能和膽汁酸結合生成牛黃膽酸,牛磺膽酸能促進脂質和膽固醇溶解,利于膽汁循環,有益于人體對脂類的吸收,抑制膽固醇結石的形成[19]。牛磺酸可以保護肝細胞膜,降低膜通透性,減少谷丙轉氨酶(GPT)、谷草轉氨酶(GOT)的釋放,當肝臟發炎或者受到機械損傷時,天然牛磺酸能顯著抑制肝星狀細胞(HSC)增殖,能夠治療肝纖維化[20-22]。研究發現,牛磺酸可加快“乙醇/乙醛→乙酸”的代謝反應的進行,提高機體抗氧化和清除氧自由基能力,以此治療酒精所造成的肝損傷[23]。此外,牛磺酸能治療因攝入神經毒素-鋁而造成的小鼠肝毒性[24]。

1.4 牛磺酸對心血管系統的作用

哺乳動物的心肌中總游離氨基酸總量的一半是牛磺酸[3],心血管系統中的牛磺酸作用靶點多而廣,因此其作用機制復雜,外源性攝入補充牛磺酸,能夠治療多種心血管疾病[25-26]。牛磺酸能保護血管內皮,改善其功能障礙,如通過與高同型半胱氨酸(Hcy)競爭結合受體/載體,抑制其對人臍靜脈內皮細胞(EC)造成的損傷[27],此外能顯著抑制血管平滑肌細胞(VSMC)的增殖和鈣化,有效預防高血壓、延緩動脈硬化的發生[28]。

1.5 牛磺酸對內分泌系統的影響

1.5.1 防治糖尿病 胰島β細胞功能紊亂是引起糖尿病的主要原因之一,患糖尿病的機體內氧化應激增強,而胰島β細胞的抗氧化能力相對較弱,容易受到影響,減少胰島素釋放[29-30]。研究發現,胰島β細胞中存在牛磺酸生物合成關鍵酶—半胱亞磺酸脫羧酶(CSD)表達,牛磺酸作為抗氧化劑,通過降低氧化應激反應,保護胰島β細胞,促進胰島素的釋放,以此達到降血糖的作用[31-32]。牛磺酸對糖尿病患者的肝毒性、血管問題和心臟損傷有較好的治療作用,能夠減輕糖尿病及其并發癥的癥狀[33]。

1.5.2 維持正常生殖功能 動物的乳腺及雄性生殖器官也存在半胱亞磺酸脫羧酶(CSD)表達,可生物合成牛磺酸,研究發現牛磺酸能夠抑制睪丸組織細胞凋亡,保護生殖細胞免受損害,維持睪丸正常的結構和功能,增強性能力[23-34]。此外,牛磺酸通過抗氧化能力使精子免受氧化損害,提高其生存能力[35]。

1.6 其他作用

杜氏肌營養不良(DMD)是一種無法治愈的衰弱性肌肉萎縮性疾病,抗氧化劑可以輔助治療該病癥,將牛磺酸作為膳食補充劑,可以有效改善癥狀的嚴重性,且成本較低、無副作用[36]。牛磺酸作為重要氨基酸,在腸道內可以抑制有害細菌的生長,加速短鏈脂肪酸的產生,降低脂多糖的濃度,調節腸道微生態,有利于腸道微生物代謝[37]。運動前補充牛磺酸,可以顯著提高大鼠的運動機能,有利于延緩消除運動后產生的疲勞,可作為一種營養補充劑應用于運動訓練[38]。

2 牛磺酸在海洋生物中的分布

2.1 貝類、螺類

海洋生物中的牛磺酸都以游離形式存在,其中,貝類、螺類是牛磺酸富集量最多的種類。表1列出了多種貝類、螺類海洋生物的牛磺酸含量,其中馬氏珠母貝中牛磺酸含量高達1383 mg/100 g[39],在海瓜子、芝麻螺中的牛磺酸含量也不低于1000 mg/100 g[9],此外,蟶子、貽貝等其他貝螺類中也含有一定量的牛磺酸[9,40-43]。

表1 不同的貝類、螺類海洋生物中牛磺酸的含量Table 1 Contents of taurine in different shellfish and snails

2.2 魚類

魚類、貝類、螺類三種海洋生物相比較,魚類中牛磺酸含量相對偏低,但魚類不同部位牛磺酸的含量有所不同。表2[9，44-45]列舉了一些常見魚類的不同部位牛磺酸含量,從中可以看出,大部分魚類的魚肉牛磺酸含量比其他部位高,如大黃魚,魚肉中牛磺酸含量為480 mg/100 g,而鰓中含量僅有魚肉的1/6,此外,牛磺酸在不同魚類的內臟組織中的分布存在較大差異,如美國紅魚、阿拉斯加綠鱘中腸、肝、鰓等內臟的牛磺酸含量差異不大,而海鱸魚、金槍魚、鮐魚等的心臟、腸、肝、鰓4種內臟中,心臟中牛磺酸的含量普遍比其他臟器高,鰓的含量最少。

表2 不同魚類的不同部位中牛磺酸的含量(mg/100 g)Table 2 Contents of taurine in different parts of different fish(mg/100 g)

2.3 其他種類

牛磺酸在甲殼類海洋生物中也有一定的含量,據文獻報道,日本對蝦、雪蟹中牛磺酸含量分別為199、450 mg/100 g[44]。此外,從海產品的加工副產物中提取牛磺酸也一直是行業的研究熱點,石珠成等[46]從珍珠副產物中獲得純度為97.3%的天然牛磺酸;郭正昭[47]從章魚內臟中提取得到牛磺酸含量為237 mg/100 g;章騫等[48]的研究表明1 kg的鮑魚內臟至少含有3.07 g牛磺酸。除了海洋動物外,一些海藻中也含有一定的牛磺酸,Fen等[49]從紅藻紫菜中最高獲得含量為1300 mg/100 g的牛磺酸。

對于同一種海洋生物來說,不同研究人員可能得到不一樣的結果,甚至會出現很大的差異,這種情況主要可能由以下幾方面造成:實驗人員操作誤差;實驗材料來源誤差,海洋生物的個體狀況和它們生長的水域環境、季節等外部條件有關;實驗材料利用部位誤差,不同部位牛磺酸含量差異較大;實驗處理方式不一致,即提取檢測方法不同,可能得到不一樣的結果。如王順年等[50]在測定牡蠣肉中牛磺酸含量時,采用不同的兩種方法進行處理,所測得的牛磺酸含量差別達到35.4%。

3 海洋生物中牛磺酸的提取方法

目前常用的牛磺酸提取方法主要包括水煮法、溶劑提取法、酶解法、超聲波輔助法、超高壓處理法等。

3.1 水煮法

海洋生物體細胞液及組織間的液體中存在豐富的游離牛磺酸,依據其高水溶性特性,一般可用熱水作為溶劑直接提取,操作工藝簡單、快速,成本較低,影響提取效率的因素主要為料液比、提取溫度、提取時間等[51]。冷波等[52]采用熱水浸提法,從魚廢料中制備牛磺酸,通過單因素實驗及正交試驗確定最佳提取條件為料液比6∶1、提取溫度60 ℃、提取時間50 min、提取液pH5.2,該法提取率高達2793 mg/100 g。

采用自溶破壁水對牛磺酸進行處理是水煮法的一種改進。錢俊青等[53]研究不同破壁方案提取效果發現,經保溫自溶破壁獲得的提取液中牛磺酸含量明顯較高。李和生等[54]的研究表明,先將蛤蜊在pH5.5、45 ℃下培養24 h,再進行水煮處理,牛磺酸的溶出較多。水煮法提取的牛磺酸中含有水溶性的游離氨基酸,一般需要利用離子交換純化,較多使用強酸性陽離子交換樹脂進行分離純化[55]。

3.2 溶劑提取法

乙醇也常作為溶劑來提取牛磺酸,姜新發[56]采用60%乙醇從翡翠貽貝中提取牛磺酸,在提取溫度80 ℃,提取時間60 min,料液比1∶5等條件下,反復提取3次,得到提取率為0.92%的牛磺酸。紀蕾等[42]利用乙醇回流法在魁蚶中提取牛磺酸,確定最佳提取工藝為乙醇體積分數75%,料液比1∶12 g/mL,提取溫度70 ℃、時間50 min,測得牛磺酸的提取量為536 mg/100 g。錢愛萍等[57]比較了70%乙醇沸水浴提取法、0.02 mol/L鹽酸提取法、6%磺基水楊酸熱水浴提取法3種方法對牛磺酸提取率的影響,發現6%磺基水楊酸熱水浴提取法相比其他兩種方法效果較好,但差別不大。

根據當前的研究發現,采用不同的溶劑進行提取,對牛磺酸的提取率影響不大,與其他溶劑提取法相比,水提法則較為安全、操作簡單,且成本較低,適于工業化生產[55]。

3.3 酶解法

生物酶也常常被應用在活性物質的提取過程當中,劉芳等[58]選取酸性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶等對南海海洋珍珠貝肉進行處理,發現蛋白酶可以破壞蛋白結構,促進其水解,提高牛磺酸獲得率。此外,采用復合酶進行處理也能顯著影響牛磺酸的提取效果[59]。

酶解法一般與水煮法相結合,粟桂嬌等[60]研究發現,在車螺肉提取牛磺酸的過程中,將酸性蛋白酶與水煮法相結合處理車螺肉的效果比單純水煮或單純酶解的效果好。劉亞南等[61]利用中性蛋白酶在牡蠣提取液中提取牛磺酸,結果表明,影響牛磺酸提取率的因素由大到小分別為:加酶量、pH、溫度。

酶解法存在一定的缺陷。一方面,采用生物酶直接水解,會使海洋生物中的微量元素、游離氨基酸、多肽等都溶于酶解液中,不易分離[62];另一方面,處理好的酶解液需進行滅酶,而且酶解液顏色一般會較深,需要用活性炭等進行脫色處理,增加了整個提取工藝的復雜性[51]。

3.4 超聲波輔助法

為了提高牛磺酸的提取效率,可用超聲波技術進行輔助提取。超聲波提取是利用超聲波產生的空化效應、機械效應等,有效地破碎空化中心附近的細胞,并增大提取溶劑分子的運動速度及穿透力,便于牛磺酸從細胞中溶出,與提取溶劑充分接觸而被分離,從而有效地提高牛磺酸的提取效率[63]。超聲波提取技術具有操作簡便易行、低溫不破壞活性物質結構、提取物易分離、提取率高等特點,廣泛應用于動植物中天然活性物質的提取[64]。

周燕霞等[65]研究發現將超聲波破碎與乙醇回流法相結合,有利于牛磺酸充分溶出,相較于單純機械破碎后進行乙醇回流處理的牛磺酸提取量平均高出26.9%。萬鵬等[66]從巨牡蠣中提取牛磺酸的實驗結果表明,超聲輔助酶解提取法的提取率比單純超聲法提取或單純堿性蛋白酶酶解法高。超聲波提取技術有許多影響因素,提高提取率的關鍵在于找到合適的聲學參數,如超聲頻率、聲強度、空占比等,其工業設備的制作難度高,成本較大,目前主要用于實驗室研究上[64]。

表3 不同牛磺酸檢測分析方法比較Table 3 Comparison of different detection and analysis methods of taurine

3.5 其他方法

超高壓技術是一種非熱力提取技術,近些年在食品領域中逐步普及利用。在常溫條件下,以100～1000 MPa的超高流體靜壓力為手段對目標物施加壓力保持一定時間,使原料細胞內外壓力達到平衡后快速卸除壓力,使細胞內外滲透壓差突然增大,以便于目標萃取物從細胞中溶出,轉移到提取溶劑中,進而完成整個提取過程[67]。超高壓提取技術在水產品活性物質提取中具有常溫、高效、能耗少等特點[68]。徐成等[69]利用超高壓法提取牡蠣中的牛磺酸,實驗結果表明,壓力大小、保壓時間、溫度以及料液比等都對牛磺酸的提取率有較大影響,且超高壓提取法的得率要高于傳統的水煮法。

牛磺酸屬于兩性物質,其等電點為pI=(pk1+pk2)/2=(1.50+8.47)/2=5.00。由兩性物質的特性可知,當溶液的pH與兩性物質的等電點一致使,其極易沉淀析出[51]。姜傳福等[70]利用等電點法從文蛤中提取牛磺酸,即調節提取溶劑的pH,當pH=5時,牛磺酸提取率最高,為1.3%。等電點法簡單快捷、條件易控、投入少而產出高,且無污染,是提取牛磺酸的一種新途徑。

4 牛磺酸的檢測分析方法

牛磺酸的研究正在不斷深入,其相應的配套檢測技術也得到逐步的發展與應用。當前國內外有關牛磺酸的檢測方法主要有中和滴定法、分光光度法、薄層掃描法、液相色譜法和氨基酸分析儀測定法等，比較結果見表3[71-79]。不同的方法有各自的優缺點,可以根據檢測需要選擇適宜的測定方法。

4.1 中和滴定法

牛磺酸是一種弱有機酸,可以利用堿性化合物如氫氧化鈉、氫氧化鉀進行中和反應,根據堿性化合物的消耗量計算牛磺酸含量。盧忠等[71]用中和酸堿滴定法測定牛磺酸含量,滴定前測得0.1 mol/L牛磺酸溶液的pH為5.63(25 ℃),滴定至終點后,測得溶液pH為9.62(25 ℃)。根據酸堿滴定理論,該滴定體系的滴定突躍范圍足夠大,指示劑能明顯變化以指示終點。此外,牛磺酸為弱酸,采用常規滴定法終點較難判斷,檢測精確度低,因此衍生出自動電位滴定法[80]、庫侖滴定法[81]等利用H+電位滴定的精度較高的方法。滴定法設備簡單、操作方便,但影響實驗結果的因素較多,穩定性和精確性不足。

4.2 分光光度法

牛磺酸是一種氨基酸,本身不具備紫外吸收特性,與特定的試劑反應,可生成顯色物質,分光光度法是在特定波長處或一定波長范圍內測定該生成物對光的吸收度,以此對該物質進行定性和定量分析。如在醋酸鈉環境中,牛磺酸與乙酰丙酮和甲醛進行加熱反應,生成N-取代基-2,6-二甲基-3,5-二乙酰基-1,4-二氫吡啶,此生成物顯黃色,在400 nm左右出現峰值,其吸收值與牛磺酸濃度在一定范圍內呈線性關系[82]。分光光度法的應用光區包括紫外光區,可見光區,紅外光區,所用的顯色劑主要有茚三酮、酚試劑、鄰苯二甲醛(OPA)等[83-84]。

劉天紅等[85]對分光光度法進行優化,檢測魁蚶中牛磺酸的含量,確定檢測條件為:顯色劑為乙酰丙酮:37%甲醛:1 mol/L乙酸鈉(1∶0.3∶4,V∶V∶V),顯色時間9 min,顯色溫度60 ℃,檢測波長330 nm。

分光光度法具有設備廉價、操作方便快捷等特點,同時也存在檢測靈敏度較低、試劑毒性大等不足,不適用于低濃度牛磺酸的測定[72]。此外,分光光度法只能檢測出一種或一類氨基酸的總量,并不適用于氨基酸的分離分析實驗[78]。

表4 不同高效液相色譜衍生試劑的特點Table 4 Characteristics of different derivatives of high performance liquid chromatography

4.3 薄層色譜法

利用薄層色譜法測定食物中牛磺酸含量的主要步驟為:制備離子交換柱對樣品中的牛磺酸進行提純處理后進行測定,通過制備薄層板、點樣、展開、顯色,樣品Rf值為定性指標,通過斑點大小及顏色深淺則可進行粗糙定量[86]。

劉春美等[87]建立了測量牡蠣軟體中牛磺酸含量的薄層掃描法,具體內容為:以乙醇-水(7∶3)為展開劑,展距8 cm;利用0.2%茚三酮乙醇液的顯色作用,在105 ℃條件下進行加熱,直至斑點清晰;反射法線性掃描:λs=519 nm,λR=618 nm,狹縫:10.0×0.4 mm,Sx=3。以此方法測定的牛磺酸平均含量為558.57 mg/100 g。呂雯等[88]利用薄層色譜法考察國內牛磺酸產品的質量,篩選比較 3 種展開體系、4 種顯色方式,發現以水-無水乙醇-正丁醇-冰醋酸(150∶150∶100∶1)為展開劑,茚三酮的丙酮溶液(1→50)為顯色劑,檢測效果最佳。

薄層色譜法能同時進行定量、定性檢測,對樣品前處理要求低,設備操作便捷,檢測成本低,但是精密度較差,在定性鑒定、半定量等分析檢測中有著重要作用[73]。

4.4 氨基酸自動分析法

不同氨基酸其結構和所攜帶的離子不盡相同,氨基酸自動分析法是以陽離子交換樹脂為固定相,酸性緩沖液為流動相,將茚三酮與氨基酸以柱后衍生的方式生成具有可見光吸收特性的衍生物,再通過氨基酸自動分析儀進行測定[89]。

牛磺酸可與茚三酮反應,衍生物為藍紫色,在儀器的第一通道570 nm左右有最大吸收峰,衍生物的光吸收度與濃度在一定范圍內成正比,即符合朗伯比爾定律[90]。王洪健等[91]利用氨基酸自動分析儀測定牡蠣、貝類、功能性飲料等中的牛磺酸含量,建立相應的測定方法,該法相對標準偏差為0.27%,回收率為100.4%～102.0%。

氨基酸自動分析法快速、精準,具有重復性好、儀器穩定、結果可靠等優點,但是所需儀器設備昂貴[89]。此外,Kaspar等[92]分別用氨基酸分析儀、液-質法、氣-質法測定尿液中氨基酸,對比42種氨基酸的檢測效果,發現氨基酸分析儀耗時最長(130 min),且靈敏度低于其它兩種方法。

4.5 高效液相(HPLC)色譜法

牛磺酸本身不存在發色基團,無法直接使用高效液相檢測器進行測定,必須先經過衍生化處理,使牛磺酸攜帶發色基團,以達到檢測目的[93]。早期主要使用茚三酮作為柱后衍生化試劑,但該方法檢測牛磺酸時精確度較低。現如今,牛磺酸的高效液相色譜檢測主要有柱前衍生和柱后衍生兩種,柱前衍生法衍生試劑包括2,4-二硝基氟苯(DNFB)、異硫氰酸苯酯(PITC)、丹磺酰氯法(dansyl-Cl)、鄰苯二甲醛(OPA)、熒光胺、二甲基萘胺-5-磺酰氯(DMS-Cl)、2,3-萘基二縮醛(NDA)等;柱后衍生法主要以鄰苯二甲醛(OPA)作為衍生試劑[94]。

表4[43,94,96,98-101]列出了幾種主要衍生試劑的特點,其中OPA是測定游離氨基酸最常用的一種衍生化試劑,其靈敏度高,但是存在衍生物不穩定、衍生化時間要求苛刻等缺陷。王海澍[95]采用高效液相色譜法檢測牡蠣提取液中牛磺酸含量,結果表明該法穩定性較高、重現性好。周欣蕊等[96]優化了國標第二法對功能飲料中的牛磺酸進行測定,以甲醇替換乙腈作為流動相,減輕毒性、縮短了衍生時長,檢測結果符合要求。孟冰冰等[97]建立了程序進樣-柱前衍生-超高效液相色譜法,解決了衍生物不穩定的難題,減少了實驗誤差,靈敏度和回收率高。

4.6 液相色譜質譜聯用(LC-MS)

液相色譜能夠對復雜基體化合物進行高效分離,但需相應的標準品才能進行定性,而質譜則是確定化合物結構的有效方法,兩者聯用,樣品無需衍生化即可直接測定,適用于快速定性定量分析[102]。

高極性水溶性特點使得利用親水色譜質譜聯用技術檢測牛磺酸成為可能,有機溶劑在親水作用體系中具有弱洗脫強度,而水一般作為強洗脫溶液,通過增加有機相比例,有效提高在質譜中的揮發性,并且改善分離度[94]。陳曉峰等[103]改善樣品處理方法,探明基質效應及影響電噴霧離子源的電離因素,從而改進超高效液相色譜串聯質譜技術,建立了操作簡便、基質效應低、靈敏度高的檢測方法。

隨著超高效液相色譜的發展,LC-MS聯用技術以快速定性、定量分析的優勢受到廣大氨基酸研究者的青睞,氨基酸分析的時間大大縮短,檢測效率得到明顯提高[78]。LC-MS的檢測精度高、檢出限低等特點使得其更適用于奶粉、飲料等食品中添加劑的分析檢測[104]。

4.7 毛細管電泳法

牛磺酸本身沒有電化學活性,不能直接進行電化學檢測,通過萘-2,3-二甲醛(NDA)、鄰苯二甲醛(OPA)等衍生化處理,如在CN-存在情況下,NDA可以與牛磺酸生成具有電化學活性的產物,當兩電極具有一定恒壓時,其在電極表面發生氧化,產生的電子數轉移形成電信號變化,以此測定牛磺酸含量[105]。

毛細管電泳法(capillary electrophoresis,CE)是一種以高壓直流電場為驅動力、以毛細管為分離通道的高效分離技術[106]。毛細管電泳儀將樣品中氨基酸分離后,結合紫外、質譜、電化學等檢測器對不同種氨基酸進行定性和定量分析,此法操作簡便、分離效率高、溶劑消耗少、成本低,特別適合氨基酸的手性分離[107]。

薛勇等[108]采用鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生牛磺酸,通過毛細管電泳-紫外檢測建立乳制品、功能食品等樣品中牛磺酸的快速檢測方法,結果準確性高。

毛細管電泳法有多種分離模式,應用范圍十分廣泛,但是由于毛細管直徑小,使光路太短,使用某些檢測方法(如紫外檢測等)時,靈敏度較低,結果不精確[107]。

4.8 紅外光譜分析法

近紅外光譜分析技術是近年來發展較快速的一種物理檢測技術,不同有機物中存在不同基團,各個基團的能級也有所差別,置于不同化學環境中,每個基因產生的振動和倍頻不同,以此呈現檢測圖譜以確定物質的二級結構,能反映樣品的化學全貌,該法操作簡單快速、成本低,但被測樣品純度要求高[109-110]。張慧恩等[110]利用近紅外光譜技術測定海洋生物牛磺酸含量,并建立一整套的快速檢測技術方法。

近紅外光譜與其他傳統分析技術相比,檢測時只需要采集1次樣品信息,即可進行多項指標的測定,簡便高效,適合大批量樣品的快速檢測。但是在建立分析方法時,需要以統計學方法為基礎,建立相應的定量分析模型,且不同種類、結構的樣品建立的模型有所差異[79]。

5 討論

牛磺酸具有十分廣泛的生理作用,在食品、藥品、飼料添加劑等領域中得到廣泛應用。人工合成與天然提取的牛磺酸價格相差好幾倍,由于技術限制,天然制備牛磺酸很難實現量產。目前對牛磺酸的機理研究較少涉及天然提取與人工合成的差別,對于兩種類型的牛磺酸在作用機制或者產生毒副作用等方面是否存在差異尚不明確,未來應更加深入研究探索兩者的異同點,為牛磺酸的應用提供更多的可靠參考文獻。

目前主要是從魚貝類中提取天然牛磺酸,進而研究魚貝類中不同部位的牛磺酸含量。如太平洋褶柔魚中內臟中牛磺酸的含量比其他部位高[45]。未來可側重研究從魚貝類廢棄物中提取牛磺酸,對其進行綜合利用,提高產業價值。此外,部分藻類中也含有一定的牛磺酸,但相關研究較少,因此研究海洋植物中牛磺酸含量也有一定的意義。

牛磺酸的天然提取有兩個要點:提高提取率及分離純化。天然牛磺酸的價格比化學合成的牛磺酸高得多,但受限于提取技術等,其產量一直不高。為了提高產量、縮短提取時間,今后的研究趨勢將是多種提取技術的協同發展,通過物理和化學手段,聯合幾種不同的提取方法,可以有效地提高牛磺酸提取率,是重要的研究方向之一。隨著天然牛磺酸在保健、醫療行業的廣泛研究應用,如何純化提取的牛磺酸也成了研究熱點,現有的醇提、膜分離、結晶等提純方法都存在一定的缺陷,研究幾種技術的聯合使用或者開發新技術都有極大的工業意義。

牛磺酸檢測技術作為其生理功能研究的輔助手段極為重要,如何建立方便、有效、精確的牛磺酸分析方法是當前氨基酸分析方法課題研究中不可或缺的一部分。目前,“高效液相色譜—柱前衍生法”在實際研究生產中應用率最高,但是衍生物穩定性、衍生時間、衍生副產物等因素一直影響著檢測結果的準確性,未來可通過探索靈敏度高、特異性強的衍生試劑來提高該檢測技術。此外,多項檢測技術的高效集成化、模塊化也是牛磺酸檢測的發展方向之一,如液相色譜質譜聯用(LC-MS),樣品不需衍化就可直接測定,更加簡便、快捷。

6 展望

隨著人們對天然安全食品的追求,對天然牛磺酸和人工化學合成牛磺酸的作用機制或者可能產生的毒副作用等方面的研究顯得尤為重要。研究牛磺酸在生物中的分布情況能提供更多的天然牛磺酸獲取途徑,而對天然提取技術的研究開發則能夠更有效地提高天然牛磺酸的制備產量。此外,方便、有效、精確的牛磺酸鑒定分析方法也應隨之建立,通過對多項檢測技術的集成聯用可以有效提高檢測效率,適用范圍更加廣泛。