尿激酶的質量研究

胡著陽，魏超娟，耿衛鋒

（江西浩然生物制藥有限公司，江西南昌 330029）

尿激酶是一種糖蛋白，屬絲氨酸蛋白酶類，由人腎小管上皮細胞分泌產生，其天然蛋白質底物為纖溶酶原。尿激酶通過催化纖溶酶原而將纖溶酶原激活并轉變為纖溶酶，后者可催化不溶性的纖維蛋白（血凝塊的主要成分之一）降解成可溶性的碎片，從而起到局部溶栓作用。

尿激酶的研發歷程可追溯到20世紀中葉，1947年，Macfarlane首先報告了在人的尿中含有纖溶活性物質，1951年Willama證實了這一活性物質能激活纖溶酶原使其轉變為纖溶酶，1952年Sobel發現在人體和一些動物尿中存在有纖溶酶原的激酶，并正式命名為尿激酶（Urokinase），1958年Sokal將其用于臨床研究治療血栓形成性疾患，1933年Johason用尿激酶治療實驗性靜脈血栓，證實其在體內具有溶解血栓的作用。我國尿激酶的研究工作開始于20世紀70年代初期，至今以已取得較大進展[1]。

1 尿激酶的藥理作用

尿激酶為酶類溶血栓藥物，可激活體內纖溶酶原轉為纖溶酶，從而水解纖維蛋白使形成的新鮮血栓溶解，其機制為切斷溶酶原分子中的精氨酸560-纈氨酸561鍵，使生成纖溶酶，從而降解纖維蛋白凝塊、纖維蛋白原以及前凝血因子Ⅴ和Ⅷ，并分解與血凝有關的纖維蛋白降解產物。

尿激酶直接作用于內源性纖維蛋白溶解系統，能催化裂解纖溶酶原成纖溶酶，后者不僅能降解纖維蛋白凝塊，還能降解血循環中的凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅷ和纖維蛋白原等物質，而發揮溶栓作用[2]。尿激酶對新形成的血栓起效快、效果好，還能提高血管ADP酶活性、抑制ADP誘導的血小板聚集、預防血栓形成[3]。該品在靜脈滴注后，患者體內纖溶酶活性明顯提高，停藥幾個小時后，纖溶酶活性恢復原水平，但血漿纖維蛋白或纖維蛋白原水平的降低，以及它們的降解產物的增加可持續12～24h，該品顯示溶栓效應與藥物劑量，給藥的時間呈明顯的相關性。

2 尿激酶對治療血栓性疾病的重要性

血栓性疾病是一種常見的心腦血管病，是由血栓引起的血管腔狹窄與閉塞，使主要臟器發生缺血和梗死而引發機能障礙的各種疾病，常表現為心肌梗死、缺血性腦梗死和靜脈血栓栓塞[4]。血栓性疾病可影響全身各個器官及系統，其發病率、致殘率和死亡率都很高。每年約有3‰人發生不同形式的血栓性疾病，嚴重威脅著人類健康。我國每年死于心腦血管疾病的人數約為300萬，存活的患者致殘率高。

尿激酶屬于溶血栓類藥物，是臨床上重要的溶栓藥物，它是治療心腦血管和外周血管等處血栓性疾病應用最廣泛的藥物之一，除了在治療心腦血管疾病、急性靜脈血栓、急性動脈栓塞、急性心肌梗死、急性肺栓塞有廣泛應用外，還可用于防治心臟瓣膜替換手術后的血栓形成，下肢深靜脈血栓，對動脈阻塞性眼病，突發性耳聾，冠脈血栓，腎病綜合征，結核性胸膜炎，結核性腹膜炎，支氣管擴張，糖尿病性周圍神經病變，糖尿病性周圍神經病變，斷指再植術后等也有一定的療效。

與其他常用的溶栓藥物相比，尿激酶具有起效快、毒副作用小等特點，小鼠靜脈注射半數致死量大于100萬國際單位/kg體重，且無明顯抗原性、致畸性、致癌性和致突變性，臨床上罕有過敏反應的報道。與鏈激酶相比，尿激酶對人體無抗原性，因此過敏反應的發生率極低；與組織型纖溶酶原激活劑相比，尿激酶的價格適中，且出血的危險性較低。目前，可完全替代尿激酶的只有進口藥品“阿替普酶”，二者具有相同溶栓效果，但進口藥品的價格是注射用尿激酶的15～20倍。因此，尿激酶在臨床治療血栓性疾病方面具有重要地位。各藥品生產企業必須不斷提高尿激酶產品質量，對產品質量標準和質控方法作進一步研究。

3 尿激酶的質量標準、關鍵質量屬性及質量標準提高的方向

在我國，尿激酶自1995年起收載自各版本《中國藥典》[5]中，經多次修訂，質量標準總體呈提高趨勢，最新質量標準參見《中國藥典》2015年版二部“尿激酶”項。其中對尿激酶的制法要求，性狀，鑒別，檢查（溶液的澄清度與顏色、干燥失重、分子組分比、乙肝表面抗原、異常毒性、細菌內毒素、凝血質樣活性物質），效價測定（酶活力、蛋白含量），類別，貯藏，制劑等都作出了規定。

除《中國藥典》外，尿激酶收載于全球各主要現行藥典中（歐洲藥典EP[6]、日本藥局方JP[7]）。表1為現行藥典中尿激酶質量標準的比較。

根據表1，現行各版藥典中尿激酶的質控指標，各項指標的要求、分析方法各有不同。總體上《中國藥典》中尿激酶的質量標準總體高于其他現行藥典。

對上述各版現行藥典中尿激酶質量標準進行分析可得出，除常規檢測項目外，產品的關鍵質量屬性如下。

3.1 分子組分比

該項目中，《中國藥典》標準較EP、JP更高。分子組分比是同時影響產品安全性和有效性的關鍵質量屬性之一。尿激酶包含兩種分子量形式：54000和33000D[8]。在人體尿液中，尿胃蛋白酶可把尿激酶原切割為具有高生物活性的雙鏈形式天然尿激酶分子。天然尿激酶分子雙鏈通過二硫鍵連接，為高分子尿激酶（H-uK）[9]。高分子尿激酶為尿激酶中的主要活性成分，其高級結構具有完整的三個模塊：N-端的表皮生長因子樣模塊G(growth factorlike domain)，Kringle模塊K和C-末端的蛋白酶模塊P。其中G模塊主要參與尿激酶與uPAE/CD87受體的結合，C-末端蛋白酶結構域則具有絲氨酸蛋白酶的典型特征，Kringle結構域主要與纖溶酶原激活抑制因子1（PAI1）作用。而尿激酶在實際生產、運輸、貯藏的過程中，可能發生水解作用，高分子尿激酶會進一步降解為分子量為33000 D的低分子尿激酶（L-uK）。該種形式尿激酶分子只剩下完整的蛋白酶模塊，因此有一定的體外溶栓生物活性，但由于缺少生長因子樣模塊G和Kringle模塊K，在體內的溶栓及以外的作用機制不明確，且具備引發出血等不良反應的可能。

為了更有效地控制藥品的安全性和有效性，藥品生產企業應致力于優化尿激酶生產工藝中的純化步驟，進一步提高產品中H-uK組分的占比，設定更高的內控標準，ChP可考慮將提高H-uK分子組分比作為標準提高的方向。

3.2 重金屬

目前僅JP包含重金屬檢測項目。考慮到尿激酶的生產工藝中可能帶入包含重金屬的試劑，為保證藥品的安全性，應加強對原料藥重金屬含量的控制。

3.3 乙肝表面抗原

《中國藥典》及EP對該項目做出規定：乙肝表面抗原應檢測結果應為陰性；JP無該項檢測指標。

考慮到尿激酶的來源為人體，存在帶入病毒的風險，因此在對供尿人員健康狀況進行控制及在生產工藝中加入病毒滅活步驟（《中國藥典》2015版二部中尿激酶項下【制法要求】）中規定：本品在生產過程中需經60℃加熱10小時，以使病毒滅活）外，有必要在質量標準中加入病毒檢測的項目進一步保證藥品的安全性。目前，《中國藥典》已包含乙肝表面抗原檢測項目，可考慮將增加丙肝抗體、艾滋抗體等檢測項目作為質量標準提高的方向。

3.4 酶活力（效價）/比活

關于比活，各版現行藥典中尿激酶質量標準均有規定，《中國藥典》及JP標準較EP更高（《中國藥典》、JP規定：每1mg蛋白中尿激酶活力不得小于12萬單位；EP規定：每1mg蛋白中尿激酶活力不得小于7萬單位）。關于酶活力，各版現行藥典在檢測方法上有所差異，ChP和EP的酶活力測定方法為通過溶栓實驗進行測定，JP中的酶活力測定方法為小底物法，原理雖不同，但均采用與標準品進行比對，因此對酶活力的定義相同。除檢測方法不同外，JP規定尿激酶單位效價不得低于60000IU/mL，ChP和EP對單位效價（酶活力）未作出規定。

考慮到注射用尿激酶的給藥途徑為靜脈注射，對純度要求較高，而尿激酶的生產過程特別是純化步驟中會使用大量的鹽溶液，因此在控制產品比活（IU/mg蛋白）的基礎上，可對產品中主成分含量進行控制，增加單位效價（IU/mg）的標準。