植物根系成像技術研究進展及馬鈴薯根系研究應用前景

秦天元 孫 超 畢真真 王 瀚李 鑫 曾文婕 白江平,?

(1甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室/甘肅省干旱生境作物學重點實驗室,甘肅蘭州 730070;2 甘肅農業大學農學院/甘肅省作物抗逆種質創新與利用工程研究中心,甘肅蘭州 730070)

根是植物地下部分為適應陸地生活長期進化而形成的營養器官,具有支撐地上部分的基本作用[1],還是植物從土壤中吸收生長發育所需水分、各種無機鹽離子及其他必需養分的器官[2-4]。 因此,研究作物不同生育期根系的生長特點、水分和營養元素的吸收與利用及其在土壤中的分布情況,對提高作物產量、增強作物的抗逆性具有重要意義。 研究植物根系的傳統方法有挖掘法、釘板法、容器法、玻璃管法及改良后的根室等[5-6],但這些方法會對植物根系造成不同程度的損傷,且存在一定的局限性。 隨著科學技術的發展,成像技術的出現為植物根系的研究提供了新的解決方案,但目前成像技術在植物根系研究中的應用尚處于發展階段,多用于水稻[4]、小麥、玉米及少數樹木的研究[6]中,而在馬鈴薯、甜菜等塊莖、塊根類作物研究中的應用尚鮮見報道。 因此,本文通過對近年來根系成像前沿技術特點及應用范圍進行歸納、總結與分析,以期為今后植物根系成像技術在馬鈴薯根系研究中的應用提供技術參考。

1 植物根系研究的發展簡史

植物根系的研究最早始于18 世紀,1727年Hales直接挖掘栽培作物的根系,人工測量了根的長度和重量并記錄了根系形態特征[5]。 直到19 世紀中期,施用無機化學肥料使農作物的產量成倍增加,研究植物根系再次進入到科學家的視野中,陸續出現了玻璃管法、容器法等多種研究根系的方法,達到了植物根系研究的高峰時期。 20 世紀初Cannon 在研究沙漠植物直根與側根的變異性時提出了“根構型”概念;1995年Lynch 對“根構型”進行定義,并給出明確的概念[1]。20 世紀中期后,隨著精密光學儀器的開發和計算機技術的應用,植物根系研究進入了一個新的發展階段。

根系成像技術始于1873年,Bohn[5]采用玻璃板法用肉眼觀察并人工手繪植物根系,但該成像方法只是按照比例大致繪畫植物根系在土壤中的分布情況,無法準確描述根系在土壤中的生長發育情況。 1937年,Bates[7]提出玻璃管法觀測植物根系生長情況,但該方法因受試驗材料和條件的限制,直到1974年才應用于田間自然條件下觀測作物根系。 之后,在玻璃管法的基礎上進行改進、完善形成了“微根窗”[8]成像技術。 1995年Dubach 等[9]利用微根窗技術觀測紫花苜蓿的根系。 20 世紀中期,同位素示蹤法[10]被應用到植物根系研究中,即利用同位素放射自顯影技術觀察植物根系在土壤中的分布情況,使植物根系成像技術進入了一個新的階段。 20 世紀中后期,植物根系成像技術研究進入蓬勃發展時期。 20 世紀80年代,中子成像技術應用于植物根系研究[11-12]。

隨著科技的快速發展,光學電子儀器和數字成像技術被用于植物根系研究中。 Costa 等[13]采用掃描原理觀測、分析玉米根系動態特征。 吳長高等[14]將計算機視覺技術用于植物根系形態和結構的分析研究。 20世紀末期,科學家們利用現代科學技術獲得植物三維圖像、無損檢測技術研究植物在田間自然條件下的生長情況,開展了對植物根系的原位觀察研究。 近年來,用于根系動態監測的系統不斷問世,如CI-600 根系生長監測系統(美國CID 公司)、Win/Mac RHIZO 根系圖像分析系統(北京澳作生態儀器有限公司)、ET-100根系生態監測系統(美國Bartz 公司)等。 植物根系成像技術的發展對研究植物根系具有重要作用,不僅為研究植物根系生長發育情況提供了新的方法,還在一定程度上解決了因土壤的不透明性而造成的根系直接成像難的問題。 植物根系成像技術分為傳統成像技術和現代成像技術。 傳統的植物根系成像技術是指用肉眼直接觀察、手繪植物根系和借助簡單的光學儀器對植物根系照相。 現代植物根系成像技術是利用現代的儀器設備對植物根系進行照相,如中子成像技術、螺旋CT 三維成像技術、熒光成像技術、多光譜成像技術等。

2 不同植物根系成像技術的應用與特點

2.1 玻璃板或玻璃管法

2.1.1 玻璃板法 玻璃板法是指在土壤垂直剖面安裝一塊玻璃板,透過玻璃板來觀察植物在土壤中的生長情況。 玻璃管法能在土壤中直接觀察到植物根系,但由于玻璃板安裝位置固定,無法大范圍觀察植物根系的分布情況和最大深度,因此多用于砂質土壤研究植物根系,在粘土特別是含水量較高的粘質土不宜采用該方法,這是因為粘質土顆粒過小、水分過多會影響觀察的清晰度,產生較大誤差[5]。 1873年,Sachs 首次采用玻璃板法記錄、觀測植物根系生長情況[24]。 1916年,McDougall 在自然條件下采用玻璃板法研究植物根系,主要記錄根系的顏色、大小和形狀[25]。

2.1.2 玻璃管法 玻璃管法是指在土壤中安裝一根玻璃管,緊貼玻璃管種植植物,通過玻璃管觀察植物根系在土壤中的生長情況(圖1)。 Bates 在1937年首次提出用玻璃管觀測植物根系[7],并于1974年在田間條件下觀察植物根系[5]。 通過調節發光源的亮度可以觀測土壤不同深度的根系,最大深度可達到1 m。 該方法能有效觀察單株植物根系的生長情況,但是觀察多株植物的根系就要安裝更多的玻璃管,在玻璃管上畫上方格,以計算單位面積內植物根系的數量。 此方法的不足之處在于玻璃管在土壤中時間過長時其位置會發生改變,此外,土壤中的雜質吸附在玻璃管壁上也會影響觀察的清晰度。

2.2 放射性成像技術

圖1 玻璃管成像系統組成Fig.1 Image acquisitionsystem of the glass tube

2.2.1 中子成像技術 中子成像技術[11]是熱反應堆產生的中子通過栽培植物的容器,在另一端的探測器轉換屏上得到栽培植物的根系圖像。 植物根系和土壤含水量不同,熱反應堆產生的中子透過栽培植物的容器,會發生不同程度的衰變,從而得到該栽培植物的根系圖像。 Hawkesworth[12]于1976年利用中子照相技術研究了植物根系;我國科學家苗齊田等[11]于1984年利用中子照相技術研究玉米根系,得到了玉米幼根的生長圖像,并測量了根長。 該方法在實際操作中存在較大局限性,對實驗設備要求較高,需要專業人員進行測定,且熱反應堆產生的輻射長時間照射會影響植物的正常生長發育,因此無法連續觀察植物根系的生長發育情況。 此外,植物根系、土壤水分的變化也會影響根系成像質量。

2.2.2 放射性示蹤法 利用放射性示蹤法測定根系活性的方法有2 種:一,在植株周圍的土壤表面和不同深度放入示蹤物,植物吸收后從土壤剖面測定示蹤物含量研究根系活性;二,在植物莖上注入示蹤物,采集植物根-土壤樣品,測量示蹤物含量研究植物根系活性。 示蹤物都是同位素,利用示蹤物的自顯影技術成像并用成像軟件(VG StudioMAXw 2.1)處理圖像。 與中子成像技術相比,該方法中示蹤物不影響植物的正常生長發育,且注入的示蹤物是植物生長發育的必需元素,但由于土壤是由各種礦物質、有機質、水分等成分組成,非常復雜,本身可能就含有多種放射性物質,因此會使成像結果產生誤差。

2.3 現代數字成像系統

2.3.1 微根窗法 1937年,Bates[7]首次提出微根窗的概念,之后逐漸發展成為研究植物根系常用的工具。典型的微根窗成像系統是由插入土壤中的攝像系統、地上控制器和1 臺計算機組成(圖2)。 該方法能對同一細根的出現、生長、衰老、死亡和消失進行連續觀察,在研究細根周轉率、生命周期和分解速率等方面優勢顯著。 但玻璃管安裝會使周圍環境發生變化,影響植物的生長發育。 在植物根系生長過程中可能會產生大量的細根圍繞在玻璃管周圍,影響觀測的準確性。

圖2 微根窗圖象采集系統組成[26-27]Fig.2 Image acquisition system of minirhizotron[26-27]

2.3.2 洗根掃描法 洗根掃描法是基于挖掘法、土鉆法、內生長土芯法或容器法獲取根系,通過Epson 掃描儀(日本精工愛普生公司)等圖像獲取系統獲取根系平面幾何構型圖像,利用WinRHIZO Pro(北京澳作生態儀器有限公司)等圖像分析處理軟件,進行根系構型分析。 該方法可用于根系形態、拓撲結構、根系顏色等研究,但無法進行動態監測。

2.3.3 X 掃描成像技術 X 掃描成像技術主要是利用X 射線[19]對植物根系直接掃描。 平板探測器就是利用X 射線穿過植物樣品會發生衰減,在探測器上根據射線衰減程度重建根系圖像(圖3)[28]。 平板探測器用來接收穿過植物的射線信號并與計算機連接,進行植物圖像采集與重建。 機械掃描系統通過控制植物與掃描設備的距離對植物根系進行掃描。 該成像技術可以在不損壞植物根系的情況下在植物不同生長時期直接對植物根系進行成像,適用于盆栽植物的根系研究。 Moran 等[20]利用X 射線掃面成像技術研究了植物根系在土壤中的分布情況;Gregory 等[29]采用X 射線微層析成像系統研究麥苗和油菜的根系,并對生長8～10 d 的麥苗根系進行三維圖像重建。 該方法以RootViz FS(植物根系X-光掃描成像分析系統)[30]為代表,是一種高效率、高精度、非破壞性的根系原位分析方法,可以全方位分析植物根系所有部分(包括根尖等),還可在植物生長的不同階段對根系的生長進行長期動態監測。

2.3.4 探地雷達 探地雷達[31-32]通過利用高頻電磁波在不同介質中傳播會發生反射來獲得介質中物體的圖像。 用高頻電磁波掃描土壤,利用接收器接受反射回來的電磁波,通過分析獲得土壤中的植物根系。Ellis 等[33]采用該技術研究幼齡樹木,完成了幼齡樹木根系圖像重建;Butnor 等[34]采用該方法研究了人工火炬松(Pinus taeda L.)的根系。 探地雷達技術具有一定的局限性,只能對較大根系進行成像,無法探測到細小的植物根系,因此不能用于栽培作物的根系研究。 此外,受土壤電磁波特性、儀器設備價格高等因素的影響,也使該方法的應用受到較大限制。

圖3 平板探測器根系成像系統[28]Fig.3 Image acquisition system of Flat Panel Detector[28]

圖4 共聚焦顯微鏡簡化原理圖Fig.4 Confocal microscopes simplify schematics

2.3.5 核磁共振成像技術 核磁共振成像[35-36]是以射頻電磁波為信息載體,通過檢測磁場中物體不同位置核磁共振信號獲得編碼核磁共振信息生成圖像,進而利用計算機重建物體內部影像的一種現代層析成像技術。 核磁共振成像與被檢測物水分含量有關,是一個多參數成像系統,可以提供多種對比圖像。 張建鋒等[18]采用核磁共振成像技術研究了大豆、玉米和茄子3 種作物的根系,并采用最大密度投影(maximum intensity projection, MIP)、 容 積 再 現 技 術(volume rendering, VR ) 和 多 平 面 重 構 ( multiplanarreconstruction, MPR)3 種方法對植物根系進行重建。 核磁共振技術主要用于植物主根和主要側根的研究。 當植物側根直徑在2 mm 或者接近2 mm 時其三維重建圖像是斷點組成的虛線,遠小于2 mm 的側根則無法呈現,此外,植物類型、土壤水分等也是影響核磁共振成像質量的重要因素。

2.3.6 熒光成像技術 目前,光化學傳感器的發展已成功應用于多個領域,熒光物質聚合在一起形成一個傳感箱,熒光物對pH 值和氧氣濃度的變化非常敏感[37-38]。 Hendrick 等[39]將熒光成像技術與中子照相技術結合,檢測了土壤水分變化對森林生物群落根系的影響。 Rudolph-Mohr 等[40]采用該方法檢測了白羽扇豆(Lupinus albus)根系在土壤中的生長與分布。 熒光成像技術是借助熒光傳感器對植物根系進行成像,因此熒光強度、光照時間和土壤水分變化對其成像質量影響均較大。

2.3.7 激光共聚焦顯微成像技術 激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope)是激光、高分辨率顯微成像技術和計算機圖像處理等現代高科技手段與傳統的光學顯微鏡結合產生的先進的生物學分析儀器(圖4)。 普通的熒光光學顯微鏡在面對較厚的標本進行觀察時,來自觀察點鄰近區域的熒光會對結構的分辨率形成較大的干擾。 而共聚焦顯微技術的關鍵在于,每次只對空間上的一個點(焦點)進行成像,再通過計算機控制的每個點的掃描形成標本的二維或者三維圖象。 此過程中來自焦點以外的光信號不會對圖像形成干擾,從而提高了顯微圖象的清晰度和細節分辨能力[41-42]。 由于精度較高,對根研究而言,目前在擬南芥根尖等細小組織的顯微結構觀測中應用較為成功,但對超過一定體積和厚度的樣本無法觀察。

2.3.8 多光譜成像技術 多光譜成像儀是一種獲取光譜特征和圖像信息的基本設備,是把入射的全波段或寬波段的光信號分成若干個窄波段的光束,然后把它們分別成像在相應的探測器上,從而獲得不同光譜波段的圖像。 植物根系對各個波段波長光的反射、透射和激發熒光情況分別進行光譜信息和圖像的采集,再將在各個波長下的圖像信息合成一個全波段的集合,該集合上記錄了根系每個單位的光譜數據信息。將這些原始的圖像信息經信息處理中心作進一步加工處理后,可獲得清晰直觀便于判讀的根系圖片。

2.3.9 高光譜成像技術 高光譜成像技術是源于非常多窄波段的影像數據技術,它將光譜技術與成像技術相結合,探測目標的三維幾何空間和一維光譜信息,以獲取連續、窄波段高分辨率的圖像數據(圖5)。 高光譜遙感信息分析處理,集中于在光譜維上進行圖像信息的展開和定量分析,其圖像處理模式的關鍵技術包括:超多維光譜圖像信息的顯示,如圖像立方體的生成;光譜重建,即成像光譜數據的定標、定量化和大氣糾正模型與算法,依此實現成像光譜信息的圖像-光譜轉換;光譜編碼,尤其指光譜吸收位置、深度、對稱性等光譜特征參數的算法;基于光譜數據庫的地物光譜匹配識別算法;混合光譜分解模型;基于光譜模型的地表生物物理化學過程與參數的識別和反演算法[43-44]。

圖5 高光譜成像系統Fig.5 Hyperspectral imaging system

高光譜成像儀具有圖譜合一的優勢,利用波長掃描式獲取植物根系結構圖像,可以精確到某一個點去探測研究目標在不同脅迫下的特征,又可獲取受脅迫目標表面的光譜信息,點面結合綜合地反映目標遭受脅迫的程度。 因此,高光譜成像技術已經成為國內外研究的熱點。 學者們利用高光譜成像技術可以量化地提取研究目標所遭受的各種脅迫特征,根據高分辨率的圖像對目標整體或局部區域進行分析,從而可以在更加微觀的尺度上進行機理探測研究[45-47]。

2.3.10 計算機斷層掃描成像技術 計算機斷層掃描成像(computed tomography,CT)技術是一種依據外部投影數據重建物體內部結構圖像的無損檢測技術。 植物根系原位CT 序列圖像處理中,合適的圖像分割技術是直接影響植物根系三維重建精度和定量分析結果準確性的關鍵技術,在植物根系原位形態無損檢測技術研究中具有舉足輕重的地位和作用[48]。 原位根系CT 圖像分割是借助分割算法,通過計算機將植物根系(剖面)從含有土壤等介質的CT 斷層圖像中分離、提取出來,用于后續的三維重建和定量分析[49]。 該方法能夠解析出不受土壤介質干擾的根系三維立體構型,且不同時期連續測量可動態觀察根系結構的生長變化。

2.3.11 其他成像技術 紙質成像系統是最近出現的研究植物根系的一種技術。 該方法將植物培養在2 個平板中間,覆蓋發芽紙來提供水分和養分,Marié 等[50]采用該方法觀測到玉米根系結構,對玉米根系的發育狀況進行了研究。 但紙質成像系統需要特定的儀器設備、植物生長環境不易控制、培養的植物相互之間易發生病菌的感染。 非插入性成像技術是利用3D 成像技術和數字表現的形式從根的網狀分布、大小解釋根的形態結構。 Topp 等[51]采用該方法觀測水稻根系,發現了控制根系數量性狀位點的中心基因組區域。 電阻抗成像技術是近30年來發展形成的新型成像系統,李星恕等[52]采用該方法進行了土壤-樹根系統圖像重建,完成了樹木單根斷層的圖像重建。 但該方法對檢測物體表面施加電流,因此不能長時間觀測植物根系,不適于研究植物根系生長發育情況。

2.3.12 根系系統分析軟件 隨著電子計算機的發展,計算機軟件逐漸應用于根系研究,根系分析系統的出現為植物根系研究提供了極大的便利。 目前主要使用的根系分析軟件為WinRHIZO Pro(北京澳作生態儀器有限公司)、GIA Root(美國佐治亞理工學院和杜克大學的團隊合作研發)[21]、SmartRoot(加拿大SMART技術公司)、EZ-RHIZO 1.0(美國賽普拉斯公司)及Root flow RT(美國Phenotype Screening 公司)[22]。Armengaud 等[22]采用EZ-RHIZO 研究了土壤中植物根系結構;Van der Weele 等[23]利用Root flow RT 研究了擬南芥、番茄等植物根系生長速率。 這些分析軟件主要由成像系統和運動控制系統組成。 成像系統利用照相機和攝像儀對試管苗進行直接照相,然后在計算機上通過圖像分析軟件對圖像進行處理。 運動控制系統是通過計算機來自動控制試管苗的轉動速度,將試管苗放在機械旋轉裝置上,用攝像機采集試管苗的圖像,通過圖像處理系統將分析采集到的二維圖進行三維根系圖像的重建,以此得到根系的相關特征。 但該方法只能用于植物幼苗根系的研究,植物需在透明容器中生長且在較長時間內能夠連續照相。 此外,該方法對培養基要求嚴格,培養基需要達到一定的透明度,否則會影響根系成像質量。 因此,該方法只能在實驗室內進行,無法模擬根系在自然條件下的生長狀態,具有一定的局限性。

3 成像技術應用于馬鈴薯根系研究的展望

目前,馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)是僅次于小麥、水稻和玉米之后的世界第四大糧食作物[53],因其優良的加工品質、較強的適應性、高營養價值和低生產成本而廣受人們關注。 馬鈴薯是塊莖作物,主要收獲的是地下部分,其塊莖和根系生長環境一致。 因此,根系成像技術在馬鈴薯等塊莖、塊根類作物中的應用尤為重要。

馬鈴薯根系成像技術是研究馬鈴薯根系性狀的新方法,尚處于發展階段,具有較大的發展潛力。 主要圍繞以下幾個方面開展研究工作:第一,利用根系成像技術研究馬鈴薯根構型,通過改變馬鈴薯的根構型以提高水分利用率,增加其抗旱能力;第二,利用根系成像技術研究地下部分對地上部分的影響,提高地上部分對光能的利用率,進而提高光合作用,快速積累更多的同化物增加單位面積產量;第三,利用根系成像技術研究根系對營養元素的吸收情況,為植株生產種植過程中合理施肥,合理密植提供指導;第四,利用根系成像技術監測塊莖的分布和發育狀況。在馬鈴薯不同生育時期,采用不同的成像技術研究馬鈴薯根系及塊莖生長發育的特點。 研究馬鈴薯幼苗根系特點時,將馬鈴薯的組織培養在透明容器中,利用計算機斷層掃描技術獲得不同方位根系照片,然后利用GIA Root、SmartRoot 等根系圖像軟件分析得到的圖像研究馬鈴薯幼苗根系。 以塊莖繁殖的馬鈴薯沒有明顯的主根為須根系,采用X 射線掃描技術研究根系的變化特征,可根據根系對X 射線折射率不同得到根系的分布情況。 馬鈴薯根系的研究不宜采用核磁共振成像技術,因為核磁共振成像技術對較小的根系不能成像或成像質量不高,產生誤差較大。 中子成像技術需要特定的熱反應堆、中子發射儀,且對植物生長影響大,所以也不適于馬鈴薯根系研究。 放射性示蹤法和熒光成像技術主要是利用放射自顯影技術對根系成像,但無法區分是馬鈴薯塊莖還是根系反應的信號,因此也不適于馬鈴薯根系的研究,其他的根系成像方法在馬鈴薯根系研究中的應用尚處于摸索階段,后期隨著科技的發展,一些新的研究分析方法會不斷地應用到馬鈴薯根系的研究中,幫助人們了解到更多有關根系生長發育的問題。