基于尋峰算法的熒光檢測設備的設計與實現

傅成杰 閆維新 趙言正

關鍵詞： 熒光免疫層析; C反應蛋白; 尋峰算法; 單光路結構; 雙閉環反饋; LED光源

中圖分類號： TN247?34; TH776 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼： A ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號： 1004?373X（2019）03?0148?04

Abstract： A small?sized fluorescence detection device is designed to simply and accurately acquire the location of [T]?peak and [C]?peak in C?reactive protein （CRP） detection， and a window shifting peak?searching algorithm is proposed. This detection device includes the design and optimization of optical path and circuit. The design of single optical path structure can maintain the compact structure and small overall size of the device. The inner current feedback and outer light intensity feedback can make the output light excited by LED stable. The detection experiment results of CRP show that the window shifting peak?searching algorithm has easy operation and high precision， and the obtained location accuracy of [T]?peak and [C]?peak is increased by 50.0% and 52.9% respectively than that of the general polynomial fitting method.

Keywords： fluorescent immune chromatography; C?reactive protein; peak?searching algorithm; single optical path structure; double closed?loop feedback; LED light source

0 ?引 ?言

免疫學檢驗包括定性、半定量、定量等檢測模式，前兩種模式無需知道精確的待檢物質含量。然而，隨著社會的發展和醫學診斷的完善，定量檢測模式的需求日漸增加。熒光免疫層析技術是一種快速定量檢測技術，該技術建立在熒光免疫分析技術與免疫層析技術的基礎上[1]，可以被運用于血樣中C反應蛋白（CRP）[2]濃度的定量檢測。熒光免疫層析技術利用熒光物質標記待測抗體或抗原的特異性反應過程[3]，熒光物質在激發光的照射下產生特定波長的熒光，通過光電檢測模塊采樣收集光強信息，并通過處理算法將熒光信號量轉換為待檢物的濃度信息。

CRP是一種急性時相反應蛋白，對于鑒定感染及多種結締組織病、判斷疾病嚴重性或活動性等具有十分重要的意義[4]。在CRP檢測實驗中，向試紙條滴加血樣，CRP在[T]線處發生反應，而游離標記物則在[C]線處發生相應反應。使用熒光掃描采樣得到熒光光強信號數據，處理該數據之后，可獲得具有一定峰特征的波形曲線，其含有2個明顯峰，分別反映了[T]線和[C]線處對應熒光標記物的濃度。在一定范圍內，[T]峰與[C]峰的峰面積比值[TC]與血樣中待測物質的濃度成正相關，這是血樣檢測的理論基礎。計算峰面積比值[TC]主要涉及原始數據的濾波算法和曲線的尋峰算法。而峰面積值比[TC]依賴于峰的具體位置，因此高精度的尋峰算法是保證系統檢測精度的關鍵。

尋峰算法常用的方法有直接比較法、一般多項式擬合法、高斯多項式擬合法、高斯擬合法和優化尋峰算法等。其中直接比較法應用一階微分，該方法在熒光強度曲線波動較大時尋峰精度較低，并且只適合找孤立峰。一般多項式法選擇一般多項式進行擬合，最小二乘法進行判定，該方法簡單、易于實現，但是尋峰準確度有限[5]。高斯多項式擬合法對波形曲線進行高斯?多項式變換，該方法的尋峰精度高于一般多項式擬合法，但該方法對波形曲線數據較敏感，抗噪性能差，并且如果波峰不在波形曲線數據內，那么得到的峰值誤差會較大[6]。高斯擬合法[7]不經過多項式變換，直接作為Gaussian函數進行擬合處理，得到最佳擬合曲線，進而獲得波峰位置。遺傳算法[8]、基于徑向基函數網絡算法及蟻群算法等優化尋峰算法可以改善精確度，但計算復雜，需要較長時間的嘗試與訓練才能確定各個參數，求解速度慢，因此不適合快速、實時的運算[9]。

本文結合熒光波形曲線的峰特征，提出一種實施簡單同時精度較高的平移窗口尋峰算法。接著設計了一種小型熒光檢測設備，目的是改善目前市場上相關設備體積大、操作難的現狀，其中著重進行了光電檢測模塊和上下位機軟件的設計及優化。最后通過分析比較幾種尋峰算法的實驗結果，驗證本文提出的平移窗口尋峰算法具有一定的應用意義。

1 ?平移窗口尋峰算法

經濾波算法處理后，熒光強度波形曲線表現出明顯的雙峰特征。平移窗口尋峰算法的總體流程如圖1所示，通過特定的峰位置可以截取獲得有效的數據區域，最后得到峰面積值比[TC]。

1.1 ?初尋[T]峰

對多種濃度區間血樣進行檢測實驗時發現，檢測帶（[T]線）區域和質控帶（[C]線）區域的熒光強度，即波形曲線的縱坐標值始終處于較高的水平，并且[T]峰的位置靠前，[C]峰的位置靠后。某次實驗的熒光強度波形曲線結果如圖2所示。

1.2 ?截取有效波形段及再次尋峰

因為[T]峰和[C]峰的位置較為固定，所以得到[T]峰位置后，截取附近的240個采樣點作為有效數據區，構成新的熒光波形曲線。截取的目的一是為了減輕后續的數據計算量，二是為了后期能夠將熒光波形曲線更加合理完整地展現出來。

現在有效數據區存在明顯的、跨度較為合理的雙峰特征，再次使用初尋[T]峰時使用的尋峰算法，最高峰和次高峰即為所求的兩個峰。其中[T]峰靠前，[C]峰靠后。

1.3 ?確定邊界位置及計算峰面積比[TC]

本文根據采樣點的微分值確定邊界位置。從[T]峰位置向前輪尋，其微分值從大于0.8到小于0.8的點，記為[T]峰的左邊界點;從[C]峰位置向后輪尋，其微分值從小于-0.8到大于-0.8的點，記為[C]峰的右邊界點;而[T]峰和[C]峰之間最低的點，記為[T]峰的右邊界點和[C]峰的左邊界點。

確定好邊界位置后，采用累加和的思想分別求得[T]峰和[C]峰的面積，兩者相除可以獲得最終的峰面積比[TC]。

2 ?系統設計

為彌補市場上相關檢測設備體積過大、操作復雜的缺點，本文設計了一款小型熒光檢測設備，整體框架如圖3所示。該設備以TI的CC2640芯片作為主控單元，重點設計了光電檢測模塊和上下位機軟件。其中光電檢測模塊主要包括光路設計和電路設計。

2.1 ?光路設計

為減小熒光檢測設備的整體體積，本文舍棄了體積占用比大的雙通道光路結構，選取了單光路結構。如圖4所示是單光路模塊示意圖，包括反饋PD、檢測PD、LED光源、分光片、濾光片及凸透鏡等光學元器件。另外，為了減輕雜散光對設備檢測的影響，本文設計了光阱結構。

圖4中箭頭所示為光路的傳播路徑，當光路選通時，LED光源點亮，發出一定波長范圍之間的光，主峰為檢測所需的激發光，其波長記為[λ]。發出的光分成兩路進行傳播：一路作為反饋光路;另一路作為檢測光路。反饋光路通過濾光片由反饋PD接收，本文把它作為LED的輸出光強反饋信號，將用于后文的雙閉環反饋電路中。而檢測光路則較為復雜，首先通過濾光片得到帶寬較窄、以[λ]為中心波長的激發光譜，接著是兩塊平行放置的分光片，以[45°]入射角射向第一分光片后，產生的反射光同樣以[45°]射入第二分光片，產生的透射光即作為最終的激發光。激發光經由凸透鏡聚焦到試紙條的熒光物質上，產生主峰波長為[λf]的熒光，熒光經過凸透鏡后由第二分光片反射，產生的反射光通過濾光片后，檢測PD接收其中波長為[λf]附近的光，熒光的光強信號由檢測PD轉化為電信號。

2.2 ?電路設計

為改善熒光信號檢測的精度，需要保證激發光光強的穩定。而在一定范圍內，LED光強與工作電流成線性關系[10]。因此，本文采用較為成熟的光強與電流的雙閉環反饋電路，以減輕激發光對熒光檢測的影響。LED光源本身隨著使用時間的增長，溫度會發生變化，發生光衰現象[11]，LED發出的光強減弱。同時，驅動電路自身存在電流波動，LED光強隨之產生波動。外閉環依靠光強反饋來調整電流的數值大小，使光強輸出達到穩定狀態;內閉環依靠電流反饋使驅動電流輸出達到穩定狀態。

2.3 ?軟件設計

小型熒光檢測設備的軟件部分包含上位機和下位機。上位機包括安卓APP和Java Web服務端，實現了熒光波形曲線的顯示、結果的分析與存儲等功能。下位機選擇的是CC2640芯片，其本質是一塊嵌入式ARM芯片，帶有A/D可編程放大的功能，主要實現試紙條的推送控制、熒光光強信號的掃描采樣以及熒光光強的數據傳輸等功能。

該設備忽略暗電流的影響，直接進入檢測流程。血樣首先在試紙條上完成層析反應，接著傳送裝置推送試紙條勻速通過光電檢測模塊，完成掃描采樣最終得到熒光波形曲線。熒光光強信號的掃描采樣流程如圖5所示。

設備進行初始化后，掃描采樣分三步完成：

1） 預采樣，熒光光強信號由檢測PD轉換為電壓量，經A/D轉換可得到數字量，通道增益選擇默認值;

2） 調整增益，根據滿量程的數字量和預采樣得到的數字量，調整增益的大小，保證再采樣得到的數字量比滿量程的數字量大于0.5，假如兩者比值偏小，那么需調大增益來提高分辨率;

3） 再采樣，增益值調整之后得到更準確的熒光光強信號并記錄數值大小。判斷采樣點數是否達到目標采樣點數，若已達到，則停止采樣，將其作為有效的熒光光強信號數據，否則返回步驟1）。

有效光強信號數據通過藍牙傳輸給安卓手機，安卓APP再上傳到網站Web服務端，經處理后可得到熒光波形曲線，其數據分析結果可保存到本地MySQL數據庫中。

3 ?尋峰算法的實驗對比分析

為了驗證平移窗口尋峰算法的精確度，本文選擇一般多項式擬合法和高斯擬合法作為對比算法，并以高斯擬合法求得的峰位置作為標準值。

本文選取8種CRP濃度不同的校準血樣，其CRP濃度分別為0.50 mg/L，1.84 mg/L，3.00 mg/L，9.09 mg/L，18.18 mg/L，72.72 mg/L，145.44 mg/L，205.00 mg/L，每種濃度做3組實驗，取其平均值作為實際檢測值。各個尋峰算法的尋峰位置檢測值如表1所示，其中每一個數據記錄中包含兩個數字，上面代表[T]峰位置，下面代表[C]峰位置。

根據表1數據，以高斯擬合法求得的結果作為標準，分析計算可得，一般多項式擬合法求得的[T]峰和[C]峰的平均偏差分別是[δ1T=2.25]，[δ1C=2.125]，而平移窗口尋峰算法求得的[T]峰和[C]峰的平均偏差分別是[δ2T=1.125]，[δ2C=1.0]。對比可知，平移窗口尋峰算法的精度相較于一般多項式擬合法，[T]峰精度提升50.0%，[C]峰精度提升52.9%。本文設計的平移窗口尋峰算法的尋峰精確度滿足要求。

4 ?結 ?語

小型熒光檢測設備采用單光路結構、雙閉環反饋電路，既保證了設備體積小，也保證了激發光的穩定。針對影響設備檢測精度關鍵之一的尋峰算法，本文采用操作簡單的平移窗口尋峰算法，通過初尋[T]峰、截取有效波形段以及再次尋峰等步驟，實現對[T]峰和[C]峰的尋找。對CRP的檢測實驗結果表明，該尋峰算法的精度介于一般多項式擬合法和高斯擬合法之間，達到了熒光檢測設備的設計要求。

參考文獻

[1] PYO D， YOO J. New trends in fluorescence immunochromatography [J]. Journal of immunoassay & immunochemistry， 2012， 33（2）： 203.

[2] 蔣樹海，楊發青，崔迎進，等.基于免疫層析的CRP定量檢測試劑研制[J].中國生化藥物雜志，2014，34（1）：76?78.

JIANG Shuhai， YANG Faqing， CUI Yingjin， et al. Development of a quantitative CRP test with lateral flow method [J]. Chinese journal of biochemical pharmaceutics， 2014， 34（1）： 76?78.

[3] 劉翔，杜民，李玉榕，等.熒光免疫層析定量檢測系統的設計與實現[J].電子測量與儀器學報，2013，27（9）：859?866.

LIU Xiang， DU Min， LI Yurong， et al. Design of fluorescence immune?chromatographic quantitative detection system [J]. Journal of electronic measurement and instrument， 2013， 27（9）： 859?866.

[4] 張曉慧，李光韜，張卓莉.C反應蛋白與超敏C反應蛋白的檢測及其臨床意義[J].中華臨床免疫和變態反應雜志，2011，5（1）：74?79.

ZHANG Xiaohui， LI Guangtao， ZHANG Zhuoli. Clinical significances of C?reactive protein and hypersensitive C?reactive protein [J]. Chinese journal of allergy & clinical immunology， 2011， 5（1）： 74?79.

[5] 韓屏，周祖德.高速高精光柵解調器的反饋式相對尋峰算法[J].武漢理工大學學報（信息與管理工程版），2011，33（1）：10?12.

HAN Ping， ZHOU Zude. Feedback relative peak?detection algorithm for high?speed and high?precision grating demodulator [J]. Journal of Wuhan University of Technology （information & management engineering）， 2011， 33（1）： 10?12.

[6] 劉泉，王歡.高速光纖光柵解調的尋峰算法研究[J].武漢理工大學學報，2010，32（6）：59?61.

LIU Quan， WANG Huan. Research on the peak?detection algorithm in the high?frequency demodulation for the fiber Bragg grating [J]. Journal of Wuhan University of Technology， 2010， 32（6）： 59?61.

[7] LEE H W， PARK H J， LEE J H， et al. Accuracy improvement in peak positioning of spectrally distorted fiber Bragg gra?ting sensors by Gaussian curve fitting [J]. Applied optics， 2007， 46（12）： 2205?2208.

[8] 馬永杰，云文霞.遺傳算法研究進展[J].計算機應用研究，2012，29（4）：1201?1206.

MA Yongjie， YUN Wenxia. Research progress of genetic algorithm [J]. Application research of computers， 2012， 29（4）： 1201?1206.

[9] ASAOKA T， KAWAMURA M， KUMAKURA S， et al. Liquid crystal textural analysis based on histogram homogeneity and peak detection algorithm [J]. Liquid crystals， 2012， 39（4）： 415?418.

[10] 方晶璐，牛萍娟，田會娟.電流對LED特性參數的影響[J].電工技術學報，2013，28（z2）：234?238.

FANG Jinglu， NIU Pingjuan， TIAN Huijuan. The influence on characteristics parameters for white?LED with current [J]. Transactions of China electrotechnical society， 2013， 28（S2）： 234?238.

[11] 崔澤英，谷青博.LED光源光衰規律研究[J].半導體技術，2012，37（4）：312?315.

CUI Zeying， GU Qingbo. Research on LED light source lumens depreciation rule [J]. Semiconductor technology， 2012， 37（4）： 312?315.