亞氨基噠嗪類衍生物對人與昆蟲GABA受體的選擇性研究

陳佳麗 ，翟 納 ，陳 達 ，王秀美 ，田亞鋒 ，鄭小嬌 ，劉根炎*

1.武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430205；

2.綠色化工過程教育部重點實驗室（武漢工程大學），湖北 武漢 430205

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是生物體神經系統中重要的抑制性傳導遞質，通過與兩類GABA受體（離子型和代謝型）結合而發揮生理作用。GABA受體是一種多功能的藥物作用靶標，與諸多神經性疾病密切相關［1-2］。離子型GA?BA受體屬于配體門控氯離子通道，是重要的殺蟲劑作用靶標之一，如氟蟲腈和林丹等均是作用于該受體的商品化農用殺蟲劑［3-4］。因此，離子型GABA受體一直是相關領域的研究熱點之一。

離子型GABA受體屬于Cys-loop超家族的一員，一般由5個同源或異源的亞基構成。每個亞基含有1個較長的N-端胞外區、4個疏水的跨膜區（TM1-TM4）和1個胞內區［5］。GABA的結合位點位于親水的胞外區，第二跨膜區（TM2）的大多數氨基酸殘基參與形成了離子通道。GABA與受體結合后，離子通道打開，氯離子流入細胞內部，使細胞膜超極化，從而對生物體的神經傳導產生抑制作用。2014年，Miller等［6］成功解析了人類 GABA受體一個亞型（β3同源五聚體）的三維結構，這一發現為GABA受體的研究提供了重要的科學依據。目前，19個哺乳動物GABA受體的亞基已被鑒定［1］。對昆蟲而言，至今只發現了3種亞基：RDL（resistance to dieldrin，RDL 亞基），GRD（gly?cine-like receptor，過 氨 酸 受 體 ）和 LCCH3（li?gand-gated chloride channel homologue 3，配體門控氯離子通道同系物3）［7-8］。研究表明，這三種亞基中只有RDL可以形成功能性的GABA門控氯離子通道［9］，因此昆蟲GABA受體也被稱為RDL受體。

傳統作用于GABA受體的殺蟲劑，均屬于該受體的非競爭性拮抗劑［3］，能直接作用于離子孔道，阻滯氯離子內流，最終導致昆蟲神經興奮無法抑制而死亡。其中典型的芳基吡唑類殺蟲劑氟蟲腈自20世紀90年代成功上市后，得到了廣泛應用，也引起了研究人員的廣泛關注。但由于長期使用，多種害蟲已對該類殺蟲劑產生不同程度的抗藥性［3-4，10］。研究表明靶標GABA受體發生抗性突變是害蟲產生抗性的主要機制之一，褐飛虱和小菜蛾等害蟲GABA受體第二跨膜區的關鍵氨基酸會產生A’2S和A’2N等突變，從而使這些害蟲對氟蟲腈類殺蟲劑產生數百倍的抗藥性［4，10］。GA?BA受體競爭性拮抗劑與非競爭性拮抗劑具有相似的功能，均可使氯離子通道呈關閉狀態，從而產生殺蟲活性，但二者的結合位點和作用機制不同［11］。傳統的非競爭性拮抗劑直接作用于跨膜區從而阻滯氯離子通道，而競爭性拮抗劑作用于胞外區，與GABA競爭同一結合位點，使GABA無法達到作用位點而導致氯離子通道無法開啟。因此，GABA受體競爭性拮抗劑不會受現有抗藥性機制的干擾，是研發高效新型殺蟲劑的潛在對象。

目前關于昆蟲GABA受體競爭性拮抗劑的報道較少。Gabazine是大鼠GABAA受體一個典型競爭性拮抗劑［12］，有報道證明Gabazine對昆蟲GABA受體也具有一定的拮抗效應［13-15］。Ozoe課題組發現在Gabazine噠嗪環的3位引入芳香基團會使其對昆蟲GABA受體的競爭性拮抗活性明顯增加［16-17］（圖1），但未見文獻報道該類化合物的殺蟲活性。Fr?lund課題組設計并合成了多個系列的五元雜環類化合物，包括異噁唑類、異噻唑類和吡唑類等，實驗結果證明這些化合物均是哺乳動物GABAA受體競爭性拮抗劑［18-20］。除此之外，Rahman等［17］研究發現氰基可能為噠嗪環1位羧酸的生物電子等排體。因此經過結構修飾的亞氨基噠嗪類衍生物有潛力開發為昆蟲GABA受體競爭性拮抗劑的先導化合物。

圖1 Gabazine及其衍生物化學結構Fig.1 Chemical structures of gabazine and its derivatives

昆蟲GABA受體的三維晶體結構還未見報道。本研究采用同源模建的方法，以人GABAAβ3受體的晶體結構為模板，分別構建家蠅（Musca domestica）、褐飛虱（Laodelphax striatellus）和斜紋夜蛾（Spodoptera litura）的RDL GABA受體以及人（Homo sapiens）的α1β2γ2 GABA受體模型，然后將昆蟲GABA受體競爭性拮抗劑亞氨基噠嗪類衍生物與所建模型進行對接，研究亞氨基噠嗪類衍生物與兩種農業害蟲、一種衛生害蟲和一種哺乳動物GABA受體的結合模式和作用機理。我們期望從分子水平預測和闡釋亞氨基噠嗪類衍生物在昆蟲和哺乳動物的GABA受體中選擇性機理，為研發高效、低毒的作用于GABA受體的新型殺蟲劑提供理論指導。

1 實驗部分

本研究所涉及的分子模擬實驗均使用Win?dows版 SYBYL-X 2.1軟件（Tripos Inc.，St.Louis，MO，USA）完成。如未做特殊說明，所用參數均采用默認值。

1.1 目標序列和模板選擇

為構建目標蛋白的三維模型，通過對Uni?ProtKB數據庫進行搜索，尋找到3種目標昆蟲（家蠅、褐飛虱和斜紋夜蛾）和1種哺乳動物（人）的GABA受體的亞基序列，編號分別如下：1）家蠅RDL亞基序列編號Q75NA5；2）褐飛虱RDL亞基序列編號Q0ECT5；3）斜紋夜蛾RDL亞基序列編號G8IIS8；4）人GABA受體α1亞基序列編號P14867，β2亞基序列編號 P47870，γ2亞基序列編號P18507。

對RCSB Protein Data Bank數據庫進行搜尋，未發現已經解析的家蠅等昆蟲的GABA受體三維結構。因此本研究選用人GABAAβ3受體的晶體結構（PDB ID：4COF）為模板，采用同源模建的方法分別構建家蠅、褐飛虱和斜紋夜蛾的RDL GA?BA受體及人α1β2γ2 GABA受體的三維模型。

1.2 構建亞基

利用SYBYL-X 2.1軟件Biopolymer模塊中的Compare Sequence功能，采用Needleman&Wunsch方法將6個目標亞基序列分別與人GABAAβ3模板序列進行比對，得到序列比對的6個MSF文件。在ORCHESTRAR模塊中導入MSF文件，通過構建和分析保守區、搜索并添加疏水環區、添加側鏈、氫鍵優化等步驟分別完成每個目標亞基的構建。

1.3 組合模型

通過分析模板受體人GABAAβ3受體的晶體結構可知，該蛋白是同源五聚的氯離子通道，在構建完成所需的目標亞基后，需通過SYBYL-X 2.1軟件Edit/Merge模塊將3種昆蟲的5個亞基和模板受體4COF疊合后依次組成五聚的氯離子通道。由于人α1β2γ2 GABA受體并不是同源寡聚體，所以將人α1β2γ2 GABA受體與模板4COF進行比對，需要將前者的α1、β2和γ2亞基分別疊合到4COF為模板的各個亞基上，以順時針方向（β2）（γ2）（α1）（β2）（γ2）組合構建人α1β2γ2 GABA受體（見圖2）。

1.4 模型優化

圖2 人α1β2γ2 GABA受體亞基排列的示意圖Fig.2 Schematic diagram of arrangement of human α1β2γ2 GABA receptor subunits

針對所構建的模型，采用能量優化與分子動力學兩種方法對模型結構進行優化，以使各模型獲得能量較穩定的構象。首先在AMBER7 FF99力場下，采用共軛梯度法對每個模型進行能量優化至連續兩次能量梯度差小于0.005 kcal/（mol·nm）。在此基礎上，使用SYBYL-X 2.1軟件中內置的分子動力學模塊Dynamics執行動力學模擬，具體參數為：NPT模式，溫度 300 K，壓力101 325 Pa，步長1 fs，每2.5 ps取樣一次，總時長為500 ps。

1.5 分子對接

運用SYBYL-X 2.1軟件中的Surflex-Docking模塊，自定義氨基酸殘基模式確定受體結合口袋，其中原型分子（protomol）為結合口袋，參數Bloat值和Threshold值確定結合口袋的形狀及大小。將5個亞氨基噠嗪類衍生物（見圖1）分別與模建得到的家蠅、褐飛虱和斜紋夜蛾的RDL GABA受體及人的α1β2γ2 GABA受體的三維模型進行分子對接，分析昆蟲和哺乳動物GABA受體正構位點與其競爭性拮抗劑亞氨基噠嗪類衍生物的結合模式。

2 結果與討論

2.1 同源模建

通過序列同源性比對，我們可以發現目標蛋白的各亞基序列與模板蛋白β3序列亞基同源性較高，模板4COF每條鏈與3種昆蟲的RDL亞基和人GABA受體的α1、β2、γ2亞基序列一致性均大于40%。通常來說，模建蛋白序列與構建的目標蛋白序列一致性大于30%時，通過同源模建方法就可以獲得較為可靠的目標蛋白三維結構模型。因此，在本研究中，針對同源模建家蠅、褐飛虱、斜紋夜蛾的RDL GABA受體和人的α1β2γ2 GABA受體所選取的人GABAAβ3受體作為模板是合理的。

模板蛋白人GABAAβ3受體為5個同源亞基構成的氯離子通道，因而以其為模板構建3種昆蟲GABA受體結構模型時需要對模板蛋白進行拆分，取得每一條模板受體亞基。再分別與3種昆蟲RDL GABA受體亞基序列進行1次序列比對，模建得到每條亞基，然后將模建得到的亞基分別與模板蛋白的亞基進行疊合，組合成最終的蛋白模型，如圖3所示。人α1β2γ2 GABA受體則需要分別對α1、β2和γ2亞基進行序列比對，再將模建所得的各亞基按順時針方向（圖2）分別疊合到模板蛋白的亞基上，組合成為人α1β2γ2 GABA受體結構模型，見圖 3（d）。

圖3 模建的GABA受體三維模型：（a）家蠅，（b）褐飛虱，（c）斜紋夜蛾，（d）人α1β2γ2Fig.3 Three-dimensional models of constructed GABA receptors：（a）housefly，（b）small brown planthopper，（c）common cutworm，（d）human α1β2γ2）

在能量優化方面，利用SYBYL-X 2.1軟件中內置的分子動力學模塊Dynamics對所構建的4個受體模型分別進行了500 ps的分子動力學模擬。所構建的家蠅和褐飛虱GABA受體模型在開始的80 ps內能量變化較大，在隨后的420 ps能量趨于穩定化，波幅較穩定，基本穩定于1 700 kcal/mol和1 900 kcal/mol左右［圖4（a），4（b）］；所構建的斜紋夜蛾GABA受體模型在開始的60 ps內能量快速下降，在接下來的450 ps能量波幅趨于穩定，最后能量基本穩定在1 800 kcal/mol左右［圖4（c）］；所構建的人α1β2γ2 GABA受體模型能量在開始的100 ps內下降非常迅速，在隨后的200 ps緩慢下降，在350ps后趨于平穩狀態，基本能量穩定在1500kcal/mol［圖4（d）］。這表明，所構建的4個受體模型能量上合理且均較穩定。

圖4 GABA受體模型分子動力學能量-時間圖：（a）家蠅，（b）褐飛虱，（c）斜紋夜蛾，（d）人α1β2γ2Fig.4 Plot of potential energies of GABA receptor models versus simulation time for 500 ps molecular dynamics：（a）housefly，（b）small brown planthopper，（c）common cutworm，（d）human α1β2γ2

在構象變化方面，在動力學模擬的最初階段，家蠅、褐飛虱、斜紋夜蛾和人GABA受體的三維結構骨架原子的位置相對于模型最初構象的均方根差值逐漸上升，約350 ps之后，RMSD（Root-Mean-Square Deviation）值分別穩定在0.41、0.75、0.44 nm和0.55 nm左右（圖5），表明體系已趨于穩定，這進一步說明了該模型在結構上的合理性。

圖5 GABA受體模型500 ps分子動力學RMSD-時間圖：（a）家蠅，（b）褐飛虱，（c）斜紋夜蛾，（d）人α1β2γ2Fig.5 Plot of RMSDs of GABA receptor models versus the simulation time for 500 ps molecular dynamics：（a）housefly，（b）small brown planthopper，（c）common cutworm，（d）human α1β2γ2

運用SYBYL/ProTable模塊內拉氏圖對所得到模型的構象進行進一步驗證（圖6）。家蠅、褐飛虱、斜紋夜蛾和人受體結構模型的拉氏圖分別如圖 6（a），6（b），6（c）和 6（d）所示。由圖 6 可知，在模建的4種GABA受體結構模型中，超過99%的氨基酸殘基均處于允許區域內，這驗證了4個受體模型的可靠性。

圖6 GABA受體模型氨基酸Ramachandran圖：（a），家蠅，（b）褐飛虱，（c）斜紋夜蛾，（d）人α1β2γ2Fig.6 Ramachandran graph of GABA receptor models：（a）housefly，（b）small brown planthoppe，（c）common cutworm，（d）human α1β2γ2

2.2 分子對接

根據文獻報道，GABA受體競爭性拮抗劑的結合區域位于膜外區的正構位點，一般由6個loop區（A-F）的氨基酸殘基構成。由于本研究中所構建目標蛋白的序列不同，結合位點的氨基酸殘基也存在一定的差異。對各個受體序列和模型進行分析，對接位點的關鍵氨基酸總結如下。

1）家蠅和褐飛虱：Phe90（loop A）、Glu148（loop B）、Phe150（loop B）、Ser149（loop B）、Tyr198（loop C）、Tyr53（loop D）、Arg55（loop D）。

2）斜紋夜蛾：Phe88（loop A）、Glu146（loop B）、Ser14（loop B）、Phe148（loop B）、Tyr196（loop C）、Arg198（loop C）、Tyr51（loop D）、Arg53（loop D）。

3）人：Phe89（loop A）、Glu146（loop B）、Ser147（loop B）、Tyr196（loop C）、Arg198（loop C）、Tyr53（loop D）。

本研究采用SYBYL-X 2.1軟件C_score模塊對亞氨基噠嗪類衍生物與所模建的4個GABA受體對接結果分別進行評價打分。如表1所示，在家蠅和褐飛虱GABA受體中，相對Gabazine而言，化合物1-4的對接打分均有所提高，這表明在Gabazine噠嗪環的3位引入芳香基團有助于提高該類化合物對昆蟲受體的拮抗活性。其中，化合物3（4-［3-（2-萘基）-1，6-二氫-6-亞氨基噠嗪基］丁酸氫溴酸鹽）在三種昆蟲受體中的打分均最高，這一結果與Rahman等［16-17］的活性測試結果基本一致。此外，所有亞氨基噠嗪類衍生物（1-4）與三種昆蟲GABA受體的對接打分均高于與人α1β2γ2 GABA受體的對接打分，這表明亞氨基噠嗪類衍生物在哺乳動物和昆蟲GABA受體之間作用具有差異性，對昆蟲選擇性更好。化合物3與對人α1β2γ2 GABA受體的對接得分最低為3.49，這表明化合物3與人α 1β2γ2 GABA受體的結合不夠穩定。

表1 亞氨基噠嗪類衍生物與四種GABA受體模型的對接打分Tab.1 Docking scores of the iminopyridazines in four GABA receptor models

以亞氨基噠嗪類衍生物具有最高對接分數的化合物3為例，分析其與三種昆蟲RDL GABA受體及人α1β2γ2 GABA受體模型正構位點的結合模式，具體結果如圖7所示。從對接模式來看，化合物3都是垂直插入三種昆蟲GABA受體的正構位點，這與文獻中所報道的GABA受體競爭性拮抗劑結合模式基本符合［14-17］。化合物3與三種昆蟲GABA受體對接構象差別較小，具有較相似的結合模式。以家蠅GABA受體與化合物3相互作用的結合模式為例，如圖7（a）所示，化合物3的噠嗪環1位取代的丁酸羰基O原子可以和loop C中Thr194側鏈上的羥基H原子形成較穩定的氫鍵；loop B中的Phe150的骨架羰基O原子作為氫鍵受體，與化合物3中6位取代的亞氨基H形成氫鍵，氫鍵距離為0.178 nm，作用較強。化合物3在斜紋夜蛾和褐飛虱GABA受體的作用位點也可形成相似的氫鍵作用［圖7（b）和7（c）］。除了氫鍵作用外，化合物3中噠嗪環3位（R2）取代的2-萘基與loop D中的Tyr53中的苯環產生較強的π-π堆積作用，這也與Rahman等［16］報道的結論相吻合。Rahman等［16-17］的研究表明在噠嗪環的3位引入2-萘基時，所得衍生物在100 μmol/L時，對褐飛虱、斜紋夜蛾和家蠅的GABA受體均表現出較好的拮抗活性。綜上，本研究中所發現的π-π堆積作用可能是化合物3對昆蟲GABA受體產生競爭性拮抗作用的的關鍵之一。此外，loop D中的Arg55側鏈帶一定的正電性，化合物3中1位取代的羧基帶有負電，二者之間可以產生靜電作用，loop A中的Phe90和loop C中的Tyr198可與化合物3產生較強的疏水作用，這與LIU等［14-15］文獻中報道的一致。

在與人的GABA受體模型對接中，筆者發現特征氨基酸殘基Arg55、Tyr148、Tyr196和Ser192和化合物3的距離較遠，未形成氫鍵作用，也未發現特征的π-π堆積作用（圖7d）。此外，化合物3與昆蟲GABA受體的對接打分是與人GABA受體對接打分的2倍及以上（表1），說明其與昆蟲GABA受體結合更穩定。化合物3與家蠅、褐飛虱和斜紋夜蛾GABA受體較穩定的結合模式，可以從一定程度上解釋其與昆蟲GABA受體的結合具有靶標專一性，表明該類對昆蟲與哺乳動物GABA受體具有一定的選擇性。

圖7 化合物3與所構建GABA受體模型的分子對接：（a）家蠅，（b）褐飛虱，（c）斜紋夜蛾，（d）人α1β2γ2Fig.7 Docking results of compound 3 into the constructed GABA receptor models：（a）housefly，（b）small brown planthopper，（c）common cutworm，（d）human α1β2γ2

3 結 語

本論文以人GABAAβ3受體的晶體結構為模板，通過同源模建的方法，分別構建了2種農業害蟲（褐飛虱和斜紋夜蛾）、1種衛生害蟲（家蠅）和1種哺乳動物（人）的離子型GABA受體的三維結構模型，且經能量優化、分子動力學、拉氏圖驗證了所有模型的穩定性和合理性。利用分子對接方法，研究了GABA受體競爭性拮抗劑亞氨基噠嗪類衍生物與所構建模型的結合模式和作用機理。結果表明亞氨基噠嗪類衍生物與3種昆蟲GABA受體對接打分趨勢基本一致，均高于其與人GABA受體的對接打分。亞氨基噠嗪類衍生物的芳香基團可能和昆蟲GABA受體中結合位點loop D區域的Tyr形成π-π堆積作用，從而增強其結合能力，這有可能是亞氨基噠嗪類衍生物對昆蟲和哺乳動物具有選擇性的關鍵因素之一。本研究從分子水平上預測和闡釋了昆蟲GABA受體競爭性拮抗劑對昆蟲和哺乳動物具有選擇性的原因，可以為設計新型競爭性拮抗劑苗頭化合物提供新思路，為研發安全、高效的新型農藥研發提供理論指導。