氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定蜜餞中的甜蜜素含量

程春梅，蘇建國(guó)

（1.浙江醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校，浙江寧波315100；2.淮安市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇淮安223300）

甜蜜素，化學(xué)名稱(chēng)為環(huán)己基氨基磺酸鈉，甜度為蔗糖的30倍～80倍。由于其風(fēng)味較自然，后苦不明顯，熱穩(wěn)定性高，成為目前我國(guó)食品行業(yè)中應(yīng)用最多的一種甜味劑。目前世界上對(duì)甜蜜素的安全性仍存在爭(zhēng)議，因此在實(shí)際使用時(shí)需嚴(yán)格控制其添加量。GB2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定甜蜜素可以在一些常用食品如配制酒、飲料、果凍、冷凍飲品、腐乳、餅干、面包、糕點(diǎn)、熟制豆制品等中按限量使用；在蜜餞涼果中的涼果類(lèi)、話化類(lèi)、果糕類(lèi)中的最大使用量為8.0 g/kg[1]。一些企業(yè)為了節(jié)約成本，減少食糖的使用量，超限量使用甜蜜素，近年來(lái)的監(jiān)督抽查結(jié)果表明，果脯蜜餞類(lèi)產(chǎn)品甜蜜素超限量使用問(wèn)題比較嚴(yán)重。

目前，甜蜜素的檢測(cè)方法有氣相色譜法[2-5]、液相色譜法[6-7]、液相色譜-質(zhì)譜法[8-9]、離子色譜法[10-11]等，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.97-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測(cè)定》規(guī)定了氣相色譜法外標(biāo)法、液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法3種檢測(cè)方法[12]。氣相色譜法外標(biāo)法是在甜蜜素的檢測(cè)工作中最常用的方法。相較于外標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)法由于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和被測(cè)組分處在同一基體中，可以消除基體帶來(lái)的干擾，而且當(dāng)儀器參數(shù)和溫度條件發(fā)生非人為的變化時(shí)，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和樣品組分都會(huì)受到同樣影響，這樣消除了系統(tǒng)誤差，可以提高分析的準(zhǔn)確度和精密度。本文建立氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定果脯蜜餞中甜蜜素的方法，重點(diǎn)研究了樣品前處理?xiàng)l件，內(nèi)標(biāo)物的選擇等。

1 材料與方法

1.1 儀器

VARIAN450氣相色譜儀[附HP-5毛細(xì)管柱（30m×0.32 mm×0.25 μm）、氫火焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）]：美國(guó)瓦里安；SB-800D 超聲波振蕩器：寧波新芝生物科技股份有限公司；Eppendorf 5804R冷凍離心機(jī)：德國(guó)艾本德；NP-30S渦旋混合器：常州恩培儀器制造有限公司；AR2140天平（感量1 mg、0.1 mg）：美國(guó)奧豪斯。

1.2 試劑

甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液[GBW（E）100173，濃度為10.00 mg/mL]：北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司；乙酸乙酯、甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯（色譜純）：天津市化學(xué)試劑研究所有限公司；硫酸、亞硝酸鈉、氯化鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正庚烷：黃驊市江峰化學(xué)品有限公司；以上試劑皆為分析純；水為蒸餾水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的制備及衍生化

準(zhǔn)確移取1.00 mg/mL甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00、2.50、5.00、10.0、25.0 mL于50 mL容量瓶中，加水定容。配成標(biāo)準(zhǔn)溶液系列濃度為：0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/mL，另外加一個(gè)1.00 mg/mL甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液20.0 mL于50 mL帶蓋離心管中，加入2 μL內(nèi)標(biāo)物。離心管置試管架上冰浴5 min后，準(zhǔn)確加入5.00 mL正庚烷，加入2.5 mL亞硝酸鈉溶液，2.5 mL硫酸溶液，蓋緊離心管蓋，搖勻，在冰浴中放置30 min，其間振搖3次～5次；加入2.5 g氯化鈉，蓋上蓋后置旋渦混合器上振動(dòng)1 min，4℃離心（3 000 r/min）10 min分層，取上清液放置1℃～4℃冰箱冷藏保存以備進(jìn)樣用。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)標(biāo)物的選擇

氣相色譜內(nèi)標(biāo)法定量檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)物的選擇是關(guān)鍵，通常氣相色譜法內(nèi)標(biāo)物應(yīng)該是樣品中不含有且出峰時(shí)間與被測(cè)組分相接近的純物質(zhì)。本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[2，13-16]，考察甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯、乙酸丁酯4種物質(zhì)，在4支50 mL帶蓋離心管中各加入20 mL水，分別加入2 μL的乙酸丁酯、甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯，按照1.3的條件進(jìn)行處理，參照GB 5009.97-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)的條件，采用HP-5毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），柱溫升溫程序條件，60℃恒溫6 min，進(jìn)樣口溫度230℃，氫火焰離子化檢測(cè)器（FID），溫度260℃，取正庚烷層1 μL進(jìn)行檢測(cè)。甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯、乙酸丁酯4種物質(zhì)的色譜圖見(jiàn)圖1～圖4。

通過(guò)研究比較所選定4種內(nèi)標(biāo)物的出峰時(shí)間，甲苯和乙酸丁酯出峰時(shí)間比較合適，間二甲苯的峰與甜蜜素時(shí)間較為接近，鄰二甲苯出峰時(shí)間比較晚，因此本文選擇乙酸丁酯作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，色譜圖見(jiàn)圖5。

圖1 甲苯色譜圖Fig.1 Chromatogrames of methylbenzene

圖2 間二甲苯色譜圖Fig.2 Chromatogrames of m-xylene

圖3 鄰二甲苯色譜圖Fig.3 Chromatogrames of o-xylene

圖4 乙酸丁酯色譜圖Fig.4 Chromatogrames of butyl acetate

圖5 甜蜜素標(biāo)樣和乙酸丁酯色譜圖Fig.5 Chromatogrames of sodium cyclamate and butyl acetate

2.2 提取方法的改進(jìn)

采用GB 5009.97-2016的處理方法，操作起來(lái)相對(duì)復(fù)雜，而且蜜餞樣品一般在實(shí)驗(yàn)室操作時(shí)，采用剪刀剪碎的方式處理樣品，可能存在提取轉(zhuǎn)移不完全的問(wèn)題，采用蜜餞樣品剪刀剪碎后，精確稱(chēng)取打碎、混勻的樣品3 g～5 g于50 mL離心管中，加水，振搖，超聲提取20 min，混勻，加水至50 mL，混勻，準(zhǔn)確移取20 mL于50 mL離心管中，加入2 μL乙酸丁酯，按1.3的條件進(jìn)行衍生，然后離心，取正庚烷層用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后1 μL上機(jī)檢測(cè)，色譜圖見(jiàn)圖6。

圖6 蜜餞樣品色譜圖Fig.6 Chromatogrames of candied fruit sample

2.3 色譜條件的優(yōu)化

圖5、圖6表明，采用 HP-5毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），柱溫升溫程序條件，60 ℃恒溫6 min，進(jìn)樣口溫度230℃，氫火焰離子化檢測(cè)器（FID），溫度260℃進(jìn)行檢測(cè)，可以達(dá)到很好的分離檢測(cè)效果，但是蜜餞樣品基質(zhì)復(fù)雜，在60℃條件下分離基質(zhì)中的一些雜質(zhì)可能殘留在色譜柱中對(duì)柱子造成污染，也會(huì)有部分雜質(zhì)在分析下一個(gè)甚至多個(gè)樣品時(shí)被沖出來(lái)，對(duì)分析造成干擾，因此采取60℃保持6 min分析后，以40℃/min升溫至200℃保持3 min的方式去除雜質(zhì)，60℃平衡2 min后分析下一個(gè)樣品。

2.4 曲線方程、檢出限

在色譜條件下，將濃度為：0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)樣品移取20 mL于50 mL離心管中，加入2 μL乙酸丁酯，在1.3條件下衍生后依次從低濃度到高濃度進(jìn)樣分析，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)分別進(jìn)樣10次，進(jìn)樣量1 μL，以甜蜜素的濃度為橫坐標(biāo)，甜蜜素與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比（取十次進(jìn)樣平均值）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程為y=15.825x+0.098 5，其線性相關(guān)系數(shù)為0.999 0。

選取未檢出甜蜜素的蜜餞樣品，剪碎，準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g樣品于50 mL離心管中，加水，加入2 μL乙酸丁酯，加入1.00 mg/mL甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00 mL，按2.2的方法提取定容至50 mL。按1.3的方法進(jìn)行衍生，在選定的氣相色譜條件進(jìn)行分析，在記錄的色譜圖中，根據(jù)3倍噪聲所對(duì)應(yīng)的濃度值計(jì)算出方法的檢出限，取樣量為5 g時(shí)，本方法的檢出限為0.008 g/kg。

2.5 方法的精密度及加標(biāo)回收率

準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g蜜餞樣品，按2.2的方法處理衍生后進(jìn)樣分析，計(jì)算樣品中甜蜜素的含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=10），甜蜜素含量為3.200 0 mg/kg，RSD為3.97%。按照國(guó)標(biāo)方法外標(biāo)法檢測(cè)，甜蜜素含量為3.1940mg/kg，RSD為6.69%。

準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g蜜餞樣品于50 mL離心管中，加水15 mL，加入1.00 mg/mL甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00 mL，按2.2的方法提取定容至50 mL。移取提取液20 mL于50 mL離心管中，加入2 μL乙酸丁酯，按1.3的方法進(jìn)行衍生，在選定的氣相色譜條件進(jìn)行分析，平行測(cè)定5次，結(jié)果如表1所示。按照國(guó)標(biāo)方法外標(biāo)法檢測(cè)，被測(cè)樣品加標(biāo)回收率在80.64%～107.68%之間，本方法（內(nèi)標(biāo)法）被測(cè)樣品加標(biāo)回收率在88.46%～104.26%之間。

數(shù)據(jù)表明，內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，相對(duì)外標(biāo)法精密度更高。

3 結(jié)語(yǔ)

1）該試驗(yàn)建立了氣相色譜法內(nèi)標(biāo)法測(cè)定蜜餞中甜蜜素的方法，內(nèi)標(biāo)法是將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物，加入到準(zhǔn)確稱(chēng)量的試樣中，根據(jù)被測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量以及其在色譜圖上相應(yīng)的峰面積（或峰高）比，來(lái)計(jì)算被測(cè)組分的含量，由于內(nèi)標(biāo)物和試樣被測(cè)組分在同一分析體系內(nèi)，可減小基質(zhì)效應(yīng)的影響；由于內(nèi)標(biāo)物與被測(cè)組分的峰面積的比值不受進(jìn)樣量波動(dòng)影響，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性和重復(fù)性較國(guó)標(biāo)方法好。

表1 樣品加標(biāo)回收率Table 1 The recovery of the test

2）蜜餞基質(zhì)復(fù)雜，糖類(lèi)含量高，衍生后用正庚烷提取時(shí)，分層不清晰，因此采用衍生后，用正庚烷振搖提取，然后離心，取上層清液過(guò)濾后進(jìn)樣。

3）采用HP-5毛細(xì)管柱，程序升溫：初溫60℃保持6 min，以40℃/min升溫至200℃保持3 min，既可以達(dá)到很好的分離效果，也能夠消除基質(zhì)在柱子中的殘留，避免污染儀器和對(duì)下面的試樣分析造成干擾。

4）通過(guò)試驗(yàn)得到甜蜜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=15.82x+0.098，R2=0.999 0，加標(biāo)回收率為88.46%～104.26%之間，方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.97%，根據(jù)3倍噪聲所對(duì)應(yīng)的濃度值計(jì)算出方法的檢出限，取樣量為5 g時(shí)，檢出限為0.008 g/kg。綜上，該方法具有較高的準(zhǔn)確度、精密度和回收率，線性關(guān)系好，適合在檢測(cè)過(guò)程中推廣應(yīng)用。