明黨參中游離氨基酸與核苷類成分的同時測定及品質評價

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(1.常州市中醫醫院,江蘇常州 213003; 2.南京中醫藥大學藥學院,江蘇南京 210023)

明黨參(ChangiumsmyrnioidesWollf)是我國華東地區特有的傘形科多年生草本植物[1-2]。其根部經燙煮、去皮等處理后即為藥材明黨參,可用于治療肺熱咳嗽、嘔吐反胃、食少口干、目赤眩暈、疔毒瘡瘍等癥[3];除藥用外,亦常作滋補品食用[4]。明黨參藥材及植株各部位含有揮發油、多糖、不飽和脂肪酸、香豆素、膽堿等多種化學成分,具有增強免疫功能、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、抗凝血等藥理作用[5-8]。其中,氨基酸和核苷類物質與明黨參補益功能相關,可為生命活動提供營養,許多成分如精氨酸、鳥苷、腺苷等,又具有抗疲勞、調節免疫、調節心血管系統等藥理作用[6,9],此外,味覺氨基酸還影響明黨參的呈味。

國內外研究主要采用高效液相色譜法、全自動氨基酸分析儀法和液相色譜-質譜聯用法測定氨基酸含量[10-16]。其中高效液相色譜法可利用紫外檢測器直接檢測,但需先進行柱前衍生化處理。全自動氨基酸分析儀具有較固定的測定規程,但周期相對較長,一般需50 min以上。液相色譜-質譜聯用法測定快速、便捷,但需根據具體樣品調整色譜和質譜條件。核苷類成分主要采用高效液相色譜法測定,多以甲醇-水、甲醇-磷酸或乙腈-甲酸為流動相[17-19]。前期研究僅對明黨參新鮮根部和炮制品中氨基酸含量進行測定,已測得18種游離氨基酸[11-13],但尚未對根以外部分及組織培養材料進行研究,亦未見對其中核苷類成分的研究報道。

本實驗結合預實驗選取已報道的18種游離氨基酸中人體蛋白質組分氨基酸和藥用氨基酸共計11種為游離氨基酸測定指標,同時,選取11種與生命代謝和發揮藥理作用相關的常見核苷與堿基作為核苷類測定指標。本研究運用超快速液相色譜-四極桿離子阱質譜聯用法(UFLC-Qtrap-MS/MS)同時、快速檢測明黨參葉、柄、根以及組織培養物中11種游離氨基酸和11種核苷類成分,從游離氨基酸與核苷角度揭示不同樣品的品質差異,為進一步合理利用明黨參資源提供啟示與參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

明黨參植株 采集于南京中醫藥大學仙林校區藥苑,分揀出葉、柄和根;明黨參組織培養材料 獲取自前期實驗[20-21],其中再生小植株先由愈傷組織誘出叢生芽[22],再在含1.0 mg/L 6-芐氨基嘌呤的培養基上繼代一次后轉至含1.0 mg/Lα-萘乙酸的培養基上誘導生根而得,收獲小植株并分揀出葉、柄和根;11種氨基酸和11種核苷對照品:脯氨酸(批號:B21914)、纈氨酸(批號:B21936)、亮氨酸(批號:B21925)、天冬氨酸(批號:B21934)、谷氨酸(批號:B21916)、賴氨酸(批號:B21922)、甲硫氨酸(批號:B21913)、組氨酸(批號:B21938)、苯丙氨酸(批號:B21910)、精氨酸(批號:B21920)、酪氨酸(批號:B21924)、尿嘧啶(批號:100469-200401)、腺嘌呤(批號:110886-200001)、次黃嘌呤(批號:B20211)、鳥嘌呤(批號:140631-200904)、胸苷(批號:1001182663)、胞苷(批號:100982718)、尿苷(批號:887-200202)、2′-脫氧鳥苷(批號:1000943454)、腺苷(批號:110879-200202)、肌苷(批號:40669-201104)、鳥苷(批號:1001103046) 純度均大于98%,上海源葉生物科技有限公司;甲酸 色譜純,德國默克公司;乙腈 色譜純,德國默克公司。

ABSciex QTRAP 5500質譜儀 美國ABSciex公司;LC-20A快速液相儀 日本島津公司;BT125D十萬分之一電子天平 德國賽多利斯公司;ME36S百萬分之一電子天平 德國賽多利斯公司;KH-500DB數控超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司;TGL-16B型離心機 上海安亭科學儀器廠;FD-1A-50真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;Milli-Q Direct 8超純水儀 德國默克密理博公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液制備 精密稱取22種對照品,用純水配制成對照品母液。精密吸取各母液2 mL,用純水定容至50 mL,得到混合對照品母液,其中各對照品濃度見表2。

1.2.2 供試品溶液制備 明黨參樣品經冷凍干燥,研粉,過四號篩,稱取樣品粉末1.0000 g,置50 mL錐形瓶,加20 mL超純水,于室溫下超聲(100 kHz)提取1 h,過濾,濾液在12000 r·min-1離心10 min,取上清液1 mL,加超純水定容至10 mL,過0.22 μm微孔濾膜后備用。

1.2.3 色譜條件 采用Waters XBridge Amide(2.1 mm×100 mm,3.5 μm)色譜柱,流動相為0.2%甲酸(A)-0.2%甲酸乙腈溶液(B)梯度洗脫(0～2.5 min,15% A;2.5～5 min,15～50% A;5～7 min,50% A;7～8 min,50～15% A;8～11 min,15% A)[19]。流速為0.6 mL·min-1,進樣量為2 μL,柱溫為30 ℃。

1.2.4 質譜條件 采用電噴霧離子源,多反應監測模式(multiple reaction monitoring,MRM)進行正離子檢測,氣簾氣壓35 psi,Gas1氣壓55 psi,Gas2氣壓55 psi,溫度550 ℃,噴霧電壓為5500 V。

1.2.5 標準曲線、檢測限和定量限 取1.2.1項下混合對照品母液,逐級稀釋成一系列混合對照品溶液,分別過0.22 μm微孔濾膜后備用。精密吸取不同濃度的混合對照品溶液分別于1.2.3和1.2.4項所述色譜-質譜條件下測定,以峰面積(Y)對濃度(X)進行線性回歸,確定回歸方程、相關系數和線性范圍,檢測限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ)分別取信噪比S/N=3和S/N=10進行計算。

1.2.6 方法學考察

1.2.6.1 精密度考察 取混合對照品溶液,于1.2.3和1.2.4項所述色譜-質譜條件下連續進樣6次,計算各成分6次峰面積的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.2.6.2 重復性考察 稱取6份明黨參樣品(A1),按1.2.2項所述制備成供試品溶液,在1.2.3和1.2.4項所述色譜-質譜條件下測定,以峰面積計算6份樣品測定結果RSD值。

1.2.6.3 穩定性考察 稱取明黨參樣品(A1),按1.2.2項所述制備成供試品溶液,在1.2.3和1.2.4項所述色譜-質譜條件下,于0、2、4、8、12、24 h分別進樣測定,以峰面積計算6個時間點測定結果的RSD值。

1.2.6.4 加樣回收率考察 稱取明黨參樣品(A3),精密加入高、中、低3個水平的對照品,每一水平3次重復,共9份。按1.2.2項所述制備供試品溶液并在1.2.3和1.2.4項所述色譜-質譜條件下進樣測定,以峰面積計算回收率及RSD值。

1.2.7 明黨參樣品測定 將明黨參樣品按1.2.2項所述制成供試品溶液,于1.2.3和1.2.4項所述色譜-質譜條件下進樣測定,每一樣品重復3次。

1.3 數據處理

根據線性關系計算樣品中氨基酸和核苷類成分含量,利用Excel統計樣品中測得的游離氨基酸和核苷類成分總數量與總含量、人體必需氨基酸數量和味覺氨基酸含量,并進行逼近理想點排序(technique for order preference by similarity to an ideal solution,TOPSIS)。應用SPSS Statistics 22.0分別進行樣品中氨基酸和核苷類成分的主成分分析(principal component analysis,PCA)。

2 結果與分析

2.1 色譜-質譜條件優化結果

預實驗對色譜柱溫(27、30、35 ℃)、流動相流速(0.4、0.6、0.8 mL·min-1)和質譜MRM參數進行了考察,結果表明柱溫30 ℃,流動相流速0.6 mL·min-1時各成分分離效果最佳,各成分保留時間和優化后的MRM參數見表1。

表1 待測成分保留時間和MRM參數Table 1 Retention time and MRM parameters of component to be tested

續表

2.2 標準曲線、檢測限和定量限

22種待測成分線性回歸方程、線性范圍、相關系數、檢測限和定量限見表2,各成分在各自線性范圍內線性關系良好,相關系數均不低于0.9973,表明所得標準曲線可靠。

表2 待測成分標準曲線、檢測限和定量限Table 2 Standard curves,LOD and LOQ of component to be tested

2.3 方法學考察

本實驗所建方法的精密度、重復性、穩定性和加樣回收率考察結果見表3,RSD值均小于5%,回收率均在98.62%～100.64%之間,表明儀器精密度、方法重復性和待測成分穩定性良好,該測定方法準確可靠。

表3 方法學考察結果Table 3 Results of methodological evaluation

2.4 氨基酸類成分分析

2.4.1 氨基酸總含量與種類分析 實驗測得明黨參樣品中游離氨基酸種類及總含量分別如圖1和圖2所示。原植物葉、柄、根和再生植株葉、柄中氨基酸種類較多,說明該類成分隨著細胞分化程度的增高而積累。但再生根中種類較少,僅檢出3種,相比原植物根大大減少,這可能由兩者結構、功能上的差異所致。氨基酸類成分組成及含量見表4。栽培品多年生根外形膨大,為重要的營養儲藏器官,檢出5種人體必需氨基酸,而組培再生根較細弱,主要發揮固著植株和吸收營養的功能。游離氨基酸總含量的最低值(葉愈傷組織)和最高值(葉柄懸浮細胞)均存在于脫分化狀態的培養樣品中。該類成分在植物體內既是營養物質,又在某些條件下發揮滲透調節功能,如脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酸等[23-25],懸浮細胞在液體培養基中培養,相較于愈傷組織其環境滲透壓改變較大,細胞相應產生更多滲透調節物質,這可能是導致該樣品游離氨基酸總量高的原因之一。

圖1 明黨參樣品中氨基酸類成分種類Fig.1 Total numbers of amino acids in Changium smyrnioides Wollf samples注:A1-原植物葉;A2-原植物柄;A3-原植物根;B1-再生植株葉;B2-再生植株柄;B3-再生植株根;C1-葉源愈傷組織;C2-柄源愈傷組織;D1-葉源懸浮細胞;D2-柄源懸浮細胞；圖2～圖5同。

圖2 明黨參樣品中氨基酸類成分總含量Fig.2 Total contents of amino acids in Changium smyrnioides Wollf samples

表4 樣品中氨基酸類成分含量(μg·g-1)Table 4 Contents of amino acids in samples(μg·g-1)

2.4.2 氨基酸類主成分分析 明黨參各樣品中游離氨基酸含量經降維分析,以特征值>1,方差貢獻率>5%,累積貢獻率>70%為標準,選取了4個主成分(表5),累計貢獻率為86.888%,各主成分對氨基酸指標的載荷和評分系數見表6。F1主要反映谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、脯氨酸和組氨酸信息,F2反映甲硫氨酸和亮氨酸含量,F3代表苯丙氨酸和天冬氨酸,F4代表酪氨酸和纈氨酸。計算四個主成分得分并進一步通過各自方差貢獻率的權重計算出各樣品中氨基酸類成分的綜合評分F值,F=0.404F1+0.258F2+0.187F3+0.151F4(表7)。評價結果顯示,以游離氨基酸為指標,明黨參栽培品根品質最佳,其次為離體培養再生葉。

表5 氨基酸類主成分特征值和方差貢獻率Table 5 Eigenvalue and variance contribution rate of principal components of amino acids

表6 氨基酸類主成分載荷和評分系數Table 6 Factor load and score coefficient matrix of principal components of amino acids

表7 氨基酸類主成分得分和綜合評價Table 7 Principal component score and comprehensive evaluation of amino acids

2.4.3 味覺氨基酸分析 將明黨參樣品中的氨基酸歸為甜、苦、鮮和芳香四類[26-27],其分布如圖3所示。四類味覺氨基酸在不同樣品中含量差異較大,其中,原植物葉和柄懸浮細胞中四者分布較為均衡,其余離體培養樣品大多缺失一些類別的味覺氨基酸。原植物根中含較多苦味和甜味氨基酸,是藥材明黨參“味甘、微苦”[3]的物質基礎之一。甜味、鮮味和芳香類氨基酸最高含量均存在于柄懸浮培養細胞中,該培養材料生長狀況也較為旺盛[20],提示著其為味覺氨基酸的一種可利用資源。再生葉和柄中含有較多的甜味及苦味氨基酸。明黨參由于種子萌發率低、自然競爭力較弱等原因導致其實生苗較難獲得[28-30],而組培再生芽易于獲得,具有一定的芽菜開發價值。

圖3 明黨參樣品中味覺氨基酸含量Fig.3 Contents of taste-active amino acids in Changium smyrnioides Wollf samples

2.5 核苷類成分分析

2.5.1 核苷總含量與種類分析 明黨參樣品中測得核苷類成分總數量與總含量分別如圖4和圖5所示,核苷類成分具體含量見表8。分化器官中核苷種類數總體稍稍多于脫分化樣品,其中以原植物葉中種類最多,但核苷類總含量方面呈現出相反趨勢,脫分化細胞中總含量高于分化器官,其中柄懸浮培養細胞中總含量最高,說明脫分化培養狀態雖然可能缺失對個別核苷類成分如次黃嘌呤、腺嘌呤的積累,但利于其他核苷成分如鳥苷、腺苷的大量積累。該類成分多具有抗菌、抗腫瘤、免疫調節、鎮靜等藥理作用[9,18],提示著明黨參愈傷組織、懸浮細胞等脫分化的培養材料為此類成分的潛在資源。

表8 樣品中核苷類成分含量(μg·g-1)Table 8 Contents of nucleosides in samples(μg·g-1)

圖4 明黨參樣品中核苷類成分種類Fig.4 Total numbers of nucleosides in Changium smyrnioides Wollf samples

圖5 明黨參樣品中核苷類成分總含量Fig.5 Total contents of nucleosides in Changium smyrnioides Wollf samples

2.5.2 核苷類主成分分析 明黨參樣品中核苷類成分含量經降維分析,以特征值>1,方差貢獻率>5%,累積貢獻率>70%為標準,選取了3個主成分(表9),累計貢獻率為85.001%,各主成分對核苷類指標的載荷和評分系數見表10。F1主要反映鳥苷、鳥嘌呤、尿苷、尿嘧啶和腺苷的信息,F2主要代表2′-脫氧鳥苷、肌苷、腺嘌呤和胸苷,F3代表胞苷。計算三個主成分得分,并進一步算出10種樣品中核苷類成分的綜合評分F值,F=0.467F1+0.338F2+0.195F3(表11)。結果顯示,以核苷類成分為指標,明黨參柄懸浮培養細胞品質最佳,其次為原植物葉。結合表8可見,F1中的腺苷與鳥苷含量在所有樣品中均明顯高于其他成分,腺苷具降血壓、抗血小板聚集、鎮靜中樞神經、調節睡眠等功能[31-32],鳥苷具免疫調節、防心律失常、改善心腦血液循環等作用[9,33],柄懸浮細胞中這兩者含量也尤為突出,可結合發酵工程以積累腺苷與鳥苷成分為目標對該懸浮培養體系進一步研究。原植物葉為藥材采收時被大量廢棄的部分,亦可作為核苷類資源合理利用。

表9 核苷類主成分特征值和方差貢獻率Table 9 Eigenvalue and variance contribution rate of principal components of nucleosides

表10 核苷類主成分載荷和評分系數Table 10 Factor load and score coefficient matrix of principal components of nucleosides

表11 核苷類主成分得分和綜合評價Table 11 Principal component score and comprehensive evaluation of nucleosides

2.6 基于TOPSIS法的綜合評價

表12 明黨參樣品TOPSIS分析結果Table 12 Result of TOPSIS evaluation for Changium smyrnioides Wollf samples

3 結論

本研究建立了以UFLC-Qtrap-MS/MS同時檢測明黨參原植物及其組培樣品中11種游離氨基酸與11種核苷類成分的方法。22種成分在一定濃度范圍內線性關系良好,精密度、重復性、穩定性和回收率考察RSD值均小于5%,平均加樣回收率在98.62%～100.64%之間,表明該測定方法準確可靠,可供明黨參中11種游離氨基酸與11種核苷的同時、快速測定。

不同狀態的明黨參樣品中游離氨基酸與核苷類成分有一定差異。原植物和再生植株中成分種類較多,而懸浮細胞中總含量較高。柄懸浮細胞中所測11種游離氨基酸與11種核苷總含量均為最高,分別為3682.01、6241.90 μg·g-1,該樣品中味覺氨基酸含量豐富,其中甜味和鮮味氨基酸含量也居所有樣品首位。主成分分析顯示以游離氨基酸為指標,原植物根品質最佳,其次為再生葉;以核苷類成分為指標,柄懸浮細胞品質最佳,其次為原植物葉。TOPSIS法綜合兩類成分進行評定認為柄懸浮細胞最優,其次為原植物根。由此可見,明黨參傳統藥食兩用的根部、被廢棄的葉片和利用組培技術獲得的再生葉、柄懸浮細胞均具有與氨基酸和核苷相關的開發價值,該結果為明黨參資源的合理利用提供參考。