不同南極磷蝦產品中蛋白的營養價值評價

徐蓓蓓,姜曉明,薛 勇,李兆杰,薛長湖

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

現代營養學理論認為,蛋白質的營養價值與蛋白質的氨基酸組成密切相關,食物蛋白質的氨基酸組成越接近人體蛋白質的組成,這種蛋白質越容易被人體吸收[1]。蛋白質是構成人體成分的基本物質,對食物蛋白質營養價值進行評價是食物營養學最基本的內容。1973年世界衛生組織(WHO)和聯合國糧農組織(FAO)提出了評價蛋白質營養價值的氨基酸模式[2]。除了蛋白質氮含量高低以外,食物蛋白質的營養價值主要取決于其必需氨基酸的組成和比例,如果必需氨基酸組成接近于人體必需氨基酸模式:EAA/TAA在 40%左右,EAA/NEAA≥60%,可有效提高蛋白質的吸收利用率及應用價值[3]。

研究表明磷蝦含有豐富的蛋白質[4],是全球最大的潛在蛋白質資源庫[5],其粗蛋白含量64.44%,粗脂肪含量5.14%,粗灰分含量10.90%,無氮浸出物含量19.52%[6];18種氨基酸總量為57.16%,其中8種人體必需氨基酸含量為25.88%,占氨基酸總量的45.25%;EAAI為54.94,其構成比例符合FAD/WHO的標準[7]。南極磷蝦整蝦含有11.9%～15.4%的蛋白質[8],南極磷蝦蛋白的營養高于牛乳蛋白和一般的畜禽肉蛋白,含有全部種類的人體必需氨基酸,必需氨基酸的總量達到212.1 mg/g 蛋白質[9]。超過FAO/WHO/UNU(2007)對成人(嬰幼兒)食品蛋白質中必需氨基酸的要求[10]。必需氨基酸所占的比例也優于其它蝦類,EAA/TAA和EAA/NEAA分別為45.28 和82.74[11]。南極磷蝦作為一種重要的海洋性生物資源,具有重要的地位,其深度開發利用仍是世界各國亟待破解的一個難題[12]。

此外有文獻指出,高溫加熱可以使原料蛋白質的分子結構特征、溶解度和養分降解特性在一定程度上發生改變[13],而且蛋白質分子結構特征(酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶和二級結構等)對蛋白質品質、營養價值、可利用性和消化行為也有影響[14]。因此,本研究通過分析經過不同加工處理的南極磷蝦產品蛋白質分子結構特征與營養價值之間的關系,以期為完善磷蝦蛋白營養價值評價體系、提高磷蝦蛋白質資源利用效率提供依據,并從營養價值角度闡述南極磷蝦蛋白可作為蛋白源的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍南極磷蝦(E.superba) 中國水產有限公司;磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12 H2O)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·7H2O)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、磷酸二氫鉀(KH2PO4) 上海國藥集團有限公司;乙醇、鹽酸、氯仿、甲醇、三氯乙酸、氯化鉀、溴化鉀、乙酸 、氫氧化鈉等 均為分析純。

AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;Kjeltec TM 8400型全自動凱氏定氮儀 丹麥Foss公司;Biochrom 30 Ltd型氨基酸自動分析儀 英國Biochrom公司;Nicolet 6700 FT-IR傅立葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher公司;Leica Tcs Sp2型激光共聚焦顯微鏡 德國Leica公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 南極磷蝦產品的制備 南極磷蝦產品的制備參考趙偉、薛長湖[15-16]的方法并進行適當改進。冷凍南極磷蝦經去殼凍干后得到蝦肉。南極磷蝦經清水漂洗后去殼采肉,再用10 ℃左右清水漂洗(以碎冰降溫)、擠壓、瀝水5～10 min,凍干得到蝦糜。取冷凍南極磷蝦蝦糜,流水解凍,按照2∶1 (w/v)加水,100 ℃蒸汽處理20 min,擠壓,瀝干,60 ℃熱風干燥8 h后粉碎得普通磷蝦粉。普通蝦粉加入95%乙醇(1/10,w/v)脫脂處理10 h,過濾除去醇溶液,濾渣經自然風干燥10 h即得脫脂磷蝦粉。脫脂蝦粉加入0.3 mol/L HCl(1/10,w/v)酸處理1 h,離心取沉淀重復3次,沉淀經60 ℃熱風干燥8 h后即為脫氟磷蝦粉。

1.2.2 5種南極磷蝦產品的基本成分分析 水分含量:采用直接干燥法測定,參照國標GB/T 5009.3-2010[17];蛋白質含量:采用凱氏定氮法測定,參照國標GB/T 5009.5-2010[18];總脂含量:采用氯仿/甲醇抽提法,參照Folch的方法[19];灰分含量:參照國標GB/T 5009.4-2010[20];氨基酸組成:參照國標GB/T 5009.124-2003[21]。

1.2.3 5種南極磷蝦產品中組成蛋白質的種類及含量 測定參考徐蓓蓓等[22]的方法。精確稱取定量的磷蝦產品與10倍體積的磷酸鹽緩沖液A(15.5 mmol/L Na2HPO4·12 H2O,3.38 mmol/L KH2PO4,pH7.5)混合、分散、離心;所得沉淀重復上述操作。將兩次離心后的上清液合并,得到上清a和沉淀a;向上清a中加入TCA,使TCA終濃度達到5%;離心,得到沉淀(肌漿蛋白);向沉淀a加入10倍體積的磷酸鹽緩沖液B(0.5 mol/L KCl,15.5 mmol/L Na2HPO4·12 H2O,3.38 mmol/L KH2PO4,pH7.5)混勻,離心,得到上清(肌原纖維蛋白)和沉淀c;將沉淀c用0.1 mol/L的NaOH浸提10 h后離心,得到上清(堿溶性蛋白)和沉淀(肌基質蛋白)。所提取蛋白質的定量方法,均采用凱氏定氮法[14]。

1.2.4 5種南極磷蝦產品中蛋白的SDS-PAGE分析 參照Laemmli的電泳方法[23],1 g蝦肉、蝦糜、普通蝦粉、脫脂蝦粉和脫氟蝦粉加入9 mL的5% SDS,均質,離心,離心后上清液即為總蛋白。

電泳條件:蝦肉、蝦糜、普通蝦粉和脫脂蝦粉的分離膠濃度為10%,脫氟蝦粉的分離膠濃度調整為15%,濃縮膠濃度為5%,電泳電壓為濃縮膠80 V,分離膠100 V,染色液為1%的考馬斯亮藍R-250溶液,脫色液為甲醇∶乙酸∶水(3∶1∶6)的混合溶液。

1.2.5 5種南極磷蝦產品的共聚焦激光掃描顯微鏡觀察 參照Donato等[24]的方法。將羅丹明B加入到少量試樣中,以熒光標記蛋白質,振蕩5 min,用超純水把多余的熒光劑洗去。取適量的樣品均勻涂抹于載玻片,緩慢按壓蓋玻片以防氣泡產生。以共聚焦激光掃描顯微鏡(Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM)斷層掃描得到穩定的共聚焦圖片,發射波長543 nm,避光操作。

1.2.6 5種南極磷蝦產品的紅外光譜分析 將適量的南極磷蝦產品與光譜純KBr混合壓片,以傅里葉紅外光譜儀進行紅外光譜測試。條件:掃描范圍4000～400 cm-1;掃描數64;分辨率4 cm-1;測試溫度25 ℃。

1.3 營養評價

1.3.1 氨基酸比值系數法 氨基酸比值系數法根據氨基酸平衡理論,采用WHO/FAO提出的必需氨基酸氨基酸模式譜,分別計算出樣品蛋白質中氨基酸比值(RAA)、氨基酸比值系數(RC)和氨基酸比值系數分(SRC),計算公式如下[25]:

SRC=100-CV×100

式中:CV-RC的變異系數,CV=標準差/均數。

1.3.2 氨基酸評分(AAS)和化學評分(CS) 根據FAO/WHO提出的氨基酸評分標準模式和雞全卵蛋白質的氨基酸模式,氨基酸評分(AAS)、必需氨基酸指數(EAAI)、支/芳值(F)的計算式為[2]:

AAS=[樣品中某種氨基酸含量(mg/g氮)]/[WHO/FAO模式譜式譜中對應氨基酸含量(mg/g氮)]

式中,n為比較的氨基酸數,t為試驗蛋白質的氨基酸,s為雞蛋蛋白質的氨基酸。

1.3.3 蛋白質消化率校正的氨基酸記分法(PDCAAS) 蛋白質消化率校正的氨基酸記分法(PDCAAS)的計算根據Grazziotin等[26]報道的方法。按下式計算PDCAAS:

PDCAAS=最小氨基酸評分分數×體外蛋白消化率

1.3.4 營養指數(Nutritional index NI) 上述方法僅考慮到供試蛋白質的氨基酸組成。Crisan和Sands綜合蛋白質的含量與其氨基酸組成,建議用營養指數表示[27]。NI為EAAI與蛋白質含量百分率的乘積,可用下式計算:

式中:PP-蛋白質的百分含量。

1.3.5 蛋白質效率比分析 為了簡單快速計算蛋白質的效率比(PER),Alsemeyer等[28]建立了特殊氨基酸含量與PER之間的關系方程,依據這些方程可確定蛋白質的PER。不同南極磷蝦產品蛋白的效率比計算方程如下:

PER=-0.684+0.456 HLeu-0. 047 HPro

式中:PER為蛋白質效率比;HLeu為亮氨酸(Leu)在蛋白質中的質量分數;HPro為脯氨酸(Pro)在蛋白質中的質量分數。

1.4 數據處理

2 結果與討論

2.1 五種南極磷蝦產品中蛋白的分析

2.1.1 五種南極磷蝦產品的基本成分分析

2.1.1.1 五種南極磷蝦產品的常規營養成分 由表1可得,5種南極磷蝦產品的水分和灰分含量均符合GB/T 19164-2003魚粉國家一級品的標準。脫氟蝦粉中蛋白含量相對較高,占原料的78.17%左右,是蝦肉的1.08倍,蝦糜的1.01倍,普通蝦粉的1.2倍,脫脂蝦粉的1.07倍。魚粉國家標準中規定魚粉粗蛋白質含量>65%為特級品、>60%為一級品、>55%為二級品、>50%為三級品,南極磷蝦蝦肉、蝦糜和三種蝦粉均達到特級品的要求。普通蝦粉中脂質含量最高,達15.35%,是蝦肉和蝦糜的1.05、1.12倍,脫脂蝦粉的2.3倍,脫氟蝦粉的3.73倍,按照魚粉國家標準一級品的要求,普通蝦粉、蝦肉和蝦糜的脂肪含量略高,不符合一級品要求,但較高的脂肪含量可以考慮作為提取南極磷蝦油的原料。

表1 蝦肉、蝦糜、普通蝦粉、脫脂蝦粉和脫氟蝦粉的常規營養成分Table 1 Conventional nutritional components in krill meat,krill surimi,ordinary krill powder,skim krill powder and defluorination krill powder

2.1.1.2 氨基酸組成與含量 由表1、表2可知,從氨基酸角度來說,脫氟蝦粉中蛋白質的含量最高為78.17%,NI值最高,達70.485,必需氮基酸指數值為90.169,在這5種南極磷蝦產品中,營養價值最高。根據FAO/WHO推薦的理想蛋白質模式認為,質量較好的蛋白質其氨基酸組成EAA/TAA在40%左右,EAA/N EAA在60%以上[2]。

表2 不同南極磷蝦產品、乳清蛋白和酪蛋白的氨基酸組成(g/100 g蛋白)Table 2 Amino acid composition for different Antarctic krill products,whey protein and casein(g/100 g protein)

通過計算得知,5種南極磷蝦產品蛋白的總必需氨基酸含量均達47.8 g/100 g蛋白以上,占總氨基酸含量的47.835%以上,均高于酪蛋白(47.548%),EAA/NEAA均高于91.57%,另外,南極磷蝦各產品蛋白的必需氨基酸之間的比例適宜,其EAAI均顯著(P<0.05)高于酪蛋白的75.627,可以判斷這5種磷蝦產品是優質的蛋白來源。

此外,在18種水解氨基酸中,谷氨酸含量最高,天冬氨酸含量次之,分別占氨基酸總量的14%和10%以上,因此磷蝦產品具有濃郁的鮮味,含量較高的還有賴氨酸和亮氨酸,色氨酸含量最低,只占氨基酸總量的1.6%～1.9%,但仍為酪蛋白的1.6倍以上。與標準雞蛋蛋白相比,樣品中含硫氨酸和蘇氨酸相對不足,其它氨基酸含量接近或者高于標準蛋白。由此可知將富含色氨酸和賴氨酸的磷蝦與其他蛋白產品混合食用,則可提高食物的AAS和SRC,使各種食物中氨基酸得到更好的利用。

2.1.2 5種南極磷蝦產品中組成蛋白質的種類及含量 由表3可以看出,5種產品中冷凍南極磷蝦蝦肉的肌漿蛋白含量最高,占蛋白的比例為36.44%,由于在加工過程中水溶性的肌漿蛋白極易損失掉,所以蝦糜和蝦粉中肌漿蛋白含量極低,也進一步影響了南極磷蝦產品的營養價值和消化吸收性。肌原纖維蛋白在很大程度上決定著蛋白質的功能特性,但表3結果顯示,冷凍磷蝦的蝦肉和蝦糜中肌原纖維蛋白分別只占蛋白質的27.18%和21.34%左右,因此冷凍磷蝦在加工中難以形成彈性凝膠;并且加熱處理易使肌原纖維蛋白變性,因此普通蝦粉、脫脂蝦粉和脫氟蝦粉中幾乎不存在肌原纖維蛋白。蝦肉中堿溶性蛋白含量最低為30.47%,隨著產品加工程度的復雜化,堿溶性蛋白含量隨之升高,但其變化較其他種類的蛋白要小。肌基質蛋白由3.29%增加至45.93%,是所有蛋白質種類中含量變化最大的。

表3 不同南極磷蝦產品中蛋白質的構成(%)Table 3 Protein composition of different kinds of Antarctic krill products(%)

2.1.3 5種南極磷蝦產品中蛋白的SDS-PAGE分析 5種原料的SDS-PAGE電泳圖譜如圖1所示,蝦糜與蝦肉中的蛋白分子量分布最廣,蝦肉中高分子量的組分占很大比例,高于蝦糜。經過加熱、乙醇脫脂、酸等處理的3種蝦粉中,高分子量的蛋白發生降解,低分子量的蛋白增加,而經酸脫酰胺的脫氟蝦粉,大片段蛋白幾乎全部降解,而大部分蛋白分子量低于30 kDa。

圖1 五種南極磷蝦產品的分子量分布Fig.1 SDS-PAGE analysis of protein in five kinds of Antarctic krill products注:泳道1、7:分子量標準品;泳道2:脫氟蝦粉;泳道3:普通蝦粉;泳道4:脫脂蝦粉;泳道5:蝦肉;泳道6:蝦糜。

2.1.4 共聚焦激光掃描顯微鏡觀察蛋白形態分布變化 5種南極磷蝦產品的共聚焦激光掃描圖見圖2,由圖2可以看出,蝦肉與蝦糜經羅丹明B染色的蛋白與暗色的條帶狀物質均勻交叉分布,暗色的條帶狀物質推斷為南極磷蝦的脂質成分;普通蝦粉由于經過水蒸汽處理,蛋白的均勻分布遭到破壞,經羅丹明B染色后的蛋白包裹在暗色區域的外圍,由此也可以分析蛋白與脂質結合非常緊密;脫脂蝦粉由于脂質含量低經羅丹明B染色,基本只看到聚集的蛋白;由于脫氟蝦粉經過酸處理脫酰胺,蛋白分子降解,分子量變小,經羅丹明B染色后可看到蛋白的不連續分布,呈分散狀態。

圖2 五種南極磷蝦產品的共聚焦激光掃描圖(100×)Fig.2 Confocal laser scans of five kinds of Antarctic krill products(100×)注:1:蝦肉,2:蝦糜,3:普通蝦粉,4:脫脂蝦粉,5:脫氟蝦粉。

2.1.5 五種南極磷蝦產品中蛋白的紅外光譜分析 研究不同加工處理方式對南極磷蝦蛋白質二級結構化學特征的影響,分析不同磷蝦產品的蛋白質二級結構的差異,從而分析蛋白質的二級結構和其營養價值之間的關系。酰胺Ⅰ帶由幾個子峰組成,每個子峰都代表一種蛋白質二級結構,酰胺Ⅰ帶各峰的指認標準見表4[30]，五種南極磷蝦產品蛋白及其酰胺Ⅰ區的紅外光譜見圖3、圖4。

表4 酰胺Ⅰ帶各峰的指認標準Table 4 Identification criteria for each peak of the amide Ⅰ band

圖3 五種南極磷蝦產品蛋白的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of five kinds of Antarctic krill products

圖4 五種南極磷蝦產品中蛋白質的酰胺Ⅰ區的紅外光譜Fig.4 Infrared spectra of the amide Ⅰ region of proteins in five kinds of Antarctic krill products 注:頂部,原始圖譜;底部,曲線擬合圖譜;A,蝦肉;B,蝦糜;C,普通蝦粉;D,脫脂蝦粉;E,脫氟蝦粉。

由表5可知,5種南極磷蝦產品中,蝦肉的a-螺旋/β-折疊比值依次高于蝦糜、普通蝦粉、脫脂蝦粉、脫氟蝦粉。漂洗、熱加工和變性劑的處理會使a-螺旋和β-轉角含量下降分別由29.74%、31.39%降到27.59%、26.37,β-折疊含量顯著增加,由24.35%到33.04%。因為a-螺旋是蛋白質二級結構中最穩定的一種,它的破壞需要較強的外界作用。相較于蝦肉,漂洗使蝦糜損失了較多的水溶性蛋白,使得a-螺旋/β-折疊的比值從1.222降低到1.078,β-轉角含量從31.39%降低到了28.99%,符合Yu等[31]指出的蛋白質的營養價值不僅與粗蛋白質總含量有關,更與其二級結構有關。

表5 不同南極磷蝦產品中蛋白二級結構的組成Table 5 Composition of protein secondary structure in different kinds of Antarctic krill products

本研究結果表明,漂洗、熱加工和變性劑的處理能夠誘導蛋白質二級結構發生改變,雖然蛋白質的營養價值和消化吸收性率并非直接依賴a-螺旋和β-折疊,但是蛋白質的性質和對酶的敏感性卻和其固有的結構高度相關,蛋白質的營養價值和降解特性與其二級結構有密切的聯系[32]。蛋白質二級結構在一定程度上決定產品的營養價值,可能是因為不同原料蛋白質分子結構特征間的差異,導致其在消化過程中與消化酶接觸的機會和作用位點不同,從而釋放出不同種類、數量的寡肽和游離氨基酸,進而導致蛋白質營養價值也不同[33]。

2.2 不同磷蝦產品中蛋白質的營養評價

化學評分只考慮限制氨基酸一種氨基酸對蛋白質營養價值的影響,SRC用各種必需氨基酸偏離氨基酸模式的離散度來評價蛋白質質量。SRC與生物價(BV)之間有高度的相關性。與FAO氨基酸模式計算的化學分相比,SRC比化學分接近BV(P<0.05)[25]。氨基酸的生物效價主要與必需氨基酸的組成是否均衡有關,由表6知,雖然5種南極磷蝦產品中蛋白質的SRC均高于乳清蛋白,氨基酸比例協調,所以蛋白質的營養價值較高。通常認為蛋白的PER大于2.0時,表明該蛋白具有較高的營養價值[26,28],5種南極磷蝦產品中蛋白的PER雖低于酪蛋白但仍具有較高的營養價值。相較于蝦肉,脫脂蝦粉雖然具有較高的PER,但PDCAAS最低,可能與脫脂蝦粉的前處理破壞了蛋白的結構,降低了原蛋白的營養價值,從而降低了蛋白的酶解程度有關。在實際應用中應通過蛋白質互補法與其他蛋白質搭配使用,以及探索新的加工工藝,充分的提高蛋白的吸收利用率,提高其營養價值。

支鏈氨基酸具有降低膽固醇和抑癌保肝等功能,人類的正常支鏈氨基酸與芳香族氨基酸的比值(F值)范圍為3.0～3.5,當肝臟受到損傷時,其值范圍降為1.0～1.5[34]。表6顯示了五種南極磷蝦產品的F值均高于1.5,明顯高于人體肝臟受傷時的水平。南極磷蝦產品中的蛋白質氨基酸不僅總量高,種類齊全,而且人體必需氨基酸含量高,支芳比較高,具有較高的營養價值。

3 結論

從常規營養成分組成來看,5種南極磷蝦產品中水分、蛋白、脂質和灰分含量符合GB/T 19164-2003魚粉國家一級品中相應成分的標準。南極磷蝦各產品不僅必需氨基酸種類齊全,而且必需氨基酸之間的比例適宜,必需氨基酸總量均≥47.835%,EAA/NEAA均≥91.571%,屬于優質蛋白源。熱加工和變性劑前處理均會影響a-螺旋、β-折疊和β-轉角的含量,因而影響蛋白質的營養價值,南極磷蝦產品的蛋白質二級結構中a-螺旋和β-折疊的比值與必需氨基酸含量和營養指數呈負相關的態勢。通過對不同南極磷蝦產品中蛋白的營養價值的研究,為南極磷蝦蛋白可作為良好的蛋白質來源提供數據參考,并為完善磷蝦蛋白營養價值評價體系、提高磷蝦蛋白質資源利用效率提供依據,以使磷蝦蛋白資源得到更科學、合理的利用。