不同發酵工藝糙米酵素中游離氨基酸、γ氨基丁酸及揮發性香氣成分分析

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(1.河北農業大學食品科技學院,河北保定 071000; 2.衡水學院生命科學系,河北衡水 053000)

糙米(Brown rice)是指除了外殼之外都保留的全谷粒,其營養及保健價值均大于精白米[1],但由于其口感較粗,蒸煮耗時,不符合現代人飲食習慣,加工成精白米會造成人類食物資源浪費10%～20%[2]。糙米酵素是在糙米中加入蜂蜜、麥芽等,采用酵母等發酵而成的功能性食品基料。微生物通過本身的中間代謝,使底物產生一系列的生物化學變化,不僅改善了口感[3],而且在保留原有營養的基礎上又通過微生物代謝產生了很多生理活性物質諸如γ-谷維醇[4-6]、γ-氨基丁酸(GABA)和谷胱甘肽(GSH)等[7]。其中游離氨基酸可起到影響食品風味的作用[8],而GABA是糙米及其發酵產品中含量豐富的抑制性神經遞質[9],具有降血壓、抗驚厥、改善腦機能和調節睡眠的作用[10]。

關于糙米酵素的研究，國外起步較早,日本和美國已有眾多相關文獻。而中國近年才有糙米酵素的研究報道,且較多集中于配方及工藝的探討,對其營養價值諸如游離氨基酸和GABA,尤其對于不同發酵工藝下的探討甚少[2],部分學者雖然對氨基酸或GABA相對含量作出了分析[11],但鑒于配方有別,或工藝未經糖化及巴氏殺菌,只集中探討了單菌酵母發酵,并未對不同發酵工藝下游離氨基酸和GABA含量作綜合探討[12];且并未有學者對糙米酵素本身的揮發性香氣成分作出過分析。

因此,本文集中探討了在增加糖化及滅菌工藝,采用釀酒酵母與植物乳桿菌混菌發酵[13]后,分別以發酵液總體抗氧化(T-AOC)、還原糖消耗量、總超氧化物歧化酶(SOD)及GSH含量為指標得到的最優發酵工藝與優化前、傳統酵母單菌發酵及未發酵原料作對比,采用氨基酸自動分析儀對以上7種樣品的游離氨基酸及GABA的含量進行測定,并采用頂空固相微萃取(HS-SPME)結合氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用技術,檢測優化后、優化前及單菌發酵的揮發性香氣成分,從而確定混菌發酵對營養價值水平及風味的影響,研究發酵工藝優化的結果,為更好地利用和開發糙米酵素提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母 安琪酵母股份有限公司;植物乳桿菌L42本實驗室篩選及保藏[14];蜂蜜 桂林周氏順發食品有限公司;糙米 黑龍江鶴崗市五谷農家養生坊;大麥芽、小麥芽 煙臺市帝伯仕啤酒技術有限公司;γ-氨基丁酸 色譜純(純度:99.9%),上海源葉生物科技有限公司;5-磺基水楊酸 分析純,天津市致遠化學試劑有限公司;3-辛醇 西格瑪奧德里奇貿易有限公司;NaCl、(NH4)2SO4分析純,天津市福晨化學試劑廠。

Z80目標準檢驗篩 浙江上虞市華豐五金儀器有限公司;LY20-A型水浴恒溫振蕩器 上海龍躍儀器設備有限公司;LD5-2A型低速離心機 北京京立離心機有限公司;SW-CJ-1FD型潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;FA2204B型電子天平 上海天美天平儀器有限公司;101-1AB型電熱恒溫鼓風干燥箱 天津泰斯特儀器有限公司;1-15PK型高速離心機 德國西格瑪公司;L8900型全自動氨基酸分析儀 日本日立公司;DVB/CAR/PDMS型固相纖維萃取頭 美國Supelco色譜科公司;7890B-5977A型Agilent氣質聯用儀(7890B型色譜儀配5977A型質譜檢測器) 美國安捷倫科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程及操作要點

1.2.1.1 工藝流程 糙米發芽處理[15-16]→干燥→粉碎過篩→調配→糖化液化[17-19]→冷卻→離心取上清→調配→巴氏殺菌[20]→冷卻→不同工藝參數下接種發酵→巴氏殺菌→糙米酵素。

1.2.1.2 操作要點 糙米于37 ℃溫水中浸泡1～2 d,每6 h換一次水,使芽體長度為1～2 mm;將發芽糙米瀝干放入鼓風干燥箱中,50 ℃干燥4～5 h;冷卻后使用食品粉碎機把烘干的糙米粉碎,并過80目篩備用;按照發酵培養基配方配制培養基:糙米粉10.710 g/100 mL、NaCl為0.240 g/100 mL、小麥芽0.250 g/100 mL、大麥芽0.500 g/100 mL、(NH4)2SO4為0.500 g/100 mL、茶葉粉0.025 g/100 mL[21];發酵培養基進行糖化液化,升溫程序為:37 ℃保溫10 min;52 ℃保溫40 min;65 ℃保溫1 h;78 ℃保溫10 min[21];培養基冷卻后離心(4360×g、15 min)取上清,添加蜂蜜3.38 g/100 mL進行調配,然后巴氏殺菌;滅菌后的培養基接入釀酒酵母、植物乳桿菌進行發酵。

1.2.2 不同發酵工藝發酵糙米酵素 以發酵液總抗氧化能力(T-AOC)為指標得到的最優發酵條件為發酵時間12 h,接種量7%(釀酒酵母與植物乳桿菌體積比為1∶1;釀酒酵母約為1.71×107CFU/mL,植物乳桿菌約為2.15×108CFU/mL),發酵溫度34 ℃,搖床轉速150 r/min;以還原糖消耗量為指標得到的最優發酵條件為發酵時間12 h,接種量7%,發酵溫度37 ℃,搖床轉速150 r/min;以總超氧化物歧化酶(SOD)為指標得到的最優發酵條件為發酵時間12 h,接種量7%,發酵溫度37 ℃,搖床轉速120 r/min;以還原型谷胱甘肽(GSH)含量為指標得到的最優發酵條件為發酵時間12 h,接種量7%,發酵溫度34 ℃,搖床轉速120 r/min。按順序將T-AOC最優組、還原糖消耗最優組、SOD最優組、GSH最優組、未優化組(釀酒酵母發酵與植物乳桿菌體積比1∶1混菌發酵,接種量7%,發酵時間10 h,搖床轉速150 r/min,溫度34 ℃)、單菌發酵組(釀酒酵母發酵,接種量7%,發酵時間10 h,搖床轉速150 r/min,溫度34 ℃)和未發酵組編號1～7[21]。按照不同發酵工藝發酵,得到糙米酵素發酵液。

1.2.3 酵母酵素游離氨基酸及γ-氨基丁酸含量的測定

1.2.3.1γ-氨基丁酸待測液的制備 取適量糙米酵素液經過離心(2140×g,15 min)后取上清,轉移至50 mL容量瓶加純凈水定容,取1 mL與8%質量分數的5-磺基水楊酸3 mL混合均勻,高速離心(12000 r/min,10 min),取上清液過0.22 μm濾膜后待測[22]。

1.2.3.2 游離氨基酸待測液的制備 取適量糙米酵素液加入10 mL 6 mol/L鹽酸溶液,放入105 ℃電熱鼓風干燥箱水解24 h,取出冷卻后轉移至25 mL容量瓶,去離子水定容。過濾后取1 mL濾液置于60 ℃水浴脫酸,然后加1 mL去離子水蒸干得到干燥固體,然后將得到的干燥固體用0.02 mol/L稀鹽酸洗至5 mL容量瓶,過0.22 μm濾膜后待測[22]。

1.2.3.3 氨基酸分析儀色譜條件 色譜柱:標準分析陽離子型交換樹脂(4.6 mm×60 mm);進樣量20 μL;輸液泵壓力0～20 MPa;檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液[12]流速0.45 mL/min;茚三酮反應液[12]流速0.35 mL/min;分離柱柱溫57 ℃,反應柱柱溫136 ℃;通道1:檢測波長570 nm檢測除脯氨酸外其他氨基酸;通道2:檢測波長440 nm檢測脯氨酸。

1.2.3.4 定性及定量 在上述氨基酸分析儀色譜條件下,17種氨基酸和γ-氨基丁酸達到明顯的基線分離,并得出各種氨基酸的保留時間,按照峰面積歸一化法計算出各氨基酸的相對含量。

1.2.4 糙米酵素揮發性香氣成分的測定

1.2.4.1 揮發性香氣成分的提取 采用纖維針式固相微萃取[23],取上述不同發酵工藝的糙米酵素液各7.5 mL,置于規格20 mL的頂空瓶中,分別加入1 g無水氯化鈉和200 μL含量為0.25‰的內標物3-辛醇,在45 ℃恒溫水浴下平衡10 min,插入活化萃取針進行頂空固相微萃取,萃取時間40 min[24]。

1.2.4.2 GC條件 色譜柱:HP-INNO Wax(60 m×250 μm×0.25 μm);固相微萃取纖維針:50/30 μm;進樣口溫度:250 ℃;檢測器溫度:230 ℃;載氣:氦氣;流量1 mL/min;升溫程序:50 ℃保持2 min,然后以3 ℃/min升溫至80 ℃,再以5 ℃/min升溫至230 ℃,保持6 min[25]。

1.2.4.3 MS條件 電離源:EI;電子能量:70 eV;掃描范圍:35.0～500.0 amu。

1.2.5 定性及定量 在上述GC-MS條件下,通過氣質聯用檢測技術對3種不同發酵條件下的糙米酵素香氣成分進行檢測分析,取譜庫(NIST14)中匹配度大于80%的物質進行定性分析;以1.2.4.1固相微萃取的內標物含量為參考,按照峰面積歸一化法對香氣成分進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 游離氨基酸的含量與分析

游離氨基酸混標圖譜如圖1所示,圖2為第3組游離氨基酸的測定圖譜,1～7組游離氨基酸的測定結果見表1所示。

表1 1～7組發酵液中游離氨基酸的含量(mg/mL)Table 1 Free amino acid contents in fermentation broth of group 1～7(mg/mL)

圖1 游離氨基酸的標準圖譜Fig.1 Standard map of free amino acids

圖2 組3的游離氨基酸的測定圖譜Fig.2 Determination of free amino acids in group 3

游離氨基酸本身可呈現出酸、甜、苦和鮮等味道[26]。其中谷氨酸和天門冬氨酸起到鮮味作用[27],由表1可知,4號組兩種氨基酸總含量最高可達2.785 mg/mL,相比較5號未優化組的2.547 mg/mL和7號未發酵組的2.311 mg/mL分別提升0.238、0.474 mg/mL,相較于6號單菌發酵組,鮮味類氨基酸提升不明顯;呈苦味氨基酸基本包括苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸[13],1號組四種氨基酸總含量最高達0.920 mg/mL,相比較5、6、7號組的0.839、0.868、0.822 mg/mL,變化較不明顯;起甜味作用的氨基酸有甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸和賴氨酸[28],1號組六種氨基酸總含量可達2.744 mg/mL,相較5、6、7號組的2.671、2.273、1.914 mg/mL分別提高0.073、0.471、0.830 mg/mL。隨著發酵過程中葡萄糖、果糖和麥芽糖的消耗,呈甜味氨基酸含量增高彌補了甜味的流失,表現在感官上則是產品的酸甜適口,其中賴氨酸作為必需氨基酸谷物類食品中含量較少,未發酵7號組含量為0.121 mg/mL,經發酵后最高可達1號組的0.184 mg/mL,提高約52.07%。

以發酵優化較好的1號組為例,其含量較高的呈味氨基酸分別為谷氨酸、丙氨酸、天門冬氨、脯氨酸和甘氨酸,五種氨基酸總含量可占到總氨基酸含量的68.10%,共同賦予了酵素產品酸甜鮮的滋味,可認為以上五種氨基酸為糙米酵素的特征性風味物質;綜合對比分析1～7組,EAA/TAA比值在13.3%～17.9%范圍內,EAA/NEAA比值在19.5%～21.8%范圍內,發酵前后并無明顯變化;氨基酸總量最高可達4號組的7.151 mg/mL,相較5號未優化組、6號單菌發酵組和7號未發酵組分別提高0.36、0.464、1.496 mg/mL,充分表明混菌發酵相比較單菌發酵優勢明顯。

2.2 GABA的含量與分析

圖3為GABA混標圖譜,圖4為第3組GABA的測定圖譜,1～7組GABA的測定結果見表2。由表2可知,GABA含量經過工藝優化后顯著提高(P<0.05)。以最高的1號組為例,優化后GABA含量最高可達2.595 mg/mL,相比較5號未優化組、6號單菌發酵組和7號未發酵組的2.322、1.977和1.324 mg/mL分別提高約11.76%、31.26%和96.00%,對比其他自制液態糙米酵素,工藝優化后GABA相對含量更高[29],同時GABA含量的提升同樣表明混菌發酵相比較單菌發酵優勢明顯。

表2 1～7組發酵液中GABA的含量(mg/mL)Table 2 GABA contents in fermentation broth of group 1～7(mg/mL)

圖3 GABA的混標圖譜Fig.3 GABA’s mixed spectrum

圖4 組3的GABA的測定圖譜Fig.4 Determination spectrum of GABA in group 4

2.3 揮發性香氣成分分析

表3為選取匹配度80以上的分析鑒定結果,包含香氣成分的參考閾值[30]及風味描述[31-32]。但由于呈香化合物風味描述與主觀評定相關,閾值與蒸氣壓相關,而蒸氣壓受溫度及溶劑介質的影響[32]。并且糙米酵素并無相關研究分析其香氣成分。本試驗樣品中水和乙醇作為溶劑所占比例最大,一般含酒精的體系內,化合物閾值隨乙醇濃度的升高而增大[33],而本試驗中糙米酵素的酒精度經測定約為2%vol～3%vol,故本文參考各香氣成分在啤酒中的閾值,如無文獻可考則參考水中的香氣閾值,溫度均為20 ℃。一些化合物閾值有爭議的,如香氣與香味、鼻前鼻后感覺的定義在各學者之間有不同觀點的[31],已在表中括號注明閾值測定方法。

如表3所示,單菌發酵的揮發性香氣成分為11種,混菌發酵分別產生揮發性香氣成分22種,共產生了異丁醇、異戊醇、1-辛烯-3-醇、1-庚醇、1-辛醇、2,3-丁二醇、1-壬醇7種醇類物質;己酸和辛酸2種酸類物質;乙酸異戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、苯乙酸乙酯和乙酸苯乙酯7種酯類物質;3-羥基-2-丁酮(乙偶姻)1種酮類;2-甲基吡嗪一種吡嗪類和4-乙烯基愈創木酚1種酚類。混菌發酵優化后減少了八甲基環四硅氧烷、正己醇和糖醛3種物質的含量。

糙米酵素經過不同工藝混菌發酵后相比于單菌發酵分別增加了11種揮發性香氣成分。根據氣味活度值(OAV)[34]或芳香值[32]的定義描述,OAV=食品中香味化合物的濃度/食品中香味化合物的閾值,在多數情況下當某一成分OAV<1時說明該組分對食品香氣不起直接作用,大于1時嗅覺可辨,此值越大,說明其越是該體系的特征嗅感化合物。如表3中所示,混菌發酵后糙米酵素中OAV值經過密度換算明顯大于1的有乙酸異戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、1-辛烯-3-醇和4-乙烯基愈創木酚,其中四種酯類不受工藝變化影響全部檢出,表現在風味描述上為水果香、甜香及花香,與實際觀感較為一致,因此以上四種酯類為酵母及乳酸混合發酵糙米酵素的重要特征性風味物質,同時也證明混菌發酵相比于單菌發酵不僅在營養物質含量方面占有一定優勢,也在改善產品風味方面有重要作用。

表3 不同發酵工藝糙米酵素主要香氣成分Table 3 Volatile aroma components of different fermentation brown rice enzyme

3 結論

工藝優化后的1～4組總游離氨基酸、必需氨基酸及呈味氨基酸含量均顯著高于工藝優化前、單菌發酵及未發酵的5～7組(P<0.05),1～3組GABA含量相對于5～7組也有較大提高(P<0.05),說明分別以發酵液T-AOC、還原糖消耗量、SOD及GSH含量為指標對發酵工藝所作優化結果良好,其中1號組優化情況最佳,呈味氨基酸、必需氨基酸及GABA含量最高,證明混菌發酵相比于單菌發酵可行而且結果更佳。在揮發性香氣成分種類及含量上,混菌發酵同樣優于傳統的酵母單菌發酵,不僅增加了11種香氣成分,而且增加了乙酸異戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯四種特征風味物質,同時發酵工藝的不同導致混菌發酵產生的揮發性香氣成分含量及種類有所不同,混菌發酵在改善糙米酵素風味方面還有待更進一步研究。

糙米原料發酵前后的EAA/TAA比值與EAA/NEAA比值均無明顯變化,且分別低于FAO/WHO推薦的理想蛋白模式下的40%與60%標準[29]。除了原料本身經過糖化沉淀處理,只保留了可溶性蛋白可游離氨基酸以外,在發酵調控上還有改進空間。揮發性香氣成分的研究尚屬初級,需要更進一步探討香氣成分產生的機理,期待后續學者更進一步完善糙米酵素發酵的關鍵工藝。