海藻酸鈉薰衣草精油微膠囊的制備及其性能研究

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(1.石河子大學藥學院,新疆石河子 832000; 2.華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司,河北石家莊 050015)

薰衣草(LavandulaangustifoliaMill.)系唇形科(Labiatae)薰衣草屬(LavandulaLinn.)植物,多年生草本或半灌木,素有“芳香藥草之后”的美譽,其在我國新疆伊犁地區種植面積達數萬畝。新疆伊犁地區的精油產量占全國的95%。薰衣草主要使用價值在其精油部分(含有芳樟醇、乙酸芳樟酯等)。薰衣草精油的藥用歷史悠久,作為抗失眠藥物被應用,但其在常溫下有極強的揮發性,對空氣、日光、濕氣(水分)及溫度等均較敏感;在貯存或應用中遇光和熱不穩定,極易發生分解或氧化而導致香氣變劣[1-2]。將薰衣草精油微膠囊化是解決這些問題的一種常規手段,可以通過制備得到薰衣草精油微膠囊起到提高精油的穩定性并能很好地防止外部環境的作用,解決其貯藏、留香時間等諸多問題,同時可以拓寬薰衣草精油的應用領域[3-6]。

海藻酸鈉作為一種優良的天然高分子材料,具有藥物制劑輔料所需的穩定性、水溶性、粘性和安全性,屬于聚陰離子電解質,其分子鏈上有大量的羧基。因此可利用海藻酸鈉的聚陰離子電解質特性,在海藻酸鈉溶液滴入多價陽離子溶液(如Ca2+等),當聚陰離子的海藻酸鈉與金屬陽離子相遇時,會產生瞬時凝膠,形成一層凝膠膜將乳液劑包覆在其中,所制備的微膠囊穩定性高且復雜的界面膜結構有更好的控釋特性[7-8]。但是,直接將海藻酸鈉微乳滴入Ca2+制備的微膠囊,其大小會受注射器針頭大小、滴入高度等的限制,且所制備的微膠囊粒徑較大[9-12]。因此為了改善制備過程中存在的缺點,希望能找到一種新的微膠囊制備方法,可以制備出膜厚度可控的微膠囊。

反向凝膠技術是近年來提出的一種新的精油包合方法。首先,在高速剪切力的作用下,在薰衣草精油中加入CaCl2溶液,將其制備成為W/O型乳液。其次,將乳液分散至海藻酸鈉池中,乳液中的Ca2+會在磁力攪拌的作用下從乳液中釋放出來與池中的海藻酸鈉相遇,在乳液表面形成一層不規則且很薄的膜。再次,由于在實驗過程中發現乳液中的Ca2+釋放速度較為緩慢,所形成的膜非常薄且易破裂。因此為了改善其膜厚度較小、易破裂等缺點,向加有乳液的海藻酸鈉池中加入乙醇、吐溫20,使乳化劑中更多的Ca2+從乳液中滲出,并與海藻酸鈉溶液相遇,在薰衣草精油乳滴外形成一層較厚的凝膠膜,將薰衣草精油包覆其中制成海藻酸鈉薰衣草精油微膠囊[13-15]。這種方法具有安全環保、工藝簡單等優點,具有廣闊的應用前景。

目前對薰衣草精油的包合研究工作主要是集中在納米乳液、納米膠囊、納米/微米粒、微膠囊等,而主要用途集中在化妝品、藥品、食品等領域。一個良好的食品包封遞送系統不僅需要具備防止降解提高穩定性的特性,還需要具備與其他食品系統兼容以及在口腔等特定環境下使用特定的觸發系統讓其達到控時控釋的效果[16-20]。因此,構建揮發油緩控釋系統,探索揮發油的控時控釋技術,讓其在特定的應用環境條件下控時控釋釋放,是一個值得研究和探討的課題。為了提高薰衣草精油的穩定性并且能使精油能控時控釋釋放,本研究采用反向凝膠技術制備了海藻酸鈉薰衣草精油微膠囊,以期通過加入去穩定劑來調節微膠囊的膜厚度達到控釋的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薰衣草精油 伊犁兄弟有限公司;海藻酸鈉 天津市福晨化學試劑廠;無水氯化鈣(粒) 分析純，天津市盛奧化學試劑有限公司;Span 85 天津市盛奧化學試劑有限公司;無水乙醇 分析純，天津永晟精細化工有限公司;吐溫20 天津市盛奧化學試劑有限公司。

DDS-307電導儀 上海精科;ZNCL磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司;KQ-500DE超聲分散 昆山市超聲儀器有限公司;AR1140電子分析天平 上海奧豪斯國際貿易有限公司;DHG-9240電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器公司;SHB-循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;FA-25高速剪切分散乳化機 上海弗魯克流體機械制造有限公司;TGL-16G臺式離心機 上海安亭科學儀器廠制造;OLYMPUS CX21數碼生物顯微鏡、Agilent 6890N氣相色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 溶液的配制

海藻酸鈉溶液的配制,準確稱取10 g的海藻酸鈉,并將其溶于1 L的雙蒸水中,在500 r·min-1條件下攪拌6 h,將其放入4 ℃冰箱靜置24 h備用。

CaCl2溶液的配制:準確稱取20、30、40 g的CaCl2·2H2O,并將其溶于500 mL的雙蒸水中備用。

破囊液的配制:稱取一定量的NaHCO3和檸檬酸三鈉,溶于超純水,分別配制0.2 mol/L NaHCO3和0.06 mol/L檸檬酸三鈉溶液,調節pH=8。

1.3 乳化劑的制備及表征

1.3.1 乳液的制備 向10 mL精油中加入分別加入0.001、0.01、0.1 g的Span 85,在13500 r·min-1條件下攪拌1 min,然后再向其中分別加入3 mL CaCl2溶液(60 g/L),在13500 r·min-1條件下攪拌2 min,即得油包水型乳液。

1.3.2 乳液的表征

1.3.2.1 穩定性 在室溫(25±2) ℃條件下,將制備完成的乳液置于100 mL試管中,觀察并記錄乳液發生相分離的時間,即油相從水相中分離1 mL所需要的時間。

1.3.2.2 液滴粒徑 W/O型乳化劑的粒徑用電子顯微鏡來測定,將制備好的乳化劑置于載玻片上,并放在數碼生物顯微鏡下觀察乳液液滴形態并用Image J 1.47V軟件來記錄乳液粒徑大小,每個樣本至少測量三個不同區域,平行測量三組。

1.3.2.3 導電性 在((25±2) ℃)常溫下,用電導儀測定乳劑的導電性,每份樣品重復測定三次,取平均值進行導電性分析[21]。

1.4 微膠囊的制備及影響因素考察

1.4.1 微膠囊的制備方法 首先,將20 mL海藻酸鈉溶液置于100 mL的燒杯中,用5 cm長的攪拌子在轉速400 r·min-1條件下攪拌2 min。其次,在轉速為700 r/min條件下,邊攪拌邊加入1 mL的乳液至海藻酸鈉池中。再次,在海藻酸鈉池中加入去穩定劑繼續攪拌1～15 min(固化時間,其被定義為在加入去穩定劑之后,乳化劑接觸海藻酸鈉的時間)對微膠囊進行固化。最后用雙蒸水洗滌2～3去除多余的海藻酸鈉,然后將制備好的濕微膠囊置于15 g/L的CaCl2溶液中儲存待用(圖1)[22]。

圖1 微膠囊制備示意圖Fig.1 Schematic representation of the formation of microcapsules

1.4.2 去穩定劑的選擇 分別按各個組別的設置在海藻酸鈉池中加入去穩定劑。空白組：不加去穩定劑；乙醇組:加入20 mL乙醇(10% v/v)；吐溫20組:加入2 mL(1% v/v)的吐溫20；乙醇+吐溫20組:先加入2 mL(1% v/v)的吐溫20,然后在350 r·min-1條件下攪拌10 s后再加入20 mL乙醇(10% v/v)。通過膜厚度及Ca2+釋放來選擇最優去穩定劑。

1.4.3 薰衣草精油微膠囊成囊參數的確定

1.4.3.1 海藻酸鈉濃度對成囊質量的影響 固定CaCl2濃度為60 g/L,Span85的濃度為1%,去穩定劑為2 mL(1%)Tween20和20 mL(10%)的乙醇,固化時間為3 min,選擇海藻酸鈉的質量濃度為0.5%、1%、1.5%,按“1.4.1”項下制備海藻酸鈉/Ca2+微膠囊,并觀察其形態。

1.4.3.2 CaCl2濃度對微膠囊質量的影響 固定海藻酸鈉濃度為1%,Span85的濃度為0.1%,去穩定劑為2 mL(1%)Tween20和20 mL的乙醇(10%),固化時間為3 min,選擇CaCl2濃度40、60、80 g/L,按“1.4.1”項下制備海藻酸鈉/Ca2+微膠囊,并觀察其形態。

1.4.3.3 固化時間對微膠囊質量及膜厚度的影響 固定海藻酸鈉濃度為1%,Span 85的濃度為0.1%,去穩定劑為2 mL(1%)Tween20和20 mL的乙醇(10%),選擇CaCl2濃度60 g/L,固化時間為1、3、5、10、15 和20 min,按“1.4.1”項下制備海藻酸鈉/Ca2+微膠囊,并觀察其形態。

1.4.4 指標測定方法

1.4.4.1 膜厚度的測定 用光學顯微鏡對微膠囊的成像情況及微觀結構進行分析,采用ImageJ 1.57 V對膜厚度進行測定,每個樣品選用100個微膠囊進行分析測定結果取平均值,每組重復三次。

1.4.4.2 Ca2+釋放量計算 加入去穩定劑后,Ca2+會從油芯中擴散到海藻酸鈉溶液中,前期試驗結果顯示加入不同去穩定劑后,膜厚度有一定的差異,因此猜測可能是不同去穩定劑加入導致CaCl2液滴都從乳液液滴中滲出至海藻酸鈉溶液的量不同導致了微膠囊膜厚度和體積的差異。

因此,在顯微圖像下選擇了不同粒徑大小的微膠囊,參照相關文獻中CaCl2的滲出量的計算方法,計算了不同殼體積微膠囊中CaCl2的滲出量,進一步評價去穩定劑對膜厚度的影響,參照文獻中的計算方法計算微膠囊中Ca2+從微乳中的釋放百分含量,由公式(1)(2)(3)計算[23]。

式(1)

式中:NCa,core代表微囊殼中Ca2+(mol)的物質的量;[Cacore]代表油殼中Ca2+(mol/L)的濃度;dcore代表油殼的直徑。

式(2)

式中,[Ca]m表示膜中Ca2+(mol/L)的濃度;dcap表示微膠囊的直徑。

式(3)

式中,ψ代表從油殼中釋放出的Ca2+的量。

1.4.4.3 微膠囊的形貌觀察 將制備好的微膠囊用超純水進行超聲分散,取一滴滴于載玻片上置于電子顯微鏡下觀測微粒的分布、形貌特征,取若干區域進行顯微鏡拍照,利用Image J 1.47V軟件分析各種不同實驗參數所得產品的粒徑大小,并對微膠囊圓整度、黏連程度等形貌特征進行分析[22]。

1.5 微膠囊性能的表征

將制備好的微膠囊冷凍干燥,并準確稱冷凍干燥后的微膠囊0.5 g,溶于5 mL的甲醇和20 mL的破囊液中,在常溫下攪拌6 h,將產物在6000 r·min-1離心15 min,取5 μL上清液進行載藥量、包封率、粒徑、膜厚度的檢測[24]。

微膠囊載藥量(%)和包封率(%)的計算公式為:

載藥量(%)=微膠囊內的藥物質量(g)/微膠囊總質量(g)×100

包封率(%)=微膠囊內的藥物質量(g)/投藥量(g)×100

1.6 體外釋放

1.6.1 膜厚度對薰衣草精油體外釋放的影響 在制備的過程中加入不同的去穩定劑可導致不同膜厚度的形成。采用1.4.3中得出的適宜的實驗參數,按照1.4.1中的方法制備微膠囊,固定釋放介質的pH=7,研究在海藻酸鈉池中分別加入乙醇及吐溫20對薰衣草精油體外釋放的影響[25]。

1.6.2 釋放介質pH對薰衣草精油體外釋放的影響 考察了海藻酸鈉-薰衣草微膠囊在不同pH條件下的釋放情況,選用乙醇和吐溫20組為去穩定劑,采用1.4.3中得出的適宜的實驗參數,按照1.4.1中的方法制備微膠囊,在釋放介質pH分別為1.2、2.6、4.0、5.4、6.8、7.4時進行薰衣草精油體外釋放研究。

1.6.3 微膠囊體外累計釋放率的測定 準確稱取10 mg微膠囊,溶于50 mL釋放介質(pH緩沖液∶乙醇=4∶1 (v/v))混合溶液中,于37 ℃磁力攪拌40 h。期間每間隔一定時間,取出5 mL樣品,并用新鮮的釋放介質補充至同等體積。將取出的樣品于6000 r·min-1離心10 min,取上清液在245 nm波長處用紫外分光光度計測定峰面積并計算薰衣草精油濃度,并求出0～40 h的累積釋放率[26-29]。

式中:Q為累計釋放率;CN為不同時刻測得的薰衣草精油濃度;V為釋放介質的總體積(50 mL);VS為每次取樣的體積(5 mL);W為實際薰衣草精油總量(即投藥量和包封率的乘積)。

1.7 數據處理

所有實驗數據取3次重復實驗的平均值。采用Origin 8作圖,SPSS Statistics 17.0、Design Expert 7.0.0軟件進行數據處理與分析。

2 結果與分析

2.1 加入不同濃度Span 85后的W/O乳化劑的表征

乳液表征結果見表1,由表1可知,加入不同濃度Span 85制備的三組乳液均沒有導電性。說明CaCl2液滴可能全部被薰衣草精油包裹形成了W/O型乳化劑。當乳化劑的含量升高時,所形成的液滴粒徑變小,乳液更加穩定。乳液穩定性更高的原因可能是,Span85濃度越高,乳液中從油殼中滲出的Ca2+會越少。當Span85濃度較低時,所制得的微乳結構不規整,有部分橢圓形。可能是由于低的Span85含量導致所形成的雙電層比較薄,在攪拌條件下易于破裂,致使油殼中大量Ca2+滲出,導致所形成的微乳形狀不好。因此最終選用Span85濃度為0.1%做制備微乳進行微膠囊的制備實驗。

表1 加入不同濃度Span 85的W/O乳化劑的表征Table 1 Characteristics of the W/O emulsions with different concentration of Span 85

2.2 去穩定劑的加入對微膠囊膜厚度和Ca2+釋放的影響

膜厚度結果(圖2A)顯示:與空白組相比,乙醇組膜厚度增加較小,而吐溫組和吐溫乙醇組膜厚度都有明顯增加。從圖(2B)中也可以直觀地看出,不同去穩定劑加入后,微膠囊的膜厚度不同。

圖2 加入乙醇或/和吐溫20前后微膠囊的膜厚度Fig.2 Membrane thickness before and after adding of ethanol or/and Tween20注:A:加入不同去穩定劑后微膠囊的膜厚度圖;B:加入不同去穩定劑后單個微膠囊的顯微圖片,a:核,b:膜(40×)。

鈣離子的釋放結果(圖3)顯示,加入適宜的去穩定劑可以使乳化劑中的Ca2+從殼中滲出。空白組和乙醇組釋放量較少,相對應的膜厚度也較薄,而Tween 20組、乙醇+吐溫20組Ca2+釋放量較高,但并未完全釋放。隨微膠囊殼體積的增加,鈣的釋放率在22%～85%之間。鈣離子釋放越多,微膠囊的膜越厚,因此,最終選擇乙醇+吐溫20作為去穩定劑。

圖3 從油核中釋放出來的Ca2+百分含量Fig.3 Percentage of calcium released from the oil core

2.3 微膠囊成囊參數的確定

2.3.1 海藻酸鈉濃度對成囊質量的影響 海藻酸鈉的濃度對微膠囊的成型性有很重要的影響,當海藻酸鈉濃度為0.5%時,由于其濃度較小,能與Ca2+結合的-COOH很少,所形成的微膠囊球大小不一且微膠囊的性狀不圓整。當海藻酸鈉濃度為1%時,成球效果會明顯提高,微膠囊形貌較圓實,粒徑分布比較均一;但是,當海藻酸鈉濃度為1.5%時,球形不規整、球形度變差,粒徑分布范圍變寬。因為,隨著海藻酸鈉濃度的上升,海藻酸鈉的粘度也會隨之升高,會導致微膠囊很難成型。因此選用海藻酸鈉的最優濃度為1%。

圖4 海藻酸鈉/Ca2+微膠囊(40×)Fig.4 Alginate/Ca2+ microcapsule(40×)注:A:海藻酸鈉濃度0.5%;B:海藻酸鈉濃度1%;C:海藻酸鈉濃度1.5%。

2.3.2 CaCl2濃度對微膠囊質量的影響 圖5顯示,隨著CaCl2濃度增加,微膠囊的成球效果也逐漸提高,當CaCl2濃度較低時,與海藻酸鈉中羧基所結合的鈣離子較少,導致微膠囊膜易破裂,形成的微膠囊不穩定。當氯化鈣濃度較高時,成球效果明顯變好。但是當Ca2+濃度大于60 g/L時微膠囊變的更加緊實,會使囊內空間變小,不利于精油包封。綜合考慮,選用Ca2+為60 g/L較為合適。

圖5 海藻酸鈉/Ca2+微膠囊(40×)Fig.5 Alginate/Ca2+ microcapsule(40×)注:A:CaCl2濃度40 g/L;B:CaCl2濃度60 g/L;C:CaCl2濃度80 g/L。

2.3.3 固化時間對微膠囊質量的影響 固化時間定義為加入去穩定劑(乙醇和吐溫20)后乳液液滴與海藻酸鈉溶液接觸的時間。圖6顯示,固化時間1～5 min內所形成的微膠囊粒徑較小,成囊效果較差。固化時間為15 min時微膠囊的膜厚度達到了最大值,再繼續攪拌微膠囊膜厚度減小。由此推斷15 min的固化時間足以讓鈣離子的釋放量達到最大值。因此微膠囊的固化時間選擇15 min。

圖6 海藻酸鈉/Ca2+微膠囊(40×)Fig.6 Alginate/Ca2+ microcapsule(40×)注:A:1 min;B:3 min;C:5 min;D:10 min;E:15 min;F:20 min。

2.4 微膠囊性能表征

根據前期試驗結果,最終選用乳化劑濃度為0.1%,CaCl2濃度為60 g/L,海藻酸鈉濃度為1%,制備薰衣草海藻酸鈉微膠囊,并對加入不同去穩定劑之后的載藥量、包封率、粒徑、膜厚度進行測定。測定結果如表2所示。

表2 微膠囊的性能表征Table 2 The properties characterization of microcapsule

2.5 體外釋放

2.5.1 不同膜厚度對薰衣草-海藻酸鈉微膠囊緩釋速率的影響 微膠囊膜厚度與藥物從微膠囊中釋放出來的時間有非常密切的聯系,所以有必要研究微膠囊膜厚度對微膠囊釋放性能的影響。在制備過程中,分別加入乙醇、吐溫20、乙醇+吐溫20 作為去穩定劑,與空白組的體外釋放情況進行對比,釋放結果如圖7所示。

從圖7可以看出空白組在10 h內釋放量達到了92%,乙醇組為80%和吐溫20組為82%,但乙醇+吐溫20組釋放量僅為70%。綜上所述,薰衣草精油從微膠囊中釋放出來的時間是可以通過控制膜厚度來進行調控的。

圖7 海藻酸鈉/Ca2+微膠囊在不同膜厚度條件下的累計釋放率Fig.7 The cumulative release rate of sodium alginate/Ca2+microcapsules under different film thickness conditions

2.5.2 不同pH對薰衣草精油釋放速率的影響 pH對釋放的影響結果如圖8所示。由圖8可知,海藻酸鈉-薰衣草精油微膠囊在不同pH的緩釋介質中呈現相同規律,在剛開始1 h內,其緩釋速率最高,隨后,其藥物釋放速率會慢慢減小,在3 h后基本達到了緩釋平衡。剛開始釋放較快可能是因為海藻酸鈉是水溶性電解質,在緩沖液中會逐漸溶脹,導致在1 h時有一個突釋現象產生。但是當溶脹達到一定限度后,其緩釋速率主要依靠海藻酸鈉與鈣離子所形成的凝膠的網格孔徑大小決定。綜上所述,可以利用海藻酸鈉的特殊性質,通過改變釋放介質的pH,實現薰衣草精油在海藻酸鈉微膠囊中的控時控釋釋放。

圖8 海藻酸鈉/Ca2+微膠囊在不同pH條件下的累計釋放率Fig.8 The cumulative release rate of sodium alginate/Ca2+microcapsules under different pH conditions

3 結論

以海藻酸鈉為壁材,用反向分散凝膠技術制備了載薰衣草精油的微膠囊。并通過加入不同的去穩定劑得到了具有不同膜厚度的微膠囊。制得的微膠囊膜厚度在20～56 μm之間。通過研究不同膜厚度的微膠囊釋放情況,發現膜厚度越大釋放越緩慢。膜厚度為56 μm時10 h內的釋放僅為70%,膜厚度為20 μm時10 h內的釋放率為92%。此外,當釋放介質pH小于4時因海藻酸鈉與溶液中的氫離子結合形成不溶物致使釋放較為緩慢,當溶液pH大于4時,微膠囊在水中迅速膨脹導致其釋放速率增加。得到了具有膜厚度和pH響應的可控釋放微膠囊。但由于條件限制,制備方法尚不成熟,所制備的微膠囊粒徑均一度還存在問題,有些機理方面的研究尚未完全清楚,后期希望對制得的微膠囊進行更進一步的表征,對方法有更一步的改進。為薰衣草精油的包合及控釋制劑的應用提供一定的參考。