越橘提取物中花青素分析及其體外抗氧化活性

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(1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,教育部食品營養(yǎng)與安全重點實驗室,天津 300457; 2.天津食品安全低碳制造協(xié)同創(chuàng)新中心,天津 300457;3.天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院,天津 300457)

越橘(Vacciniumvitis-idaeaLinn.),是杜鵑花科植物,原產(chǎn)于北美地區(qū)。目前,越橘在我國的東北及內(nèi)蒙古地區(qū)分布廣泛[1]。越橘含有豐富的生物活性成分,包括膳食纖維和多酚。據(jù)報道,富含多酚的越橘可以減少藍光誘導(dǎo)的小鼠的視網(wǎng)膜損傷[2]。越橘還具有抗氧化活性和酶抑制特性以及抗炎作用[3-4]。如今,越橘常用來制作飲料和釀酒,也用做食品中的著色劑[5]。除此之外,越橘還具有藥用價值,被歸類為功能性食品。越橘提取物是以成熟的越橘果實或加工殘渣為原料提取得到的黑紫色粉末,其中花青素含量較高。越橘提取物功效優(yōu)良、應(yīng)用范圍廣、副作用低,如今已廣泛應(yīng)用于食品與藥品中[6]。

花青素屬于黃酮類化合物,是自然界廣泛存在的一類水溶性天然色素,廣泛存在于藍紫色果蔬中[7]。已有研究表明,花青素具有緩解視覺疲勞、改善動物和人的視力、抗突變、抗腫瘤和神經(jīng)保護作用[8-14]。自然條件下很少有游離的花青素,其通常與一個或多個葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通過糖苷形成花色苷,存在于植物中的花青素主要有6種:矢車菊素、飛燕草素、矮牽牛素、天竺葵素、芍藥素和錦葵素[15]。已有研究表明,越橘中花青素主要為錦葵素、飛燕草素、矢車菊素、矮牽牛素、芍藥素五種[16]。目前,主要使用液質(zhì)聯(lián)用法對花青素的各組分進行鑒定。Tian等[17]通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對越橘中花青素進行分離與鑒定,發(fā)現(xiàn)越橘中有矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷等。

本研究使用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的方法對越橘提取物中的花青素進行組分鑒定,并以矢車菊素-3-葡萄糖苷為標準品,測定各組分的含量。同時對越橘提取物進行了DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、羥基自由基清除能力和還原力的抗氧化活性分析,為越橘提取物的開發(fā)利用提供一定理論與數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

越橘提取物 尖峰天然產(chǎn)物有限公司;矢車菊素-3-葡萄糖苷標準品 純度>98%,USP(美國藥典);甲醇、乙腈、甲酸 均為色譜純;水 超純水;2,2′-聯(lián)氨-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate),ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 美國Sigma公司;其他試劑 分析純。

Ultimate 3000 高效液相系統(tǒng) 美國安捷倫公司;amaZon SL離子阱質(zhì)譜儀 美國Bruker公司;A20高效液相系統(tǒng) 日本島津公司;EX125DZH電子天平 奧豪斯儀器(常州)有限公司;Milli-RO Plus超純水儀 美國Millipore公司;XC-3200DT超聲清洗機 天津歐諾儀器儀表有限公司;Thermo-C18固相萃取小柱、3020-679酶標儀 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 越橘提取物中花青素的組成及含量分析

1.2.1.1 越橘提取物的純化 精密稱取越橘提取物10 mg(精確至0.01 mg),置于 10 mL容量瓶中,用 2%鹽酸-甲醇溶解并定容至刻度,得到濃度為1 mg/mL的越橘提取物溶液。

Thermo-C18固相萃取小柱先分別用5 mL甲醇溶液和5 mL水溶液清洗活化,然后加入1 mL樣品溶液,抽真空至液體流盡,再用5 mL甲醇溶液洗脫,收集甲醇洗脫液。將收集的甲醇洗脫液進行氮吹至甲醇完全吹干,用2%鹽酸-甲醇溶液復(fù)溶至1 mL,以備液質(zhì)測定。

1.2.1.2 標準品溶液的配制 精密稱取定量矢車菊素-3-葡萄糖苷標準品(精確至0.01 mg)10 mg,置于10 mL容量瓶中,用2%鹽酸-甲醇溶解并定容至刻度,得到濃度為1 mg/mL的矢車菊素-3-葡萄糖苷標準品溶液,避光保存。

1.2.1.3 液相色譜及質(zhì)譜條件 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果,高效液相色譜測定條件為:Ultimate 3000高效液相色譜儀,配紫外檢測器;色譜柱:C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相A:3%甲酸水溶液;流動相B:3%甲酸乙腈;梯度洗脫程序:0～35 min,7%～25% B;35～45 min,25%～65% B;45～46 min,65%～100% B;46～50 min,100% B;50～51 min,100%～7% B;51～60 min,7% B;柱溫:35 ℃;進樣量:20 μL;檢測波長:530 nm。

質(zhì)譜條件:正離子模式,全自動二級質(zhì)譜掃描,掃描范圍m/z 0～1000;霧化器壓力30 Psi;干燥氣(N2)流速8 L/min;溫度230 ℃;毛細管電壓3500 V。

1.2.2 越橘提取物的抗氧化能力

1.2.2.1 DPPH自由基清除能力 稱取0.1984 g DPPH用無水甲醇溶解并定容至50 mL,配制成0.1 mmol/L的DPPH儲備液,越橘提取物用無水甲醇分別配制成10、20、30、40、50 μg/mL的越橘提取物溶液,準確吸取不同濃度的1 mL越橘提取物溶液分別加入到3 mL 0.1 mmol/L的DPPH儲備液中,室溫避光30 min。以去離子水為參比溶液,VC為對照,每組設(shè)置3個平行,在517 nm下測定吸光度,根據(jù)式(1)計算DPPH自由基清除率,并計算IC50,IC50越小,表示清除能力越強[18]。

式(1)

式中:A0:空白對照的吸光度值;Ai:加入樣品后的吸光度值;Aj:樣品本身的吸光度值。

1.2.2.2 ABTS自由基清除能力 配制ABTS儲備液:10 mL 7 mmol/L的ABTS溶液和440 μL 140 mmol/L過硫酸鉀混合,在室溫、避光條件下放置12～16 h,作為ABTS儲備液。用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)將儲備液稀釋至使其在734 nm處的吸光值為0.70±0.02。越橘提取物用無水甲醇分別配制為10、20、30、40、50 μg/mL的越橘提取物溶液。

測定方法:準確吸取不同濃度的1 mL越橘提取物溶液分別加入到4 mL ABTS溶液中,在30 ℃水浴中反應(yīng)6 min。以去離子水為參比溶液,以VC為對照,每組分別設(shè)置3個平行,在734 nm處測定吸光值,根據(jù)式(2)計算ABTS自由基清除率,并計算IC50,IC50越小,表示清除能力越強[19]。

式(2)

式中:A0:空白對照的吸光度值;Ai:加入樣品后的吸光度值;Aj:樣品本身的吸光度值。

1.2.2.3 羥基自由基的清除能力 越橘提取物用無水甲醇配制成0.2、0.5、1.0、2.0及4.0 mg/mL的越橘提取物溶液。準確吸取不同濃度的越橘提取物溶液各1 mL,依次加入1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L水楊酸溶液和1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液,充分搖勻,在37 ℃水浴中反應(yīng)30 min,以去離子水為參比溶液,以VC為對照,每組分別設(shè)置3個平行,在510 nm測定吸光值,根據(jù)式(3)計算羥基自由基清除率,并計算IC50,IC50越小,表示清除能力越強[20]。

式(3)

式中:A0:空白對照的吸光度值;Ai:加入樣品后的吸光度值;Aj:樣品本身的吸光度值。

1.2.2.4 還原力的測定 越橘提取物用無水甲醇配制成0、50、100、150、200及250 μg/mL的樣品溶液。準確吸取不同濃度的越橘提取物溶液1 mL,依次加入磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)2.5 mL和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL,充分混勻,在50 ℃水浴中反應(yīng)30 min,快速冷卻,加入10%三氯乙酸2.5 mL,充分混勻,加入2.5 mL蒸餾水和0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL,充分搖勻,反應(yīng)10 min。以去離子水為參比,以VC為對照,在700 nm下測定吸光度值。還原力的大小用吸光度值來表示,吸光度值越大,表示還原力越強[21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標準差的形式呈現(xiàn),每個數(shù)據(jù)有三個重復(fù),數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Excel 2016和SPSS 20.0軟件,采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 越橘提取物中花青素的組成及含量分析

2.1.1 越橘提取物中花青素的組成分析 通過HPLC-MS/MS對越橘提取物中花青素的組成進行分析鑒定,得到液相色譜圖,見圖1。對色譜圖中的有效峰進行質(zhì)譜分析得到含有不同質(zhì)荷比的分子離子峰和碎片離子峰,獲得化合物的分子量信息,并與文獻報道的組分相比較,推測出花青素組分,本文鑒定出越橘提取物中共有14種花青素,見表1。

表1 越橘提取物花青素分析Table 1 Anthocyanin analysis of bilberry extract

由圖1可以看出,越橘提取物中共檢測出14個花青素主峰,結(jié)合表1中的分子量可以發(fā)現(xiàn)越橘提取物含有5種花青素:飛燕草素(m/z 303),矢車菊素(m/z 287),矮牽牛素(m/z 317),芍藥素(m/z 301)和錦葵素(m/z 331)。

圖1 越橘提取物的液相色譜圖Fig.1 HPLC of bilberry extract

峰1和峰2具有相同的一級質(zhì)譜離子峰m/z 465和二級質(zhì)譜離子峰MS/MS=m/z 303,其二級質(zhì)譜具有明顯的離子峰m/z 303,故可判斷其為飛燕草素衍生物。m/z 465與碎片離子峰m/z 303相差162,為飛燕草素丟失的中性碎片,其可以是葡萄糖苷或半乳糖苷。根據(jù)文獻報道[22-24]和兩種糖苷的洗脫順序為半乳糖苷比葡萄糖苷更早洗脫,因此可確定峰1為飛燕草素-3-O-半乳糖苷,峰2為飛燕草素-3-O-葡萄糖苷。同理,可以推測峰3為矢車菊素-3-O-半乳糖苷,峰5為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷,峰6為矮牽牛素-3-O-半乳糖苷,峰8為矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷,峰9為芍藥素-3-O-半乳糖苷,峰11為芍藥素-3-O-葡萄糖苷。

峰4的一級質(zhì)譜離子峰m/z 435和二級質(zhì)譜離子峰MS/MS=m/z 303,可判斷為飛燕草素衍生物。m/z 435與碎片離子峰m/z 303相差132,表示丟失一個阿拉伯糖苷[25],因此可判斷峰4為飛燕草素-3-O-阿拉伯糖苷。同理,峰7為矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷。

由峰10的一級質(zhì)譜離子峰m/z 303,可推斷其為游離的飛燕草素。峰14的一級質(zhì)譜離子峰m/z 287,可判斷其為矢車菊素。

峰13的一級質(zhì)譜離子峰m/z 463,其二級質(zhì)譜離子峰MS/MS=m/z 331,其二級質(zhì)譜具有明顯的離子峰m/z 331,可判斷其為錦葵素類花青素,162表示母離子丟失一個葡萄糖苷,結(jié)合參考文獻[16]可確定峰13為錦葵素-3-O-阿拉伯糖苷。

2.1.2 越橘提取物中花青素的含量分析

2.1.2.1 標準曲線的確定 分別配制濃度為2、5、10、25、50、100 μg/mL的矢車菊素-3-葡萄糖苷標準溶液,按照1.2.1.3中色譜條件進行測定。以矢車菊素-3-葡萄糖苷質(zhì)量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標繪制標準曲線。得到其峰面積與濃度有良好的線性關(guān)系,回歸方程y=58286x+67727,R2=0.9995。

2.1.2.2 精密度實驗 將質(zhì)量濃度為100 μg/mL的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準品按照1.2.1.3中色譜條件進行測定,重復(fù)進樣6次,測得色譜峰面積的相對標準偏差(RSD)為0.57%,表明在該色譜條件下精密度良好。

2.1.2.3 重復(fù)性實驗 取越橘提取物6份,按照1.2.1方法處理并進行測定,測得越橘提取物中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的RSD為2.73%,表明該方法重復(fù)性較好。

2.1.2.4 加樣回收率實驗 在已知含量的越橘提取物溶液中分別加入矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準品(5、10、25 μg/mL),連續(xù)進樣三次,每次20 μL。加樣回收率實驗結(jié)果表明:矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的平均回收率為99.14%,RSD為0.95%,表明該方法具有較高的加樣回收率。

2.1.2.5 越橘提取物中花青素的含量測定 以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為標品,對越橘提取物的花青素進行定量分析。通過對同一化合物不同的異構(gòu)體的峰面積加合起來進行總量的計算,結(jié)果表示為均值±SD μg(矢車菊素-3-葡萄糖苷當(dāng)量)/mg(越橘提取物)[26]。花青素各組分的含量見表2。

表2 越橘提取物中花青素各組分的含量Table 2 Content of anthocyanins in bilberry extract

經(jīng)計算,越橘提取物中花青素的總含量為408.74 μg/mg。其中,矢車菊素類花青素含量最高,為159.93 μg/mg,占總含量的39.12%。

2.2 越橘提取物的抗氧化能力分析

2.2.1 DPPH自由基清除能力 越橘提取物和VC的DPPH自由基清除能力的測定結(jié)果,如圖2所示。在濃度為10～50 μg/mL范圍內(nèi),越橘提取物的DPPH自由基清除率從22.26%增加到了86.09%。在每個濃度下,越橘提取物的DPPH自由基清除率都低于VC的,VC的濃度為20 μg/mL時,DPPH清除率就達到95%以上,并且在之后趨于平穩(wěn)。經(jīng)計算,越橘提取物和VC的DPPH清除率的IC50分別為26.16和7.35 μg/mL。根據(jù)IC50可知越橘提取物有良好的DPPH清除能力,但相對于VC較弱。

圖2 越橘提取物和VC的DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH free radical scavenging ability of bilberry extract and VC

2.2.2 ABTS自由基清除能力 越橘提取物和VC的ABTS自由基清除能力的測定結(jié)果,如圖3所示。隨著樣品質(zhì)量濃度的增加,越橘提取物和VC的ABTS自由基清除率都呈現(xiàn)增長的趨勢。在相同的質(zhì)量濃度下,越橘提取物清除ABTS自由基的能力強于VC。當(dāng)濃度達到30 μg/mL時,越橘提取物和VC的ABTS自由基清除率都達到90%以上,并且在之后趨于平穩(wěn),并接近100%。經(jīng)計算,越橘提取物和VC的ABTS自由基清除率的IC50分別為13.07和15.55 μg/mL。根據(jù)IC50可知,越橘提取物有強于VC的ABTS自由基清除能力。

圖3 越橘提取物和VC的ABTS+自由基清除能力Fig.3 ABTS free radical scavenging ability of bilberry extract and VC

2.2.3 羥基自由基清除能力 羥基自由基(·OH)是活性氧類物質(zhì)中化學(xué)性質(zhì)最活潑的一種自由基,其在自由基病理學(xué)上具有高度損傷性,它的損傷能力幾乎在每一個活細胞內(nèi)都能發(fā)生,是危害最大一種最大的自由基[27]。越橘提取物和VC清除羥基自由基的結(jié)果見圖4。如圖4所示,在實驗濃度范圍內(nèi),越橘提取物的羥基自由基清除率隨濃度的增加而增加,清除率從15.43%增加到90.27%。同時,VC在濃度為1.0 mg/mL時,清除率就達到99%,并且在之后接近100%。經(jīng)計算,越橘提取物和VC的羥基自由基清除率的IC50分別為1.91和0.48 mg/mL。根據(jù)IC50可知,越橘提取物有較強的羥基自由基清除能力,但是相對于VC較弱。

圖4 越橘提取物和VC的羥基自由基清除能力Fig.4 Hydroxyl free radical scavenging ability of bilberry extract and VC

2.2.4 還原力 常用還原鐵氰化鉀的方法來測定還原力的大小,抗氧化劑可以將Fe3+還原成Fe2+,測定700 nm處的吸光度值可以反映Fe2+數(shù)量,來代表還原力的大小[28]。越橘提取物和VC的還原力如圖5所示。由圖5可知,越橘提取物和VC的還原能力都隨濃度增大而增大。在實驗濃度范圍內(nèi),越橘提取物的還原力從0.043增加到0.617,而VC對照的還原力從0.043增加到1.162,且在相同濃度下,越橘提取物的還原力低于VC。

圖5 越橘提取物和VC的還原力Fig.5 The reducing power of bilberry extract and VC

3 結(jié)論

本文通過HPLC-MS/MS鑒定出越橘提取物中含有14種花青素,分別為飛燕草素-3-O-半乳糖苷、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷、飛燕草素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖、矮牽牛素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷、芍藥素-3-O-半乳糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷、錦葵素-3-O-阿拉伯糖苷、錦葵素-3-O-阿拉伯糖苷、飛燕草素和矢車菊素。以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為標品,得到越橘提取物中總花青素含量為408.74 μg/mg。體外抗氧化活性實驗結(jié)果表明,越橘提取物有良好的DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和還原力,但相比于VC較弱,其ABTS自由基清除能力強于VC。本研究可以為進一步開發(fā)越橘類功能性產(chǎn)品提供實驗依據(jù)。