枸杞色素微乳液的理化穩定性

張春蘭1,2,李 斌

(1.塔里木大學生命科學學院,新疆阿拉爾 843300; 2.南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室,新疆阿拉爾 843300; 3.華中農業大學食品科學技術學院,湖北武漢 430070)

枸杞(Lyciumbarbarum)為茄科枸杞屬植物的成熟果實。枸杞是名貴的藥材和滋補品,具有養陰補血、滋補肝腎、益精明目的功效。枸杞色素是存在于枸杞漿果中各種呈色物質的總稱[1]。枸杞色素主要是由脂溶性色素構成,包括類胡蘿卜素及其類黃酮[2-3]。

國內外研究者們對枸杞多糖、生物堿、多肽、生育酚等的化學組成以及各成分的功效等都進行了研究。關于枸杞色素的研究主要集中在其檢測、提取、純化和穩定性方面[4-5]。對枸杞色素功能方面的研究很少,孫高峰等發現枸杞色素具有一定延緩衰老的作用[6],而且枸杞色素在體外能清除自由基[7],大鼠葡萄膜炎也能被一定濃度的枸杞色素所抑制[8]。國內外對枸杞中的天然色素-類胡蘿卜素這一重要活性成分研究尚不夠深入,應用不夠廣泛,而類胡蘿卜素不溶于水且性質不穩定[9],生物利用度低,可能是限制其廣泛應用的瓶頸。

生物活性成分穩定性差,不易保存,目前采用乳液體系增溶、輸送、保護生物活性成分的研究已較為廣泛。枸杞色素屬于脂溶性色素,屬于生物活性成分,很難溶于水,而將枸杞色素溶解在油中,再添加乳化劑制備成乳液,可以提高枸杞色素在水中的溶解性,從而達到增溶的目的。因枸杞色素微乳液粒徑小,所以其能夠在澄清飲料等感官要求透明的食品中得到應用,但是成分較多較復雜的食品體系是否會影響枸杞色素微乳液的穩定性尚未得知。因此本文研究食品環境因素(溫度、pH、加熱、離子強度、抗氧化劑和EDTA-2Na)對枸杞色素微乳液的粒徑大小和枸杞色素保留率等物理化學穩定性的影響,將為微乳液在食品環境條件中的應用提供可靠依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中鏈甘油三酸酯(MCT食品級) 武漢博星化學試劑公司;吐溫80、司盤80、乙醇、正己烷、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、抗壞血酸、丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯、沒食子酸丙酯、乙二胺四乙酸二鈉等均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

BSA124S-CW分析天平 德國Sartorius;85-2磁力攪拌器 鄭州長城科工貿有限公司;Nano-ZS納米粒度測定儀 英國Malvern公司;UV-1100紫外可見分光光度計 美普達有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;SC-3614低速離心機 安徽中科中佳科學儀器公司;Avanti J-E超速冷凍離心機 河南致達電子有限公司;TU-1900雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;FE20 pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微乳液的制備 枸杞皮渣經過清洗、浸泡,將枸杞皮和枸杞籽分離,枸杞皮真空干燥、粉碎后,用正己烷充分浸提其中的脂溶性色素,浸提液濃縮、冷凍干燥,即得枸杞色素油樹脂。根據Saberi的方法[10-11]采用自乳化法制備枸杞色素微乳液。首先,將枸杞色素油樹脂溶解在MCT中,使其含0.2%的類胡蘿卜素,含有色素的MCT作為油相,再將表面活性劑(吐溫80∶司盤80=8.5∶1.5 W/W)與油相按照質量比2∶1的比例混合,然后在室溫下逐滴地把30 g混合物加入到有磁力攪拌的70 g水相中,繼續在磁力攪拌器上攪拌15 min使其充分擴散后得到枸杞色素微乳液。

1.2.2 貯存溫度對微乳液穩定性的影響 將制備好的微乳液以及對照樣品(將枸杞色素溶解在MCT中使其含總類胡蘿卜素0.02%)分別在4、25、37 ℃下避光貯存10 d,每兩天取樣測定微乳液中總類胡蘿卜素含量,計算色素保留率。

1.2.3 pH對微乳液穩定性的影響 將制備好的微乳液用0.2 mol/L的HCl或NaOH分別調節成pH3.5、4.5、5.5、6.5、7.5在室溫避光處貯存,每兩天取樣測定色素的保留率。

1.2.4 加熱處理對微乳液穩定性的影響 將微乳液放于密閉的小瓶內,并在水浴鍋中不同溫度20、40、60、80 ℃加熱30 min后,取出立即流水冷卻至室溫,測定色素的保留率并測定粒徑和粒徑分布。

1.2.5 NaCl濃度對微乳液穩定性的影響 在微乳液中分別加入一定量的NaCl,使其終濃度為1%、2%、3%、4%、5%,以不加鹽離子的微乳液為空白,將各樣品放在55 ℃烘箱中,每天測定色素的保留率。

1.2.6 常用抗氧化劑和金屬螯合劑對微乳液穩定性的影響 選取常用的水溶性抗氧化劑VC,脂溶性抗氧化劑丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)、沒食子酸丙酯(PG),以及金屬螯合劑乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na),參考GB2760-2014的要求將VC(0.2、0.5、1、2 g/kg)、EDTA-2Na(0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 g/kg)添加入制備好的微乳液中。BHA、BHT、PG以0.2 g/kg的濃度添加入MCT中,再制成微乳液,以不加添加劑的微乳液為空白對照,將各樣品放在55 ℃烘箱中,每天測定色素的保留率。

1.2.7 指標的測定

1.2.7.1 粒徑的測定 將微乳液用pH7.0的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋100倍后,采用Nano-ZS粒度儀測定微乳液粒徑。

1.2.7.2 總類胡蘿卜素含量及保留率的測定 稱取1.00 g的微乳液與2 mL正己烷∶乙醇(1∶1,V/V)混合、渦旋后在4000 r/min離心10 min。將溶解有類胡蘿卜素的上層正己烷層收集起來,下層溶液繼續與有機溶劑混合、離心,收集上層并與前面的正己烷層合并。相同的操作繼續同上,直到下層無色。以上層萃取溶劑正己烷為參照,收集的上層有機相在450 nm下測定吸光度A,總類胡蘿卜素的含量根據McBeth的公式計算[12-13]。

色素的保留率(%)=C/C0×100

式中,C為測定時微乳液或MCT中總類胡蘿卜素含量mg/100 g,C0為初始微乳液或MCT中總類胡蘿卜素含量mg/100 g。

1.2.7.3 濁度的測定 將制備好的pH為7的微乳液放在1 cm比色皿中,用雙光束分光光度計(帶有溫度控制裝置),在600 nm以蒸餾水為參比,從20～85 ℃以1 ℃/min的升溫速率對微乳液進行加熱,測定微乳液的透光率,根據計算公式:濁度=-LN(透光率/100),計算出微乳液濁度。

1.3 數據處理

每個試驗各值均為3個平行數據的均值,試驗數據采用Excel進行分析,采用Origin 8.0軟件進行科技作圖。

2 結果與分析

2.1 貯存溫度對微乳液穩定性的影響

以溶有枸杞色素油樹脂的MCT為對照,研究了4、25及37 ℃三種貯藏溫度對枸杞色素微乳液穩定性的影響。由圖1可以看出,隨著貯存時間的延長,枸杞色素的保留率逐漸減小。溫度越高,對枸杞色素微乳液穩定性的影響越大,微乳液的色素保留率越低。在整個貯藏期內,4 ℃條件下貯存的枸杞色素其保留率下降緩慢,貯存10d后,保留率在80%以上。在4 ℃下貯藏的微乳液,其色素保留率高于在25 ℃及37 ℃下貯藏的微乳液,說明較高的貯存溫度會加速色素降解。

圖1 貯存溫度對微乳液穩定性的影響Fig.1 Influence of storage temperature on the stability of microemulsions

對于微乳液體系來說,油滴的外層有一層乳化劑包裹,理論上應對油脂中的枸杞色素起到一定的保護作用,但從實驗結果看,乳化劑的存在并沒有延緩枸杞色素的氧化。這可能是因為:一方面,微乳液粒徑小,具有很大的比表面積,從而促進了油水界面上的化學降解反應[14]。同時該微乳液是較透明的,紫外光和可見光能透過微乳液,從而促進光敏降解反應。另一方面,乳液對生物活性成分的保護作用與其界面組成、界面厚度都有一定的關系,一般不同食品乳化劑形成的界面膜厚度為:小分子表面活性劑(如吐溫、司盤)<球蛋白(如乳清蛋白、大豆蛋白)<纖維蛋白(如酪蛋白、明膠)<多糖(如阿拉伯膠、變性淀粉)[15],本實驗采用的是小分子表面活性劑,因此形成的界面膜較薄。

2.2 pH對微乳液穩定性的影響

各種食品體系都具有一定的酸堿性,大部分飲料偏酸性,因此對不同pH下微乳液中枸杞色素的穩定性進行研究是十分有必要的。從圖2中可以看出,pH對微乳液體系中枸杞色素的穩定性有一定的影響。枸杞色素微乳液體系在中性條件下,其色素保留率較高。在酸性條件下(pH≤5.5)隨著貯存時間的延長,枸杞色素的保留率急劇下降,微乳液由桔紅色變為近乎無色,在貯藏后期,保留率幾乎接近于0。以前的研究也表明,O/W微乳液中類胡蘿卜素(番茄紅素)在酸性條件下的降解速率更快[16]。進一步的研究發現,類胡蘿卜素在酸性條件下不穩定的機制是:類胡蘿卜素的質子化,然后經歷順反異構化和降解反應[17-18]。

圖2 pH對微乳液穩定性的影響Fig.2 Influence of pH on the stability of microemulsions

2.3 加熱處理對微乳液穩定性的影響

溫度是導致天然色素不穩定的主要因素。一般高溫加熱會使類胡蘿卜素異構化,使反式構型轉化成為生物利用率低的順式結構,還可能發生熱降解。同時,加熱處理可能也會造成微乳液粒徑增大,濁度增加。由圖3a可知,隨著加熱溫度的升高,微乳液及MCT中的色素含量均降低,說明加熱使樣品的色素發生了一定降解。80 ℃下加熱30 min,微乳液色素保留率約為86%,而MCT中的色素保留率約為83%,兩種體系的色素降解率基本一致。從整體看,相同溫度處理后,微乳液的色素保留率與MCT幾乎一致,可能是色素被較薄的界面膜所包裹,同時該界面膜也不能有效阻礙熱傳導,因此沒有對色素起到很好的保護作用。

由圖3b可以看出,微乳液經過不同溫度加熱后,粒徑逐漸增加,由初始的30 nm增加至120 nm左右,在60 ℃粒徑已增加至55 nm,微乳液體系由澄清透明轉變為渾濁狀態,而且此過程不可逆。

圖3 加熱處理對微乳液穩定性(a)、粒徑(b)和濁度(c)的影響Fig.3 Influence of heating temperature on the stability(a),droplets size(b)and turbidity(c)of microemulsions

由圖3c可以看出,在采用溫度掃描實驗測定濁度過程中,微乳液以1 ℃/min升溫時,微乳液的濁度也發生了明顯的變化。在70 ℃之前微乳液體系的濁度值低,微乳液較澄清,而當溫度高于70 ℃,微乳液的濁度迅速上升,在85 ℃濁度達到6.9 cm-1。總的來說,微乳液體系在溫度升高后,都會有粒徑增大、渾濁現象,而且該體系在溫度降低后不會恢復到澄清透明的狀態。Saberi等采用10%的吐溫80制備的微乳液也發生了相同的現象,溫度向相轉變溫度(PIT)升高時,乳滴的聚集速率通常會隨著溫度的升高而增加[19]。這是由于表面活性劑末端的脫水引起了最佳曲率和界面張力的改變[11]。同時,Saberi等在水相中加入40%甘油或者少量SDS均能抑制吐溫微乳液加熱時的渾濁現象。

2.4 NaCl對微乳液穩定性的影響

由圖4可以看出,隨著時間的延長,微乳液中枸杞色素的保留率逐漸下降,經過6 d的加速氧化,其色素保留率接近0。微乳液體系中加入不同量的NaCl,對色素保留率影響不大。加鹽體系的色素保留率略高于不加鹽的體系,這可能是因為加鹽體系的滲透壓高,使體系中的溶解氧量減少,從而減少了枸杞色素的氧化。

圖4 鹽濃度對微乳液穩定性的影響Fig.4 Influence of NaClconcentration on the stability of microemulsions

2.5 抗氧化劑和金屬螯合劑對微乳液穩定性的影響

維生素C是一種水溶性維生素,水果和蔬菜中含量豐富,也常作為添加劑存在于各類食品中。從圖5a可以看出,微乳液體系中添加一定量的維生素C,可以對枸杞色素起到保護作用。當VC的濃度為2 g/kg時,經過6 d的加速氧化,體系中色素的保留率約為33%,而空白組的幾乎為0。由圖5a可以看出,VC的濃度越高,枸杞色素微乳液的色素保留率越高,這可能是因為VC本身極易氧化,能與體系中的氧發生反應,從而降低了體系的含氧量,阻止色素與氧發生反應。

BHA、BHT、PG是常用的油溶性抗氧化劑,由圖5b可以看出,在油相中添加一定量的脂溶性抗氧化劑,其微乳液體系的色素保留率顯著高于空白組的,在6 d加速氧化后,添加抗氧化劑的微乳液體系的色素保留率為73.8%～81%,而空白組的幾乎為0,說明脂溶性抗氧化劑能很好地維持微乳液體系的穩定性。這主要是因為它們是自由基清除劑,能吸收氧化產生的自由基,阻斷自由基鏈式反應。

金屬離子的存在往往會促進油脂、色素等的氧化降解。EDTA-2Na是一種常用的金屬離子螯合劑,由圖5c可知,含EDTA-2Na的微乳液色素在經過6 d 55 ℃的氧化后,保留率為11%左右,高于空白組,但五個添加量的微乳液色素保留率差異不顯著,可能是當EDTA的濃度達到0.05 g/kg時即可把體系中存在的全部金屬離子螯合掉,因而再增大EDTA的濃度對微乳液的穩定性影響不大。從實驗結果中可以得出,EDTA為0.05 g/kg時即可提高枸杞色素微乳液的化學穩定性。

圖5 抗氧化劑(a)VC、(b)0.2 g/kg脂溶性抗氧化劑和(c)EDTA-2Na對微乳液穩定性的影響Fig.5 Influence of antioxidants(a)VC,(b)fat-soluble antioxidants and(c)EDTA-2Na on the stability of microemulsions

3 結論

枸杞色素微乳液在4 ℃條件下貯存10 d后,枸杞色素保留率在80%以上。食品環境中的酸性條件對微乳液有影響,在酸性條件下經過10 d的貯存,色素保留率幾乎為0。微乳液經過不同溫度加熱后,粒徑逐漸增加,由初始的30 nm增加至120 nm左右,在60 ℃粒徑已增加至55 nm,微乳液體系由澄清透明轉變為渾濁狀態,而且發現此過程不可逆。當溫度高于70 ℃,微乳液的濁度迅速上升,在85 ℃濁度達到6.9 cm-1。添加抗氧化劑可以明顯減緩微乳液中枸杞色素的降解,在6 d 55 ℃氧化后,添加脂溶性抗氧化劑的微乳液體系的色素保留率為73.8%～81%,添加VC的濃度為2 g/kg時,色素保留率約為33%。添加0.05 g/kg的EDTA可輕微提高枸杞色素微乳液的穩定性。該研究為非離子型表面活性劑穩定的微乳液在食品環境條件中的應用提供了可靠依據。