正交試驗優化蔬菜中多環芳烴檢測前處理工藝

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(1.廣西大學農學院,廣西南寧 530000; 2.南寧市農業科學研究所,廣西南寧 530000)

多環芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)是指分子中含有兩個或兩個以上苯環的一類碳氫化合物,具有致癌、致畸、致突變的“三致”毒性效應和一定的殘留性及蓄積性[1-2]。PAHs主要來源于生物質和石化燃料在高溫下的不完全燃燒,具有高熔點、高沸點及高的辛醇-水分配系數的性質,且隨著苯環數量的增加,水溶性減弱,脂溶性增強[3]。目前發現的PAHs及其衍生物有400多種,其中16種在1976年被美國環保局列入“優先控制的污染物”中[4],有研究發現,PAHs通過飲水和食物攝入人體為其主要的暴露途徑之一[5]。當下食品產地環境受到污染,導致PAHs在食品中存在,長期食用含有PAHs的食物對健康將產生潛在威脅[6]。

如今對于食品中PAHs的研究主要為油脂及油炸食品,對應的提取檢測方法也比較成熟[7-8],如索氏提取法、超聲波萃取法、微波輔助萃取法、加速溶劑提取法、凝膠滲透色譜法等[9]。崔艷紅等研究蔬菜中PAHs的提取和測定方法,首先50 ℃烘干制樣,采用加速溶劑提取法,經硫酸磺化和氟羅里硅土柱凈化后用GC-MS檢測,回收率在64%～124%[10]。張婷婷等研究青島市松針中PAHs的含量,采用索氏提取、氧化鋁-硅膠凈化柱凈化、GC-MS分析的方法,測定該方法的提取凈化效率在70.8%以上[11]。龍明華等研究南寧市蔬菜體內PAHs含量,采用烘干樣品,超聲萃取,弗羅里硅土柱凈化后使用HPLC檢測,該方法回收率在69.01%～149.26%[12]。高娟等測定植物提取物中PAHs含量,以環己烷為溶劑超聲提取,經硫酸凈化后用GC-MS檢測[13]。王雅琴等研究植物葉片中PAHs含量,采用冷凍干燥的方式處理樣品,硅膠凈化和濃縮后用GC-MS檢測[14]。蔬菜作為人們膳食主要組成之一,蔬菜體內PAHs的含量及機理研究較少,提取方法的不成熟成為其主要影響因素之一。這主要是蔬菜體內的脂溶性色素、脂肪酸、甾類等物質,對PAHs的定性、定量產生影響[15]。以上研究中PAHs檢測儀器主要集中于HPLC及GC-MS,儀器方法也較為成熟,但蔬菜樣品的前處理技術存在不足,多采用烘干或冷凍干燥的方式制備樣品,時間長,不適合大量樣品檢測。并且上述前處理方法,僅通過加標實驗測定回收率,以此確定前處理方案,但蔬菜樣品成分復雜且各成分與PAHs的共存關系尚不明確,所加標準品無法達到自然存在狀態,故以加標樣品為試材的方法存在不足。

本工藝建立的預實驗中,以娃娃菜、油麥、豆芽、白蘿卜、茄子為樣品,分別采用烘干制樣和鮮樣勻漿制樣的方式制備試材,經相同提取檢測處理[16],發現鮮樣樣品中PAHs提取量和檢出率均高于烘干樣品。本實驗以葉用萵苣為實驗對象,鮮樣打漿處理制備試材,采取單因素和正交試驗的方法優化試驗方案,利用HPLC測定不同前處理后蔬菜體內PAHs殘留量,并對提取效果最好的處理方案采取低、中、高三個階段的加標回收率實驗,驗證前處理方案。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

葉用萵苣(品種快大無斑甜脆油麥菜) 南寧市生源種業有限公司生產,種植于廣西大學蔬菜試驗基地;16種PAHs混標(萘(Nap)、苊烯(Acy)、苊(Ace)、芴(Flu)、菲(Phe)、蒽(Ant)、熒蒽(Fla)、芘(Pyr)、苯并[a]蒽(BaA)、屈(Chr)、苯并[b]熒蒽(BbF)、苯并[k]熒蒽(BkF)、苯并[a]芘(BaP)、二苯并[a,h]蒽(DBA)、苯并[g,h,i]芘(BPF)和茚并[1,2,3 - c,d]芘(IPY)) 規格1 mL,濃度200 mg/L,上海源葉生物有限公司;正己烷、二氯甲烷 色譜純,天津市大茂化學試劑廠;乙腈 色譜純,美國Thermo Fisher公司;濃硫酸 優級純,廉江市愛廉化試劑有限公司;弗羅里硅土柱 德國Simon Aldrich公司。

TW323L電子精密天平 日本島津公司;Waters-e2695高效液相色譜系統 美國Water公司;SUPELCOSILTMLC-PAH液相色譜柱 美國Supelco公司;YL-080S超聲波清洗機 深圳市語路清洗有限公司;RE-52A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;3K15高速冷凍離心機 德國Sigma公司;ZGDCY-12干式氮吹儀 上海梓桂儀器有限公司;L18-YL08打漿機 九陽股份有限公司;Vortex-Genie2渦旋混勻器 美國Scientific Industries公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 萵苣預處理 以新鮮萵苣葉片為試材,用清水洗凈表面雜質,并用濾紙吸干萵苣表面水分,使用打漿機將試材破碎,制備勻漿樣品,將樣品置于-20 ℃冰箱保存待用。

1.2.2 萵苣體內PAHs提取、凈化工藝流程 萵苣勻漿→加入提取劑→超聲波提取→離心(8000 r/min,5 min)→重復3次,合并提取液→硫酸磺化→2%的無水硫酸鈉溶液洗脫→減壓濃縮至3 mL→弗羅里硅土柱凈化→洗脫液濃縮→過0.22 μm濾器→PAHs粗提液。

取一定質量的萵苣葉片鮮樣制成勻漿置于離心管待測,取40 mL正己烷溶液與之混合,渦旋2 min后在20 ℃、超聲波功率480 W條件下提取20 min,8000 r/min下離心5 min,重復提取3次,合并上清液。

磺化階段:將提取液轉入分液漏斗中,向其中添加10 mL濃度為60%的硫酸溶液進行磺化,振蕩5 min,如有乳化則用30 mL 2%無水硫酸鈉溶液破乳,靜置分層后棄去水相,將有機層于旋轉蒸發儀濃縮至3 mL左右,進行固相萃取凈化程序。將濃縮液置于5 mL正己烷活化的弗羅里硅土柱,上樣后用12.00 mL洗脫液(二氯甲烷∶正己烷=2∶8, V∶V)洗脫。收集洗脫液,利用干式氮吹儀蒸發至干,轉化溶劑為1.5 mL乙腈,過0.22 μm有機濾器后用HPLC/UV測定PAHs含量,通過比較PAHs殘留量高低,確定適宜的工藝參數。

1.2.3 萵苣體內PAHs含量的測定 粗提液通過HPLC/UV測定PAHs含量,檢測條件參照龍彪[16]設置。

色譜柱:選用多環芳烴專用柱(SUPELCOSILTMLC-PAH,250 mm×4.6 mm,5 μm)

檢測條件:PDA檢測器檢測波長254 nm;流動相為乙腈和水,采用梯度洗脫、流速變化的方式分離不同組分PAHs,洗脫程序如表1;使用外標法對粗提液中所測物質定性、定量,從PAHs標準溶液濃度100～3000 μg/L范圍內,選取8個濃度梯度,繪制PAHs標準曲線,得出16種PAHs線性方程,每條校正曲線相關系數均大于0.999,檢出限范圍為0.51～4.82 μg/kg,相對標準偏差為0.05%～5.53%,說明該檢測方法具有良好精確性和重現性。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution schedule of mobile phase

1.2.4 萵苣體內PAHs檢測前處理單因素實驗 根據預實驗的結果,影響蔬菜體內PAHs提取、凈化的主要影響因素有樣品質量、提取液體積、超聲提取時間、硫酸體積、硫酸濃度、洗脫液配比等,以蔬菜體內PAHs的殘留量為指標,對以上6因子進行單因素實驗,分別考察以上6因子對PAHs殘留量的影響。

1.2.4.1 樣品提取質量的確定 分別稱取10.00、15.00、20.00、25.00、30.00 g 萵苣葉片鮮樣勻漿,其中提取液體積40 mL、超聲提取時間20 min、硫酸體積10 mL、硫酸濃度60%、洗脫液配比(二氯甲烷∶正己烷=2∶8,V/V)為固定水平。

1.2.4.2 提取液體積的確定 分別量取20、30、40、50、60 mL的正己烷溶液,其中樣品提取質量15.00 g、超聲波提取時間20 min、硫酸體積10 mL、硫酸濃度60%、洗脫液配比(二氯甲烷∶正己烷=2∶8,V/V)為固定水平。

1.2.4.3 超聲波提取時間的確定 分別超聲波提取0、10、20、30、40 min,其中樣品提取質量15.00 g、提取液體積50 mL、硫酸體積10 mL、硫酸濃度60%、洗脫液配比(二氯甲烷∶正己烷=2∶8,V/V)為固定水平。

1.2.4.4 硫酸濃度的確定 分別添加濃度為20%、40%、60%、80%、98%的硫酸溶液進行磺化處理,其中樣品提取質量15.00 g、提取液體積50 mL、超聲波提取時間30 min、硫酸體積10 mL、洗脫液配比(二氯甲烷∶正己烷=2∶8,V/V)為固定水平。

1.2.4.5 硫酸體積的確定 分別添加0、5、10、15、20 mL的硫酸溶液,其中樣品提取質量15.00 g、提取液體積50 mL、超聲波提取時間30 min、硫酸濃度40%、洗脫液配比(二氯甲烷∶正己烷=2 V∶8 V)為固定水平。

1.2.4.6 洗脫液配比的確定 分別以(A)12 mL正己烷、(B)12 mL二氯甲烷/正己烷(V1∶V2=2∶8)、(C)6 mL正己烷和6 mL二氯甲烷/正己烷(V1∶V2=1∶9)、(D)6 mL正己烷和6 mL二氯甲烷/正己烷(V1∶V2=2∶8)、(E)6 mL正己烷和6 mL二氯甲烷/正己烷(V1∶V2=3∶7)、(F)6 mL正己烷和6 mL二氯甲烷/正己烷(V1∶V2=4∶6)、(G)6 mL正己烷和6 mL二氯甲烷/正己烷(V1∶V2=5∶5)進行洗脫,其中樣品提取質量15.00 g、提取液體積50 mL、超聲波提取時間30 min、硫酸濃度40%、硫酸體積15 mL為固定水平。

1.2.5 萵苣體內PAHs提取的正交試驗 以樣品質量、超聲波提取時間、硫酸體積、硫酸濃度、洗脫液配比、提取液體積為因子,設計L25(56)的正交試驗方案,比較不同處理下PAHs殘留量,確定PAHs提取的最佳工藝參數,正交試驗因素及水平如表2。

1.2.6 萵苣體內PAHs提取的回收率試驗 選取由正交實驗得到的提取率最高的前處理工藝參數,通過向樣品添加16種PAHs混合標品進行回收率測定。取萵苣勻漿樣品,分為四組構成高中低三個加標組及一個空白對照組,每個加標水平重復測定6次,計算回收率,并計算RSDs值,表示方法重復性。

1.3 數據處理

實驗數據用SPSS 18.0進行統計分析。

2 結果與討論

2.1 萵苣體內PAHs提取工藝單因素實驗結果

2.1.1 樣品質量對殘留量的影響 根據前人的研究,在相同生長環境下葉菜類體內積累的PAHs含量遠高于果菜類和根莖類[17-18],且16種多環芳烴的檢出率較高[19]。試驗萵苣均定植于廣西大學蔬菜試驗基地,保證試驗樣品批間一致,本實驗選用葉用萵苣葉片鮮樣為試材,制備勻漿,進行實驗。由圖1和圖2可知,在樣品質量由10 g上升到15 g時,PAHs殘留量增加23.75%,主要由于蔬菜體內PAHs含量較低,樣品質量較少時,部分PAHs達不到檢測水平。繼續增加樣品質量,在由15～30 g的范圍內,殘留量逐漸降低,由于樣品質量增加,提取液中雜質含量增加,超出固相萃取柱凈化能力,影響提取效果。綜合考慮以上因素,以樣品質量15 g為基準,選取13、14、15、16、17 g五個水平進行正交實驗。

圖2 樣品質量對∑PAHs殘留量的影響Fig.2 Effect of sample quality on residue of ∑PAHs

2.1.2 提取液體積對殘留量的影響 PAHs為脂溶性物質,易溶于非極性有機溶劑,如:正己烷、丙酮、二氯甲烷等。這些有機溶劑也是食物、植物中常用的PAHs提取劑,根據文獻及預實驗選用正己烷為提取溶劑[17,20]。由圖3和圖4可知,在樣品質量為20 g的前提下,正己烷體積在20～50 mL的范圍內,∑PAHs殘留量隨提取液體積的增加而增加,在提取液體積為40、50 mL時,Ace、Pyr也被檢測出來。說明隨提取液體積增加,勻漿樣品充分溶解,測得PAHs殘留量升高,繼續提高提取液體積到60 mL,殘留量有所降低。綜上分析,選擇以提取液體積50 mL為基準,選取46、48、50、52、54 mL五個水平進行正交實驗。

圖3 提取液體積對PAH16殘留量的影響Fig.3 Effect of extract volume on residue of PAH16

圖4 提取液體積對∑PAHs殘留量的影響Fig.4 Effect of extract volume on residue of ∑PAHs

2.1.3 超聲波提取時間對殘留量的影響 本實驗使用超聲波提取法,因為該方法在研究土壤、植物、食物中PAHs含量時應用廣泛,具有節約溶劑、萃取效率高、萃取時間短的優點[21-22]。樣品和溶劑的混合物在20 ℃,450 W的條件下超聲波提取,由圖5和圖6可知,超聲波提取時間在0～30 min的范圍內,隨時間的增加,測得∑PAHs殘留量提高,在30 min時達到最大值。這主要由于隨超聲波提取時間增加,超聲波空化效應和機械作用有效破碎細胞壁,促進勻漿樣品PAHs提取[23]。30 min后∑PAHs殘留量呈現下降趨勢,多種PAHs殘留量均降低,分析原因可能由于超聲波時間過長導致部分PAHs不穩定。但其中Ace和Fla兩種PAH在30、40 min時被檢出,推測兩種物質與樣品的吸附更加緊密,不易剝除。綜上分析,選擇以超聲波提取時間30 min為基準,選取22、26、30、34、38 min五個水平進行正交實驗。

圖5 超聲波提取時間對PAH16殘留量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic extraction time on residue of PAH16

圖6 超聲波提取時間對∑PAHs殘留量的影響Fig.6 Effect of ultrasonic extraction time on residue of ∑PAHs

2.1.4 硫酸濃度對殘留量的影響 蔬菜樣品經超聲波提取后,提取液內含有大量脂溶性色素、脂肪酸、甾類等雜質[14],僅通過弗羅里硅土柱無法達到凈化標準,影響檢測結果。其中氫氧化鉀皂化法和濃硫酸磺化法除去雜質較為常用[24],且硫酸濃度多為60%。本研究以葉用萵苣葉片鮮樣勻漿為材料,改變硫酸濃度,確定最適范圍。由圖7和圖8可知,在硫酸濃度20%～98%的范圍內,測得蔬菜體內PAHs的殘留量先升高后下降,在硫酸濃度為40%時殘留量最高。主要由于硫酸濃度過低,氧化性較差,無法去除雜質,影響檢測結果;但隨硫酸濃度升高,提取液愈加透明,雜質含量降低,也會造成PAHs氧化降解,其中Pyr和BaP含量變化較為明顯。并且由于采用蔬菜勻漿提取,提取液相比干樣提取含水量會升高,高濃度硫酸會造成放熱,可能致使低環PAHs揮發。綜上考慮,選擇硫酸濃度40%為基準,選取硫酸濃度為30%、35%、40%、45%、50%五個水平進行正交試驗。

圖7 硫酸濃度對PAH16殘留量的影響Fig.7 Effect of sulfuric acid concentration on residue of PAH16

圖8 硫酸濃度對∑PAHs殘留量的影響Fig.8 Effect of sulfuric acid concentration on residue of ∑PAHs

2.1.5 硫酸體積對殘留量的影響 在樣品質量和硫酸濃度不變的前提下,改變硫酸體積。由圖9和圖10可知,添加的硫酸體積在0～20 mL的范圍內,測得萵苣體內PAHs殘留量逐漸增高,在15 mL時達到最佳,隨后下降。除不添加硫酸組,其它組∑PAHs殘留量變化均不明顯,但在硫酸添加量15 mL時,檢出PAHs種類最多,凈化效果最好。綜上考慮,選擇硫酸添加體積15 mL為基準,選取添加硫酸體積13、14、15、16、17 mL五個水平進行正交試驗。

圖9 硫酸體積對PAH16殘留量的影響Fig.9 Effect of sulfuric acid volume on residue of PAH16

圖10 硫酸體積對∑PAHs殘留量的影響Fig.10 Effect of sulfuric acid volume on residue of ∑PAHs

2.1.6 洗脫液配比對殘留量的影響 經硫酸磺化處理過的提取液中仍含有大量雜質,基線漂移嚴重,需經進一步的純化才能通過色譜儀檢測。當下常用固相萃取材料多為中性氧化鋁、弗羅里土、和硅膠填料小柱[25-26]。研究表明,在PAHs處理上弗羅里硅土柱凈化效果明顯[27],龍彪等人也得出同樣結論[16],故此實驗也選擇同種小柱。以不同配比的正己烷和二氯甲烷混合溶液為洗脫液,在土壤、油脂的PAHs含量分析中有較多研究[28],并指出洗脫液中二氯甲烷含量增加會導致雜質被洗脫出來,造成目標物檢測干擾。本實驗旨在選取適宜洗脫液配比,提高萃取率,分別對一次洗脫和分段洗脫進行對比。由圖11和圖12可知,一次洗脫,僅使用12 mL正己烷洗脫效果較差,多種PAHs未被檢測出;(B)12 mL二氯甲烷/正己烷(V1∶V2=2∶8)與分段洗脫(D)6 mL正己烷和6 mL二氯甲烷/正己烷(V1∶V2=2∶8)測得的∑PAHs殘留量相近;但是分段洗脫由(C)6 mL正己烷和6 mL二氯甲烷/正己烷(V1∶V2=1∶9)到(E)6 mL正己烷和6 mL二氯甲烷/正己烷(V1∶V2=3∶7),隨二氯甲烷含量增加,殘留量增加,PAHs檢出種類增加;繼續增加洗脫液中二氯甲烷含量,殘留量逐漸降低,雜質增加。綜上考慮,選擇分段洗脫以(E)6 mL正己烷和6 mL二氯甲烷/正己烷(V1∶V2=3∶7)為基準,選取6 mL正己烷+6 mL不同配比二氯甲烷/正己烷V1∶V2=2∶8、2.5∶7.5、3∶7、3.5∶6.5、4∶6五個水平進行正交試驗。

圖12 洗脫液類型對∑PAHs殘留量的影響Fig.12 Effect of eluent type on residue of ∑PAHs注:A～G指示同1.2.4.6。

2.2 萵苣體內PAHs前處理正交試驗結果

由表3結果可知,根據方差R可以分析得,影響萵苣體內PAHs提取率的各因素作用主次順序是:洗脫液配比>樣品質量>硫酸濃度>提取液體積>硫酸體積>超聲波提取時間。通過K值比較得到本實驗最佳因素組合為A2B4C1D3E3F2不在正交表中,進行驗證實驗,測到萵苣體內PAHs提取量為(865.322±18.968) μg/kg,低于實驗10的提取量(961.541±14.264) μg/kg。所以該正交試驗的最佳條件確定為A2B5C1D2E3F4,即提取液體積52 mL、即提取樣品質量14 g、超聲波提取時間38 min、硫酸體積13 mL、硫酸濃度35%、洗脫液類型6 mL正己烷和6 mL二氯甲烷/正己烷(V1∶V2=3∶7),此時萵苣體內PAHs提取量最大為(961.541±14.264) μg/kg。在此基礎上進行萵苣體內PAHs提取的回收率實驗,初步推斷該方案的損耗情況。

表3 萵苣體內PAHs前處理正交實驗結果Table 3 Orthogonal experiment results of pre-treatment process for PAHs from Lactuca sativa L.

2.3 萵苣中PAHs前處理回收率實驗

萵苣體內PAHs前處理方案的準確度和精密度分別用加標回收率和相對標準偏差(RSDs)驗證。由以上單因素和正交試驗結果可知:蔬菜體內16種PAHs除苊稀(Acy)、茚并[1,2,3-c,d]芘(IPY)外含量均在30 μg/kg左右,根據樣品中PAH16的含量,設置低、中、高3個添加水平上[29],加標水平分別為30、60、90 μg/kg,每個添加水平上做6組平行實驗。由表4可知在加標量為30 μg/kg時,萵苣樣品中PAHs各組分回收率為80.58%～142.04%,RSDs為1.35%～8.23%;在加標量為60 μg/kg時,萵苣樣品中PAHs各組分回收率為82.97%～137.26%,RSDs為1.56%～8.96%;在加標量為90 μg/kg時,萵苣樣品中PAHs各組分回收率為80.54%～136.32%,RSDs為1.70%～6.03%。萵苣體內各組分PAHs回收率為80.54%～142.04%,RSDs在1.35%～8.96%之間,說明該方法具有較好的準確性和精密度。

表4 萵苣體內PAHs前處理的回收率和相對標準偏差(n=6)Table 4 The recovery rate and RSDs of pre-treatment process for PAHs from Lactuca sativa L.(n=6)

3 結論

通過單因素分析和正交試驗建立蔬菜體內PAHs檢測前處理工藝,得出影響檢測PAHs殘留量的各因素主次順序是:洗脫液配比>樣品質量>硫酸濃度>提取液體積>硫酸體積>超聲波提取時間。最佳處理條件:提取液體積52 mL、樣品質量14 g、超聲波提取時間38 min、硫酸體積13 mL、硫酸濃度35%、洗脫液類型6 mL正己烷和6 mL二氯甲烷/正己烷(V1∶V2=3∶7),在此條件下測得萵苣體內PAHs含量最高為961.541 μg/kg;此工藝條件下進行加標回收率實驗驗證,得出加標回收率為80.54%～142.04%,RSDs為1.35%～8.96%,具有較好的準確度和精密度。綜上得出該前處理工藝提取效果好、制樣簡單可應用于蔬菜體內PAHs提取,為蔬菜體內PAHs變化機理研究奠定基礎。