響應面法優化復合酶輔助超聲波提取柚子皮總黃酮工藝

劉媛潔1,張 良

(1.江西醫學高等專科學校,江西上饒 334000; 2.江西省食品發酵研究所,江西宜春 336000)

柚子(Citrusgrandis)為蕓香科柑橘屬的植物果實[1],主要產區是南方地域[2-3]。柚子屬于藥食兩用水果,性寒,味清香、酸爽,含有黃酮、多酚、果膠、膳食纖維、多糖、有機酸、維生素和微量礦物元素等多種有益成分[4-6],其中,柚子皮中含有以柚皮苷和橙皮苷為主要物質的黃酮類化合物[7-9],具有理氣消痰、健胃消食、預防動脈硬化、降血脂、抗氧化等功效[10-12]。我國柚子產量高,資源豐富[13],而柚子皮的重量占整個果實的30%～50%[14-15],可見,對柚子皮的綜合利用與開發是十分必要的。

目前,柚子皮中總黃酮的提取方法多采用溶劑浸提取法、堿提酸沉法、超聲波提取法、微波提取法等[16],例如:何穎[17]采用50%乙醇溶液提取總黃酮得率為0.625%;鄭培君等[18]采用80%乙醇溶液結合三因素三水平的響應面分析方法提取總黃酮的得率為0.864%;李敏等[19]采用乙醇浸提超聲波輔助提取總黃酮的得率為0.6225%。超聲波提取法是利用其產生的空化作用有效地破壞組織的細胞壁,使胞內的活性成分更好地流出到溶劑中,從而達到提高提取率的效果[20]。酶解提取法是利用具有專一性和高效性的酶來分解破壞植物細胞壁和細胞間質等組織結構,使細胞內活性成分更易溶出與擴散,從而提高提取效率[21]。酶法超聲波輔助提取法能有效結合酶解提取法和超聲提取法的優點,能協同有效地提高提取效率,用時短,應用性強[22],但以酶法結合超聲波輔助提取柚子皮中總黃酮的方法尚未見報道。

本研究以酶法超聲波輔助提取柚子皮中總黃酮,在單因素實驗的基礎,運用Plackett-Burnman試驗設計與數據分析篩選出顯著性影響要素因子,進一步采用Box-Behnken試驗設計優化了柚子皮中的總黃酮提取條件,可為后續研究提供數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柚子 產自江西廣豐的馬家柚;纖維素酶(2萬U/g)、果膠酶(3萬U/g) 北京索萊寶科技有限公司;蘆丁標準品(HPLC≥98%) 合肥博美生物科技有限責任公司;Al(NO3)3、NaOH、NaNO2、乙醇 均為分析純,北京索萊寶科技有限公司;去離子水 實驗室自制;其他試劑 均為分析純。

XA-1型固體樣品粉碎機 常州市金壇區環宇科學儀器廠;HWS-24型恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司;DSA300-XN2型超聲波儀 福州德森精工有限公司;FA6103C型電子天平 上海精科天美有限公司;3K15型冷凍離心機 Sigma;DZF6020型電熱鼓風干燥箱 無錫萊蒲儀器設備有限公司;PHSJ-4F型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;TU-1900型分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 柚子皮的預處理 將新鮮廣豐馬家柚剝下的皮切成5 cm2碎塊,在60 ℃下干燥24 h,粉碎后過60目篩,將制備好的柚子粉末放入干燥器中密封備用。

1.2.2 柚子皮中總黃酮提取工藝 稱取5 g處理好的柚子皮粉末置于500 mL錐形瓶中,以一定的料液比添加濃度為80%的乙醇溶液浸泡12 h,根據柚子皮的質量比例加入一定量的復合酶(纖維素酶和果膠酶),在一定的pH和溫度下進行水浴酶解(30 min混勻一次)后,100 ℃水浴滅酶活5 min。然后,再加入100 mL濃度為80%的乙醇溶液,在一定的超聲功率、超聲溫度和超聲時間下對上述酶解液進行超聲處理,最后對超聲處理的樣品溶液離心后取上清液。

1.2.3 單因素實驗 以復合酶的配比、復合酶的用量、pH、料液比、酶解溫度、酶解時間、超聲功率、超聲時間為要素因子,研究各要素因子對柚子皮中總黃酮得率的影響。

1.2.3.1 復合酶的配比 按照“1.2.2”的方法,固定料液比為1∶20,復合酶的用量為1.0%，pH4.0,酶解溫度為50 ℃,酶解時間為90 min,超聲功率為220 W,超聲時間為60 min,考察纖維素酶與果膠酶的配比(1∶3、2∶3、1∶1、3∶2、3∶1 g/g)對柚子皮中總黃酮得率的影響。

1.2.3.2 復合酶的用量 在上述優化復合酶的配比的基礎上,固定料液比為1∶20,pH4.0,酶解溫度為50 ℃,酶解時間為90 min,超聲功率220 W,超聲時間為60 min,考察復合酶的用量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)對柚子皮中總黃酮得率的影響。

1.2.3.3 pH 在上述優化的復合酶的配比和復合酶的用量的基礎上,固定料液比為1∶20,酶解溫度50 ℃,酶解時間為90 min,超聲功率220 W,超聲時間為60 min,考察pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0)對柚子皮中總黃酮得率的影響。

1.2.3.4 料液比 在上述優化的復合酶的配比、復合酶的用量和pH的基礎上,固定酶解溫度為50 ℃,酶解時間為90 min,超聲功率220 W,超聲時間為60 min,考察料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)對柚子皮中總黃酮得率的影響。

1.2.3.5 酶解溫度 在上述優化的復合酶的配比、復合酶的用量、pH和料液比的基礎上,固定酶解時間為90 min,超聲功率為220 W,超聲時間為60 min,考察酶解溫度(30、40、50、60、70 ℃)對柚子皮中總黃酮得率的影響。

1.2.3.6 酶解時間 在上述優化的復合酶的配比、復合酶的用量、pH、料液比和酶解溫度的基礎上,固定超聲功率為220 W,超聲時間為60 min,考察酶解時間(30、45、60、75、90 min)對柚子皮中總黃酮得率的影響。

1.2.3.7 超聲功率 在上述優化的復合酶的配比、復合酶的用量、pH、料液比、酶解溫度和酶解時間的基礎上,固定超聲時間為60 min,考察超聲功率(100、140、180、220、260 W)對柚子皮中總黃酮得率的影響。

1.2.3.8 超聲時間 在上述優化的復合酶的配比、復合酶的用量、pH、料液比、酶解溫度、酶解時間和超聲功率的基礎上,考察超聲時間(10、20、30、40、50、60 min)對柚子皮中總黃酮得率的影響。

1.2.4 Plackett-Burman試驗設計 當實驗中要素因子較多時,可選用Plackett-Burman試驗設計,可通過分析比較各因素效應值及其顯著性,篩選出有顯著影響的因素[23-24]。以柚子皮中的總黃酮得率為響應值,單因素實驗為基礎,選取復合酶的配比(纖維素酶∶果膠酶)、復合酶的用量、pH、料液比、酶解溫度、酶解時間、超聲功率、超聲時間共8個因素的水平值,選用Plackett-Burman試驗設計來確定顯著性影響因素,為進一步的Box-Behnken試驗奠定基礎。試驗設計因素及水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素及水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman

1.2.5 響應面試驗 在Plackett-Burman試驗基礎上,以復合酶的用量、酶解溫度、超聲功率和超聲時間為自變量,以柚子皮中總黃酮得率為響應值,設計響應面試驗,確定最佳實驗條件。Box-Behnken試驗設計見表2。

表2 Box-Behnken試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of Box-Behnken test

1.2.6 總黃酮得率的測定

1.2.6.1 吸收波長的選擇 分別取蘆丁標準品溶液和柚子皮提取液,以乙醇溶液為空白對照,紫外分光光度計在200～600 nm波長范圍內進行掃描,結果表明,蘆丁標準品和柚子皮提取液在510 nm波長下均有最大吸收,由此確定510 nm為檢測波長。

1.2.6.2 蘆丁標準曲線的的繪制 參考趙國超、鄭麗等的方法[25-26],稍加修改。精確稱取20 mg蘆丁標準樣品放于10 mL容量瓶中,濃度為80%的乙醇定容后搖勻,獲得質量濃度為2.0 mg/mL 的蘆丁標準溶液。六支10 mL具塞管中分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL蘆丁標準溶液,各管中再分別加入80%的乙醇3.0 mL和5% 的NaNO2溶液0.5 mL,搖勻后靜置10 min;然后各管中分別加入14% Al(NO3)3溶液0.5 mL,搖勻后靜置10 min;各管中再加入4% NaOH溶液3.0 mL;最后用80%乙醇定容至10.0 mL,搖勻后靜置8 min。510 nm波長下測吸光度值,同時做空白對照,經計算線性回歸方程為:y=0.8058x+0.0224,R2=0.9992,其中y為吸光度,x為蘆丁質量濃度(mg/mL),根據試驗結果,蘆丁在0.1～0.6 mg/mL濃度范圍內與吸光度有良好的線性關系。

1.2.6.3 總黃酮得率的計算 將1.2.2獲得的上清液液定容到200 mL,取1 mL置于10 mL具塞管中,按“1.2.6.2”方法測得吸光度值,將其代入“1.2.6.2”回歸方程中計算柚子皮總黃酮提取液的質量濃度。總黃酮得率的計算公式如下:

式中:C為柚子皮總黃酮提取液的質量濃度(mg/mL);V為樣品定容體積(mL);N為測定時樣液的稀釋倍數;M為浸提用的柚子皮粉末的質量(g)。

1.3 數據處理

所有試驗均重復3次,結果取平均值并計算標準誤差,運用Excel軟件繪制趨勢曲線圖。采用JMP Trial 14軟件進行Plackett-Burman試驗設計及數據處理,用Design-Expert 7.0軟件進行Box-Behnken試驗設計及數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 復合酶的配比對柚子皮中總黃酮得率的影響 由圖1可知,柚子皮中總黃酮得率隨著纖維素酶添加比例的增加,呈現先增加后減少的趨勢,當纖維素酶和果膠酶的配比為3∶2時,總黃酮得率達最大值為0.86%,纖維素酶添加比例繼續增加時,總黃酮得率呈下降趨勢。可能是隨著纖維素酶的比例增加,能更好地破壞柚子皮的細胞壁及細胞間質,使得細胞中的總黃酮等活性成分更好地溶出,但隨著纖維素酶比例的增加,底物濃度不能對復合酶達到飽和,復合酶的作用受到抑制,導致柚子皮總黃酮得率并沒有增加。所以,選擇纖維素酶和果膠酶的配比為3∶2。

圖1 復合酶的配比對總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of complex enzyme ratio on the yield of total flavonoids

2.1.2 復合酶的用量對柚子皮中總黃酮得率的影響 由圖2可知,柚子皮中總黃酮得率隨著復合酶的用量的增加呈現先增加后減少的趨勢,當復合酶的用量達到1.5%時,總黃酮得率為最大值為1.02%。當復合酶的用量大于1.5%時,總黃酮得率呈現下降趨勢。可能是隨著復合酶用量的增加能更好地破壞細胞壁,有助于總黃酮的溶出,總黃酮得率逐漸增加;當復合酶的用量超過1.5%后,隨著復合酶的用量的增加,底物濃度不能使酶達到飽和,導致了酶的作用受到抑制,總黃酮得率不再增加[27]。所以,選擇復合酶的用量為1.5%。

圖2 復合酶的用量對總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of complex enzyme dosage on the yield of total flavonoids

2.1.3 pH對柚子皮中總黃酮得率的影響 實驗用纖維素酶的最適pH在4.0～6.5,果膠酶的最適pH在3.0～6.0之間。由圖3可知,在pH在3.0～5.0時,柚子皮中總黃酮得率隨著pH的增大,呈現先增加后減少的趨勢。當pH為4.5時,柚子皮中總黃酮得率達最大值為1.29%。pH為4.5時,纖維素酶和果膠酶的復合酶活力為最佳值,使得細胞壁及細胞間質破壞率高,總黃酮等活性成分能更好地溶出,總黃酮得率相對較大[28]。所以,選擇酶解時的pH為4.5。

圖3 pH對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of pH on the yield of total flavonoids

2.1.4 料液比對柚子皮中總黃酮得率的影響 由圖4可知,隨著料液比的增大,柚子皮中總黃酮得率呈現先增加而后平緩略有下降的趨勢。當料液比為1∶20 g/mL時,柚子皮中總黃酮得率達最大值為1.24%。可能是隨著料液比的增大,一方面溶劑量逐漸增加,總黃酮溶出逐漸增加,另一方面酶與底物反應更充分,酶解效果較好,總黃酮得率逐漸增加;當料液比超過1∶20 g/mL后,繼續增加料液比,相對于稀釋了酶與底物的濃度,酶解的效果變差,導致總黃酮得率略有下降[29]。所以,選擇料液比為1∶20 g/mL。

圖4 料液比對總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of material/liquid ratio on the yield of total flavonoids

2.1.5 酶解溫度對柚子皮中總黃酮得率的影響 由圖5可知,隨酶解溫度的升高,柚子皮中總黃酮得率呈現先增加后明顯減少的趨勢。當酶解溫度為50 ℃時,總黃酮得率達最大值為1.25%。可能是隨著溫度的增加,復合酶的活性逐漸升高,酶與底物反應速率逐漸增加,總黃酮得率逐漸增加;當酶解溫度超過50 ℃后,纖維素酶和果膠酶的復合酶活力有所降低,酶解效率降低,導致總黃酮得率有明顯減少的趨勢。所以,選擇酶解溫度為50 ℃。

圖5 酶解溫度對總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of total flavonoids

2.1.6 酶解時間對柚子皮中總黃酮得率的影響 由圖6可知,柚子皮中總黃酮得率隨著酶解時間的延長,呈現先增加后緩慢減少的趨勢。當酶解時間為60 min時,總黃酮得率達最大值為1.46%。分析原因,可能是隨著酶解時間的增加,酶活力得到充分的利用,酶解反應更完全,總黃酮溶出增加,總黃酮得率逐漸增加;當酶解時間超過60 min后繼續酶解,不但不會提高提取效率,可能還會導致黃酮類物質遭到破壞[30]。所以,選擇酶解時間為60 min。

圖6 酶解時間對總黃酮得率的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of total flavonoids

2.1.7 超聲功率對柚子皮中總黃酮得率的影響 由圖7可知,柚子皮中總黃酮得率隨著超聲功率的增大,呈現先增加而后減少的趨勢。當超聲功率為180 W時,柚子皮中總黃酮得率達最大值為1.62%。可能是隨著超聲功率逐漸增加,物料底物能充分地受到超聲波的作用,總黃酮得率逐漸增加;當超聲功率超過180 W后,繼續增大超聲功率,會顯著破壞總黃酮的結構,導致總黃酮得率的減少[31]。所以,選擇超聲功率為180 W。

圖7 超聲功率對總黃酮得率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power on the yield of total flavonoids

2.1.8 超聲時間對柚子皮中總黃酮得率的影響 由圖8可知,柚子皮中總黃酮得率隨著超聲時間的延長,呈現先增加后減少的趨勢。當超聲時間為40 min時,柚子皮中總黃酮得率達最大值為2.07%。可能是隨著超聲時間的增加,能更好地破壞細胞壁,使得細胞內容物總黃酮溶出增加,總黃酮得率逐漸增加;當超聲時間達到一定值后繼續增加,超聲會破壞總黃酮等物質的結構,選用JMP軟件對表3中的實驗數據進行回歸分析和顯著性檢驗,結果見表4和表5。由表4可知,該模型(P<0.01)極顯著。由表5可知,因素X2(復合酶的用量)、X5(酶解溫度)、X8(超聲時間)對柚子皮中總黃酮得率影響極顯著(P<0.01);因素X7(超聲功率)對柚子皮中總黃酮得率影響顯著(P<0.05),所以選擇X2、X5、X8、X7共4個因素進行響應面優化試驗。因素X3(pH)、X4(料液比)、X1(復合酶的配比)和X6(酶解時間)對柚子皮中總黃酮得率影響不顯著,所以在后續優化試驗中X3、X4、X1和X6共4個因素的條件固定為:pH4.5、料液比1∶20 g/mL、復合酶的配比3∶2、酶解時間60 min。

表3 Plackett-Burman設計的各因素水平及響應值Table 3 Levels of various factors and response results of Plackett-Burman design

表4 Plackett-Burman設計的方差分析表Table 4 Analysis of variance of Plackett-Burman design

表5 偏回歸系數及顯著性檢驗Table 5 Partial regression coefficients and their significance test

圖8 超聲時間對總黃酮得率的影響Fig.8 Effect of ultrasonic time on the yield of total flavonoids

2.2 Plackett-Burman試驗結果

Plackett-Burman試驗設計及響應值見表3,方差分析結果見表4,偏回歸系數及顯著性檢驗見表5。

2.3 響應面試驗結果

響應面試驗設計及結果見表6。表6中的實驗數據經Design-Expert 7.0軟件處理,得到回歸模型的方差分析,結果見表7。經非線性回歸的二次多項式擬合,得到預測模型如下:

表6 響應面試驗設計及結果Table 6 Design and results for response surface experiment

Y=-10.3584+2.6902A+0.2420B+0.0182C+0.0931D-1.0003A2-0.0025B2-0.0001C2-0.0013D2+0.0095AB+0.0031AC-0.0080A D-0.00002BC+0.0004BD+0.00005CD

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

響應面可以反映因素之間的影響程度,其中影響越大,曲面越陡峭[33]。圖9反映了四個因素的交互作用對柚子皮中總黃酮得率的影響。可見,復合酶的用量與超聲功率的交互作用對柚子皮中總黃酮得率的影響顯著(P<0.05);復合酶的用量與酶解溫度、復合酶的用量與超聲時間、酶解溫度與超聲功率、酶解溫度與超聲時間和超聲功率與超聲時間的交互作用對柚子皮中總黃酮得率的影響不顯著(P>0.05)。根據對柚子皮中總黃酮得率的二次多項回歸方程求解,得到最佳提取工藝條件為:復合酶的用量1.73%、酶解溫度54.98 ℃、超聲功率183.43 W,超聲時間41.37 min,在此最佳條件下,總黃酮得率理論上可達2.22%。

圖9 交互項對總黃酮得率影響的響應面Fig.9 Response surface showing the effect of interaction terms on the yield of total flavonoids

考慮實驗可操作性,修正最佳的提取工藝條件為:復合酶的用量1.70%、酶解溫度55.0 ℃、超聲功率183.00 W,超聲時間41.00 min,在此條件下,3次平行試驗后,實測總黃酮得率的平均值為 2.19%,與模型預測值的相對誤差為 1.4%,表明該模型擬合程度較好,驗證了該模型的可靠性。

3 結論

本研究首次采用酶法結合超聲波輔助提取方法,應用于柚子皮中總黃酮的提取工藝中。首先,基于單因素實驗結果,運用Plackett-Burman試驗篩選出了具有顯著影響的因素,再進一步用Box-Behnken試驗設計優化了具有顯著性影響的因素,最終確定最佳的提取工藝條件為:復合酶的配比(纖維素酶∶果膠酶)為3∶2、復合酶的用量1.70%、pH4.5、料液比1∶20 g/mL、酶解溫度55.0 ℃、酶解時間60 min、超聲功率183.00 W、超聲時間41.00 min。在此條件下,進行3次平行試驗后實測柚子皮中總黃酮得率的平均值為2.19%。本實驗得到的總黃酮得率與何穎[24]、鄭培君等[11]和李敏等[29]相比分別提高了2.5倍、1.53倍和2.51倍,本方法提取效率相對較高。可見,酶法-超聲波輔助提取方法應用于柚子皮中總黃酮的提取中效果較好,工藝簡單,復制性強,可為進一步的實驗研究奠定基礎。