菟絲子總黃酮提取工藝及其抗氧化活性

秦晶晶,錢慧琴,魏 婧,高 利,袁鐵峰,閆福林

(新鄉醫學院三全學院,河南新鄉 453200)

菟絲子為旋花科植物南方菟絲子(CuscutaaustralisR. Br.)或菟絲子(CuscutachinesisLam.)的干燥成熟種子[1]。中藥菟絲子始載于《神農本草經》,并列為上品,其味甘性溫,歸肝、腎、脾經,具有補腎益精、止瀉安胎、養肝明目之功效,是中醫壯陽、補腎、固精之要藥[2-3]。研究發現,菟絲子的主要有效成分為黃酮類、多糖、木脂素等,其中黃酮類成分具有抗氧化、清除自由基、抗癌防癌、改善心腦血管循環和調節血壓等作用[4-7],具有很高的營養保健價值。

目前對菟絲子總黃酮提取的研究有一些報道,一般采用回流提取法、超聲提取法、冷浸法、超聲波協同復合酶等方法提取菟絲子中總黃酮[8-11],秦晶晶等[6]比較回流提取法、超聲提取法、冷浸法、微波輔助提取法和索氏提取法提取菟絲子中總黃酮得率,發現得率由高到低依次為:回流提取法、微波輔助萃取法、索氏提取法、超聲提取法、冷浸法。回流提取方法具有簡便易行、溶劑可回收利用、經濟節約、提取率高的優點。但響應面曲法優化菟絲子中總黃酮回流提取工藝及其體外抗氧化性研究未見文獻報道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菟絲子 安徽亳州市藥材總公司提供,新鄉醫學院藥學院中藥學教研室鑒定為旋花科植物(CuscutaaustralisR. Br.)的干燥成熟種子;蘆丁對照品 購自中國食品藥品檢定研究院(批號:100080-201408);1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH) 購自東京化成工業株式會社(CAS:1898-66-4);95%乙醇、NaNO2、FeSO4、焦性沒食子酸等試劑均為分析純 購于天津市德恩化學試劑有限公司。

電子分析天平 上海象平儀器儀表有限公司;SG-4054型數控精密恒溫水浴鍋 上海碩光電子科技有限公司;KQ5200DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;R206型旋轉蒸發儀 上海申生科技有限公司;SHZ-3型循環水式真空泵 鄭州杜甫儀器廠;101-8型電熱鼓風恒溫干燥箱 江蘇金壇市佳美儀器有限公司;T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菟絲子總黃酮的提取 菟絲子在60 ℃恒溫干燥箱中干燥6 h,烘至恒重,粉碎,過40目篩,得菟絲子粉;稱取0.1 g菟絲子粉置于圓底燒瓶中,在一定的提取溫度、乙醇液料比、乙醇濃度和提取時間的條件下進行總黃酮的回流提取,然后將得到的提取液抽濾,定容至25 mL容量瓶,備用。

1.2.2 總黃酮的測定

1.2.2.1 蘆丁標準曲線的繪制 精密稱取蘆丁對照品25 mg,置于50 mL容量瓶中,加入少量95%乙醇溶解并定容至刻度,搖勻即得蘆丁對照品溶液(5 mg/mL)。精密吸取蘆丁對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL,分別置于10 mL具塞試管中,各加水至5.0 mL,分別加入5%亞硝酸鈉0.6 mL,搖勻,放6 min,加入10%硝酸鋁0.6 mL,搖勻后放置6 min,加入4% NaOH 3.0 mL,加水至刻度,搖勻后放置15 min。于506 nm波長處測定吸收度A[9],以蘆丁濃度C(μg/mL)為橫坐標,吸收度A為縱坐標,繪制標準曲線,y=0.0107x+0.0254,R2=0.9997。

1.2.2.2 菟絲子總黃酮的測定 準確量取樣品溶液0.8 mL于10 mL比色管中,按照“1.2.2.1”中所述方法進行操作,按下式計算黃酮得率。

式中:W表示黃酮得率,mg/g;c表示根據吸光度值計算出的溶液質量濃度,mg/mL;D表示溶液稀釋倍數;m表示藥材取樣量,g。

1.2.3 單因素對黃酮提取量的影響 考察單因素乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%),提取溫度(50、60、70、80、90 ℃),料液比(1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 g/mL),提取時間(30、60、90、120、150 min)對黃酮提取量的影響,乙醇濃度、提取溫度、料液比和提取時間四個因素的固定水平分別為70%、70 ℃、1∶30 g/mL、60 min,在對各因素進行單因素實驗探究時,其他因素均取固定水平。

1.2.4 響應面實驗設計 在單因素實驗結果基礎上,按照Box-Benhnken中心組合實驗設計原理,采用Design-Expert 8.0.6軟件設計響應面實驗。本實驗以總黃酮提取量為響應值,選取乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、料液比(C)、提取時間(D)四因素三水平進行試驗設計,因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 菟絲子總黃酮體外抗氧化試驗

1.2.5.1 菟絲子總黃酮對DPPH自由基清除活性的測定 將最佳工藝條件下得到菟絲子總黃酮濃縮液為原料液,并加無水乙醇配制成質量濃度分別為0.03、0.06、0.08、0.10、0.14、0.20、0.24、0.26 mg/mL的樣品溶液。參考焦坤鵬等[17]的方法進行DPPH清除活性的測定,并以抗壞血酸作為參照比較效果,按以下公式計算清除率及IC50。

1.2.5.2 菟絲子總黃酮對羥自由基清除活性的測定 將最佳工藝條件下得到的菟絲子總黃酮濃縮液加無水乙醇配制成質量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.5、4.5、5.0 mg/mL的樣品溶液。參考文獻[18-20]進行羥自由基清除活性測定,同時與抗壞血酸對比,按以下公式計算清除率及IC50。

1.2.5.3 菟絲子總黃酮對超氧自由基清除活性的測定 將最佳工藝條件下得到的菟絲子總黃酮濃縮液為原料液,并加無水乙醇配制成質量濃度分別為0.01、0.03、0.06、0.08、0.10、0.14、0.20、0.24、0.26 mg/mL的樣品溶液。采用鄰苯三酚自氧化法,參考文獻[21-23]進行超氧自由基清除活性測定并與抗壞血酸作比較,按以下公式計算清除率及IC50。

1.3 數據統計分析

采用Microsoft Excel 2007、Design Expert 8.0.6軟件進行實驗數據處理、分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 不同乙醇濃度對菟絲子黃酮提取工藝的影響 由圖1可知，當乙醇濃度為50%～80%時,所提取黃酮質量隨著乙醇濃度增大而增加,當乙醇濃度達到80%時,黃酮得率最高,為23.36 mg/g。而當乙醇濃度大于80%時,黃酮得率反而減小,這可能因為當乙醇濃度達到一定程度之后可能會影響黃酮類溶解性及其醇溶性雜質、色素增多,這些雜質會與黃酮競爭溶劑,導致黃酮類化合物的溶解度降低。因此,選擇乙醇濃度70%～90%進行響應面優化試驗。

圖1 不同乙醇濃度對菟絲子黃酮提取工藝影響Fig.1 The effects of different ethanol concentrations on extraction process of total flavonoids from Cuscuta chinesis

2.1.2 不同提取溫度對菟絲子黃酮提取工藝的影響 由圖2可知，當提取溫度為50～80 ℃時,菟絲子黃酮得率隨著提取溫度的升高而升高,當溫度達到80 ℃時,總黃酮得率達到最大,為26.82 mg/g。當提取溫度高于80 ℃,黃酮得率反而降低,這可能由于溫度升高導致分子運動增加,使黃酮與溶劑接觸增加,故黃酮得率增加,但溫度太高的話,會導致部分黃酮氧化,使黃酮得率降低。因此,選擇提取溫度70～90 ℃進行響應面優化試驗。

圖2 不同溫度對菟絲子黃酮提取工藝影響Fig.2 The effects of different extraction temperatures on extraction process of total flavonoids from Cuscuta chinesis

2.1.3 不同料液比對菟絲子黃酮提取工藝的影響 由圖3可知，隨著提取料液比的增加,菟絲子中總黃酮得率也增加,當料液比為1∶10 (g/mL)時,菟絲子總黃酮得率達到最大,為26.82 mg/g。再繼續加大提取料液比,菟絲子中總黃酮得率反而降低。其原因可能是在料液比為一個合適范圍時,隨料液比的增加會促進黃酮物質的溶出,而料液比過高時,會加大其他雜質的溶出或者部分黃酮類化合物與溶劑長時間接觸會導致結構破壞,使得黃酮得率降低。因此選擇料液比為1∶5～1∶15 (g/mL)進行響應面優化試驗。

圖3 不同料液比對菟絲子黃酮提取工藝影響Fig.3 The effects of different material-liquid ratios on extraction process of total flavonoids from Cuscuta chinesis

2.1.4 不同提取時間對菟絲子黃酮提取工藝的影響 由圖4可知:提取時間在30～90 min時,總黃酮得率隨著提取時間延長而明顯增加;提取時間為90 min時,總黃酮得率達到最大,為26.89 mg/g;提取時間超過90 min時,黃酮得率隨著時間的增加反而降低,這可能是由于乙醇具有揮發性,時間越久乙醇濃度越小,提取溶劑極性變大,導致一些極性小的黃酮類化合物析出來,從而使測得黃酮類化合物的含量偏低。因此選擇提取時間80～100 min進行響應面優化試驗。

圖4 不同提取時間對菟絲子黃酮提取工藝影響Fig.4 The effects of different extraction time on extraction process of total flavonoids from Cuscuta chinesis

2.2 Box-Behnken響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面回歸模型建立與分析 采用Box-Behnken 的中心組合原理為依據,以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)、提取(D)為自變量,總黃酮得率為因變量,采用4因素3水平響應面優化提取工藝,利用統計學分析軟件Design Expert 8.0.6軟件建立數字回歸模型,確定菟絲子總黃酮最佳提取工藝條件,結果見表2。利用軟件對試驗結果進行二次多項式回歸模型方程擬合,獲得的回歸模型方程如下:

表2 響應面實驗結果及分析Table 2 Results and analysis of response surface experiment

Y=17.24-0.72+3.66B+2.52C-0.54D+3.57AB-2.78AC-1.89AD-1.33BC+0.81BD-1.39CD+2.92A2+1.06B2+3.08C2+2.68D2

由4個影響因素的F值大小可以得出,各因素對菟絲子總黃酮得率的影響順序為提取溫度>料液比>乙醇濃度>提取時間,提取溫度對菟絲子總黃酮得率有較大影響。模型一次項D與交互項BD差異不顯著(P>0. 05)；一次項B、C,交互項AB、AC、AD以及二次項A2、C2、D2對菟絲子總黃酮得率均有極顯著的影響(P<0.01)；一次項A，交互項BC、CD，二次項B2具有顯著的影響(P<0.05)。

2.2.2 響應面交互作用分析與優化 響應曲面坡度越陡峭,說明響應值對于該因素的改變越敏感,而曲面坡度越平滑,該因素的改變對響應值的影響也就越小,各因素交互作用對菟絲子中總黃酮得率影響的響應曲面以及等高線如圖5所示。在有交互作用的影響下,乙醇濃度和料液比，乙醇濃度和提取時間，乙醇濃度和提取溫度,料液比和提取溫度，提取時間和提取溫度其曲線比較陡,表明該因素對菟絲子總黃酮的提取的交互影響作用顯著,而料液比和提取時間、交互影響作用不顯著,這與表3中交互項值的分析一致。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

圖5 各因素交互作用總黃酮得率的響應面與等高線圖Fig.5 Response surface plot showing the interactive effects of total flavonoids

2.3 最佳提取條件的確定及驗證

通過軟件對二次多項式回歸方程進行分析預測,乙醇回流提取菟絲子總黃酮的最佳提取工藝條件:乙醇濃度為90.0%,提取溫度為70.41 ℃,提取時間為99.83 min,料液比為 1∶14.99 (g/mL)。綜合考慮將其最佳工藝條件調整為乙醇濃度90%,提取溫度為70 ℃,提取時間為100 min,料液比為 1∶15 g/mL,以此條件下對建立的數學模型進行驗證試驗,結果見表4。獲得的菟絲子總黃酮得率的實際測得值為(34.65±0.02) mg/g,預測值為34.37 mg/g,預測誤差為0.81%,小于3%,因此,證實了預測值的準確可靠。

表4 最優條件的預測值和實測值(n=3)Table 4 The predicted value and measured value of the optimal conditions(n=3)

2.4 菟絲子總黃酮體外抗氧化活性

2.4.1 菟絲子總黃酮對 DPPH·清除作用 由圖6可知,在選定濃度0.03～0.20 mg/mL范圍內其清除能力隨總黃酮濃度的提高而增強,當濃度增加為0.24 mg/mL,清除率達到98.68%,此后其清除率基本趨于平衡。根據SPSS 20.0軟件數據分析,得到菟絲子總黃酮IC50=0.067 mg/mL和抗壞血酸的IC50=0.082 mg/mL,這說明在相同濃度下,菟絲子總黃酮對DPPH·清除率略高于抗壞血酸。

圖6 不同濃度的菟絲子總黃酮和抗壞血酸對DPPH的清除率Fig.6 DPPH· scavenging activities of different concentrations of ascorbic acid and total flavonoids

2.4.2 菟絲子總黃酮對·OH的清除作用 由圖7可知,在選定濃度0.5～5.0 mg/mL范圍內其清除能力隨總黃酮濃度的提高而增強,當濃度增加為4.5 mg/mL,清除率達到40.42%,此后其清除率增加不明顯,基本趨于平衡。根據SPSS 20.0軟件數據分析,得到菟絲子總黃酮IC50=7.209 mg/mL和抗壞血酸的IC50=1.731 mg/mL,這說明在相同濃度下,菟絲子總黃酮對·OH清除率比抗壞血酸弱。

圖7 不同濃度的菟絲子總黃酮和抗壞血酸對·OH的清除率Fig.7 ·OH scavenging activities of different concentrations of ascorbic acid and total flavonoids

圖8 不同濃度的菟絲子總黃酮和抗壞血酸對的清除率 scavenging activities of different concentrations of ascorbic acid and total flavonoids

3 結論

本文通過回流提取法提取菟絲子中總黃酮,在單因素實驗的基礎上,利用響應曲面法對菟絲子總黃酮提取工藝進行優化,實驗獲得的最佳提取工藝條件為:乙醇濃度為90%,提取溫度為70 ℃,提取時間為100 min,料液比為 1∶15 (g/mL),獲得的菟絲子總黃酮得率的實際測得值為(34.65±0.02) mg/g,預測值為34.65 mg/g,預測誤差為0.81%,說明采用Box-Behnken方法優化提取總黃酮工藝行之有效,為以后菟絲子總黃酮的產業化提供指導。

體外抗氧化活性研究表明,菟絲子總黃酮對 DPPH·、羥自由基和超氧陰離子自由基的IC50值分別為:0.067、7.209、0.119 mg/mL,具有較強的體外抗氧化活性,為其在食品、藥品等領域開發天然抗氧化劑提供一定的理論依據。