牛磺酸薄荷復合運動飲料研制及其體外抗氧化活性

(鄭州工商學院,河南鄭州 451400)

人體在運動時,易產生疲勞狀態,使得機體內氧化還原平衡被破壞,生成的過量自由基容易造成組織損傷,進而引發一系列疾病。運動飲料因具有較好的抗氧化作用,可為疲勞機體快速補充水分、電解質與能量,因此被大量研究[1-2]。牛磺酸作為非蛋白質氨基酸,具有促進營養物質代謝、提高機體生理功能與免疫的能力,特別是其在增強心肌收縮力,維持機體運動的同時,還可防止心肌受損、保護肝臟,因而在運動飲料成分中充當“主要角色”,并在食品添加劑中大量應用[3-4]。然而牛磺酸的使用成本逐年遞增,如何在減少運動飲料中牛磺酸用量的同時，維持相同的抗氧化作用效果的相關研究具有重大意義。

薄荷,唇形科薄荷屬草本植物,富含黃酮與迷迭香酸類化合物[5],She等[6]研究發現,水溶液分離出的酚酸類化合物具有較強的抗氧化活性,可以快速消除運動疲勞或損傷生成的氧自由基,抑制羥自由基誘導的脂質過氧化反應,保護生物膜結構與功能。本研究以牛磺酸與薄荷為原料,利用薄荷的藥食兩用特性與功效,減少牛磺酸在運動飲料的常規濃度,同時輔以白砂糖、黃原膠、羧甲基纖維素鈉與結冷膠,研制牛磺酸薄荷復合運動飲料,通過檢測其對羥自由基、超氧陰離子自由基與DPPH自由基的清除率,觀察其抗氧化作用效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛磺酸 潛江永安藥業股份有限公司;新鮮薄荷葉、白砂糖 某農貿市場;羧甲基纖維素鈉 武漢艾諾森生物科技有限公司;黃原膠 濟南意和旺化工科技有限公司;結冷膠 湖南億全生物科技有限公司;硫酸亞鐵、無水乙醇、雙氧水、磷酸氫鈉、磷酸氫二鈉 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;水楊酸、甲硫氨酸、核黃素 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氮鹽四唑(NBT)、DPPH自由基 美國Sigma公司;HN功能飲料 市售;試驗用水 超純水。

TP-A200電子天平 長沙明杰儀器有限公司;UV-7504紫外可見分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司;高壓均質機 上海諾尼輕工機械有限公司;BW4T150Q灌裝機 浙江博煒食品機械有限公司;FZG-20干熱滅菌柜 南京煜鑫機械科技有限公司;KQ500DB超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;H1-16K離心機 湖南可成儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 復合飲料工藝流程圖[7]如圖1所示。

圖1 復合飲料工藝流程圖Fig.1 The technological process of mixed sports beverage

1.2.2 工藝要點

1.2.2.1 薄荷液制備 定量稱取薄荷葉,洗凈后粉碎,加入一定體積的純化水,在溫度50 ℃,功率400 W條件下超聲提取30 min后,以4000 r/min速率離心10 min,即得薄荷液[8]。

1.2.2.2 調配 薄荷液、牛磺酸、白砂糖以一定比例在水中混合成原料液后,加入復合穩定劑(黃原膠、羧甲基纖維素鈉與結冷膠按一定配比制得的溶液),調配至成品。

1.2.2.3 均質、灌裝與滅菌 成品料液均質攪拌2次后灌裝,于121 ℃滅菌10 min,冷卻后制得運動飲料[9]。

1.2.3 復合飲料配方優化

1.2.3.1 單因素試驗設計 在薄荷液8%、白砂糖4%條件下,考察牛磺酸用量(0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%)對感官評價的影響;在牛磺酸0.03%、白砂糖4%條件下,考察薄荷液用量(2%、4%、6%、8%、10%)對感官評價的影響;在牛磺酸0.03%、薄荷液8%條件下,考察白砂糖用量(2%、3%、4%、5%、6%)對感官評價的影響。在上述單因素實驗中,固定復合穩定劑添加量為黃原膠0.15%、羧甲基纖維素鈉0.30%、結冷膠0.08%。

1.2.3.2 正交試驗設計 在單因素實驗基礎上,以牛磺酸(A)、薄荷液(B)、白砂糖(C)用量為考察因素,進行三因素三水平的正交試驗,具體因素水平見表1所示。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.3.3 感官評價 參考口服飲料感官評價標準[10],制定牛磺酸薄荷復合運動飲料感官評價標準,見表2所示,聘請具有飲料感官評價經驗的10位食品工作者,分別按照色澤、氣味、口感與組織形態四個維度,對不同配方參數制得的運動飲料進行評價,每個樣品重復3次,取平均值。

表2 牛磺酸薄荷復合運動飲料感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria of taurine and mint mixed sports beverage

2.4 復合穩定劑配比設計

1.2.4.1 單因素實驗設計 在羧甲基纖維素鈉0.30%、結冷膠0.08%條件下,考察黃原膠用量(0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%)對離心沉淀率的影響;在黃原膠0.15%、結冷膠0.08%條件下,考察羧甲基纖維素鈉用量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)對離心沉淀率的影響;在黃原膠0.15%、羧甲基纖維素鈉0.30%條件下,考察結冷膠用量(0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%)對離心沉淀率的影響。在上述單因素實驗中,固定原料液配比為牛磺酸0.03%、薄荷液8%、白砂糖4%。

1.2.4.2 響應面優化設計 在單因素實驗基礎上,以黃原膠(A)、羧甲基纖維素鈉(B)、結冷膠(C)用量為響應因素,離心沉淀率為響應值(Y),設計三因素三水平響應面試驗,利用Design-Expert軟件的Box-Behnken試驗設計原理,優化復合穩定劑配比,試驗因素水平見表3所示。

表3 響應面試驗因素水平表Table 3 Factors and levels in response surface experiment

1.2.4.3 離心沉淀率測定 以離心沉淀率衡量運動飲料的穩定性,離心沉淀率越大,則溶液穩定性越差。稱取復合飲料m0,置于離心管中,以3000 r/min,離心10 min后,對管內上清液稱重，記為m,按照下式計算溶液的離心沉淀率,平行測定三次[11]。

式(1)

式中:w為溶液離心沉淀率,%;m0為復合飲料初始質量,g;m為離心后上清液質量,g。

1.2.5 貯藏穩定性研究 灌裝滅菌后的產品分別置于37 ℃恒溫培養箱和4 ℃冰箱存放6個月,觀察有無明顯沉淀與分層。

1.2.6 自由基清除率測定

1.2.6.1 羥自由基清除率 準確移取2 mL復合飲料于試管內,另加入2 mL硫酸亞鐵(9 mmol/L)和2 mL水楊酸(9 mmol/L)搖勻,隨后加入2 mL雙氧水(20 mmol/L)混合搖勻后,于37 ℃水浴加熱30 min,以純化水作空白對照,于510 nm波長處測定吸光度,平行測定六次,按照下式計算清除率[12]。

式(2)

式中,A1為樣品測定吸光度值;A2為以水替代雙氧水溶液時樣品的吸光度值;A0為以水替代樣品時空白對照的吸光度值;w為羥自由基清除率,%。

1.2.6.2 超氧陰離子自由基清除率 準確移取1 mL復合飲料于試管內,依次加入0.5 mL磷酸緩沖鹽溶液,1.5 mL 甲硫氨酸(0.026 mol/L),0.5 mL NBT(0.08 mol/L)和0.3 mL核黃素(0.02 mol/L),搖勻后,光照30 min,以純化水作空白對照,于560 nm波長處測定吸光度,平行測定六次,按照公式2計算清除率[13]。

1.2.6.3 DPPH自由基清除率 準確移取2 mL復合飲料于試管內,加入2 mL DPPH自由基乙醇溶液(0.2 mol/L),搖勻后,避光30 min,以無水乙醇作空白對照,于517 nm波長處測定吸光度,平行測定六次,按照下式計算清除率[14]。

式(3)

式中,A1為樣品測定吸光度值;A2為以水替代DPPH乙醇溶液時樣品的吸光度值;A0為以水替代樣品時空白對照的吸光度值;w為DPPH自由基清除率,%。

1.3 數據處理

復合飲料抗氧化性檢測結果采用均數、標準差描述,利用SPSS 19.0進行方差分析,當P<0.05表示具有顯著性差異,P<0.01表示具有極顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 復合運動飲料原料液配比優化

2.1.1 單因素實驗結果

2.1.1.1 牛磺酸用量影響 不同牛磺酸用量對運動飲料的感官評價影響見圖2所示。從圖2可知,當牛磺酸用量在0.03%時,感官評價得分最高為(83.7±0.9)分,此時溶液呈淡黃色,酸甜適中,而濃度較高時,溶液顏色加深,混濁感較明顯,因此本研究選擇牛磺酸用量0.02%、0.03%、0.04%作為正交試驗考察水平。

圖2 牛磺酸用量對復合運動飲料感官影響Fig.2 Effect of taurine addition on sensory score of mixed sports beverage

2.1.1.2 薄荷液用量影響 不同薄荷液用量對運動飲料的感官評價影響見圖3所示。從圖3可知,隨著薄荷液用量增多,復合飲料感官評價結果先升高后降低,在8%時達到最高為(84.1±1.7)分。薄荷液濃度偏高時,溶液的清涼口感較重,掩蓋了其它成份味道,因此本研究選擇薄荷液用量7%、8%、9%作為正交試驗考察水平。

圖3 薄荷液用量對復合運動飲料感官影響Fig.3 Effect of mint liquid addition on sensory score of mixed sports beverage

2.1.1.3 白砂糖用量影響 運動飲料中添加白砂糖有利于調整口感,不同白砂糖用量對運動飲料的感官評價影響見圖4所示。從圖4可知,白砂糖用量4%時,感官評價得分最高為(84.3±0.8)分。當用量較低時,溶液甜味偏低,澀味較重,而用量較高時,飲料甜度偏大,影響自身風味[15-16],因此本研究選擇白砂糖用量3%、4%、5%作為正交試驗考察水平。

圖4 白砂糖用量對復合運動飲料感官影響Fig.4 Effect of white sugar addition on sensory score of mixed sports beverage

2.1.2 正交試驗 根據上述單因素實驗結果可知,牛磺酸、薄荷液與白砂糖用量對飲料的感官評價影響較大,但考慮單因素實驗結果并非最優值,因此設計以三者為變量的三因素三水平正交試驗,確定飲料原料液的最佳配比,試驗結果見表4所示。

從表4可知,RC>RB>RA,各因素對牛磺酸薄荷復合運動飲料的感官評價影響順序為:白砂糖用量>薄荷液用量>牛磺酸用量,通過極差分析可知,飲料原料液最佳配比為A2B1C1,即牛磺酸用量0.03%,薄荷液用量6%,白砂糖用量3%。在該配比下,運動飲料的感官評分為(87.3±0.9)分,此時溶液的薄荷氣味濃郁,色澤均勻、透亮,呈淺黃色,酸甜適中,具有清涼感,無明顯沉淀與分層。

表4 正交試驗結果Table 4 Results of the orthogonal test

2.2 復合穩定劑配比

2.2.1 單因素實驗結果

2.2.1.1 黃原膠用量影響 薄荷葉在超聲分離提取后,仍有部分纖維組織或大分子物質進入上清液,因此利用復合穩定劑提高溶液的穩定性。圖5為黃原膠用量對溶液離心沉淀率的影響,從圖5可知,隨著黃原膠用量的增多,離心沉淀率不斷減小,至0.15%后基本未變。這是因為黃原膠可吸附帶正電荷的蛋白質大分子,形成空間位阻,從而減少蛋白質沉淀[17],因此本研究選擇黃原膠用量0.10%、0.15%、0.20%作為響應面因素考察水平。

圖5 黃原膠用量對離心沉淀率的影響Fig.5 Effect of xanthan gum content on centrifugation sedimentation rate

2.2.1.2 羧甲基纖維素鈉用量影響 羧甲基纖維素鈉與黃原膠復配具有較好協同增效效果,聯合應用時可顯著增加飲料的穩定性[18]。從圖6可見,當用量為0.3%時,溶液沉淀離心率下降趨于穩定,因此本研究選擇羧甲基纖維素鈉用量0.2%、0.3%、0.4%作為響應面因素考察水平。

圖6 羧甲基纖維素鈉用量對離心沉淀率的影響Fig.6 Effect of carboxymethyl cellulose sodium content on centrifugation sedimentation rate

2.2.1.3 結冷膠用量影響 結冷膠可有效提高運動飲料的穩定性與懸浮能力[19-20],由圖7可知,隨著結冷膠用量增多,離心沉淀率逐漸下降,當用量增加至0.08%后,基本穩定,因此本研究選擇結冷膠用量0.07%、0.08%、0.09%作為響應面因素考察水平。

圖7 結冷膠用量對離心沉淀率的影響Fig.7 Effect of gellan gum content on centrifugation sedimentation rate

2.2.2 響應面優化

2.2.2.1 試驗結果 根據上述單因素實驗結果,以黃原膠、羧甲基纖維素鈉及結冷膠用量為響應面考察因素,進行三因素三水平響應面Box-Behnken試驗結果見表5所示。

表5 Box-Behnken試驗結果Table 5 Results of the response surface experiment

上述試驗結果進行多元回歸擬合,得到以離心沉淀率為目標函數,各參數編碼值的二次多項回歸方程:Y=1.14+0.024A-0.053B-0.061C+0.025AB+0.048AC+0.075BC+0.11A2-1.25×10-3B2+0.12C2,對該模型進行方差分析,結果見表6所示。

從表6可知,該回歸模型P<0. 01,表明該模型極顯著,可較好反映實際結果,R2=0.9409顯示該模型擬合值與實際結果具有高度相關性,而模型失擬項P=0.3383>0.05表示沒有顯著性差異。一次項B、交互項BC對離心沉淀率的影響顯著(P<0.05);一次項C,二次項A2、C2對離心沉淀率的影響極顯著(P<0.01)。從F值可知,各因素對離心沉淀率的影響程度順序依次為:C(結冷膠用量)>B(羧甲基纖維素鈉用量)>A(黃原膠用量)。

表6 響應面方差分析Table 6 Analysis of variance of response surface experiment

2.2.2.2 響應曲面分析 復合穩定劑中黃原膠、羧甲基纖維素鈉與結冷膠的交互作用及對離心沉淀率的影響見圖8所示。從圖8可知,穩定劑添加有利于該飲料的離心沉淀率下降,但下降至一定值后趨于增大,結冷膠與羧甲基纖維素鈉之間曲面坡度較大,等高線呈橢圓形，交互作用顯著。

圖8 不同穩定劑用量對離心沉淀率的響應曲面圖Fig.8 Response surface map of different components amounts on centrifugal sedimentation rate

2.2.2.3 驗證試驗 采用響應面法分析,確定飲料中復合穩定劑最佳配比參數為:黃原膠0.14%、羧甲基纖維素鈉0.40%、結冷膠0.08%,離心沉淀率最低預測值1.08%。在此條件下進行驗證試驗,測得飲料的實際沉淀率為1.05%±0.01%,與預測結果相近,飲料放置6個月后,見圖9所示,無明顯沉淀與分層。

圖9 不同貯藏條件的樣品穩定性比較Fig.9 Comparison of stability of samples in different storage conditions注:從左至右:0月樣品、4 ℃樣品、37 ℃樣品。

2.3 抗氧化性

利用自由基清除劑的體外模型研究方法[21-22],通過考察牛磺酸薄荷復合運動飲料(牛磺酸:0.03%)和HN飲料(牛磺酸:0.05%)對羥基自由基、超氧陰離子自由基與DPPH自由基的清除能力,來比較各自的抗氧化活性,結果見表7所示。從表7可見,牛磺酸薄荷復合運動飲料對羥基自由基的清除能力顯著低于HN飲料(P<0.05),而對其它兩種氧自由基的清除率,牛磺酸薄荷復合運動飲料均極顯著高于HN飲料(P<0.01),表明低于常規濃度的牛磺酸與薄荷組成的復合物有助于增強抗氧化活性。

表7 不同飲料對三種自由基清除率Table 7 The scavenging rates of different beverages against three kinds of oxygen radicals

3 結論

本研究以牛磺酸、薄荷為原料,輔以白砂糖、黃原膠、羧甲基纖維素鈉與結冷膠研制復合運動飲料。通過單因素與正交試驗確定飲料中原料液最佳配比參數為:牛磺酸0.03%、薄荷液6%、白砂糖3%、感官評價達到(87. 3±0.9)分;通過單因素與響應面分析試驗確定飲料中復合穩定劑的最佳配比參數為:黃原膠0.14%、羧甲基纖維素鈉0.40%、結冷膠0.08%,離心沉淀率為1.05%±0.01%。根據上述最佳配比參數制得的復合運動飲料的薄荷氣味濃郁,色澤均勻、透亮,呈淺黃色,酸甜適中,具有清涼感,無明顯沉淀與分層。該復合運動飲料在降低牛磺酸常規用量的同時,具有較好的抗氧化作用效果,對羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除率分別為42.76%、65.25%和57.46%,因而具有較好的推廣前景。