四種方法提取的黃花菜揮發性物質及殘渣結構分析

陸海勤1,陳淋轉1,張昆華1,李毅花1,楊日福2,李 文

(1.廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530004; 2.華南理工大學物理與光電學院,廣東廣州 510640; 3.廣西民族大學化學化工學院,廣西林產化學與工程重點實驗室,廣西南寧 530008)

黃花菜(HemerocaliscitrinaBaroni)又稱萱草、忘憂草,是一種多年生的單子葉草本植物,廣泛地分布在俄羅斯、蒙古、中國、韓國等地。黃花菜富含蛋白質、維生素和礦物質,具有清熱明目、抗菌消炎、鎮靜安眠、健腦抗衰、緩解抑郁、養血平肝和降血脂的功效,在我國作為食療食品已有3000多年的歷史。此外,黃花菜還可作為觀賞花卉,品種繁多,且具有獨特的香氣。已有研究表明,鮮黃菜花中的揮發性香氣成分有48種[1]。

植物有效成分傳統的提取方法主要有熱水提取法[2]、酸堿提取法[3]等,但耗時長,提取率低。目前植物有效成分的提取方法有酶輔助提取法[4]、超聲輔助提取法[5]、微波輔助提取法[6]、脈沖電場提取法[7]、超臨界流體萃取法[8]、超高壓提取法[9]等。不同輔助提取法的協同作用不僅可以結合多種提取方法的優點,而且可以彌補單種提取方法的不足,是目前植物提取的研究趨勢之一。常見的方法有微波輔助酶法[10]、超聲輔助酶法[11]、微波輔助亞臨界水法[12]、超聲強化亞臨界水法[13]等。超聲輔助和電場輔助是提取天然產物的有效手段,超聲波的空化效應、機械振動、微射流等多極效應,能夠破壞植物細胞的細胞壁,使有效物質易從原料中溶出[14-16],具有時間短、效率高等優點;電場輔助提取則是能夠使細胞膜變薄,加快細胞內容物的擴散,從而強化傳質,增大提取效率。將超聲場與高壓靜電場協同作用,可增加植物細胞的破碎率及提高提取物質的擴散速度,可進一步提高提取效率。

頂空固相微萃取(Headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)是一種快速、簡單、無需溶劑的吸附提取香氣物質的方法[17-18],在香氣分析中得到廣泛應用。如Ding X F等[19]用固相微萃取與氣相色譜-質譜聯用(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析濃香型白酒,瀘州酒在不同條件下的香氣成分。Lv H P[20]等利用固相萃取聯用氣相色譜-聞香器(Gas chromatography-olfactometry,GC-O)和GC-MS分析普洱茶的香氣活性成分。Kang K M等[17]用同步蒸餾萃取(Sync distillation and solvent extraction,SDE)、吹掃法與固相微萃取聯用GC-O分析韓國紅辣椒醬的香氣。

現階段關于超聲協同電場提取天然產物的文獻較少,本研究采用超聲協同高壓靜電場提取黃花菜提取液中的揮發性物質,對比研究黃花菜提取液在60 ℃水、超聲場、高壓靜電場不同的提取條件下揮發性物質的提取效果,采用HP-SPME聯用GC-MS檢測分析花黃菜提取液中揮發性物質,并分析不同提取條件下黃花菜提取液殘渣的分子結構,初步探究超聲協同高壓靜電場的提取機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品黃花菜 購于上海裕田農業科技有限公司,產地為大同;無水乙醇 購自成都市科隆化學品有限公司;蒸餾水 實驗室自制。

BS200S電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;GCMS-2010氣相質譜聯用儀 日本島津公司;DVB 75 μm聚二甲基硅氧烷萃取頭 美國Supelco公司;SB-5DTD超聲波提取器 寧波新芝生物科技有限公司;DE-100高精度雙極高壓靜電場發生器 大連鼎通科技有限公司;DKB-10數顯智能低溫恒溫循環器 寧波新芝生物科技有限公司。

在實驗室組裝超聲協同靜電場提取裝置,提取設備示意圖見圖1。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃花菜的預處理 將黃花菜在50 ℃烘24 h,將已烘干的黃花菜粉碎后過60目篩,加入無水乙醇浸泡,磁力攪拌24 h后抽濾,50 ℃下干燥24 h,即得試驗用黃花菜干粉[21],裝袋密封冷藏待用。

1.2.2 黃花菜干粉揮發性物質提取方法 在最佳提取工藝(提取時間30 min,提取溫度60 ℃,超聲功率700 W,電場電壓14 kV,液料比(水∶黃花菜干粉)25 mL/g,脈沖頻率1/600 s-1)的基礎上設計實驗方案[22-23]。采取60 ℃水提取、超聲提取、高壓靜電場提取和超聲協同高壓靜電場提取四種方法來提取黃花菜干粉中的揮發性物質。提取裝置如圖1。

圖1 超聲協同靜電場提取黃花菜揮發性物質裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of ultrasound combined with electric field assisted-extraction device注:1：高精度雙電極靜電場發生器;2：時間控制器;3:超聲波發生器;4:被絕緣玻璃包裹的電極;5:密封橡膠塞;6:錐形瓶;7:超聲水浴槽;8:恒溫循環器;9:超聲波換能器。

60 ℃水提取:稱取2.00 g黃花菜干粉,加入50 mL蒸餾水,在60 ℃水中提取30 min。

超聲提取:稱取等量的黃花菜干粉,加入等量的蒸餾水,在溫度60 ℃、超聲功率700 W下提取30 min。

高壓靜電場提取:稱取等量的黃花菜干粉,加入等量的蒸餾水,在溫度60 ℃、脈沖頻率1/600 s-1、電場電壓14 kV下提取30 min。

超聲協同高壓靜電場提取:稱取等量的黃花菜干粉,加入等量的蒸餾水,在溫度60 ℃,超聲功率700 W、電場電壓14 kV和脈沖頻率1/600 s-1下超聲協同電場提取30 min(最佳工藝條件)。

1.2.3 揮發性物質成分分析 SPME[24]條件:取黃花菜干粉1 g或提取后的黃花菜干粉溶液5 mL,轉移至15 mL頂空瓶中,用DVB 75 μm萃取頭在80 ℃條件下吸附30 min,插入GC進樣口,解吸5 min。

GC[25]條件:色譜柱:DB-FFAP石英毛細柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣為氦氣;進樣口溫度:230 ℃,不分流進樣。升溫程序:起始溫度35 ℃,保持2 min,以15 ℃/min升至170 ℃,保持3 min,再以5 ℃/min升至220 ℃,保持2 min,再以3 ℃/min升至230 ℃,保持7 min。

MS條件:質譜條件:接口溫度230 ℃,離子源溫度230 ℃,電子能量70 eV,質量掃描范圍m/z 35～500。

1.2.4 提取后殘渣的結構觀察(SEM) 將提取后的黃花菜提取液3000 r/min離心15 min[21],收集離心后得到的黃花菜殘渣,冷凍干燥后,用掃描電子顯微鏡觀察黃花菜殘渣的組織形態。

1.2.5 數據分析 根據圖譜庫(NIST14.L)對組分定性,并計算各化學成分的相對含量。

2 結果與討論

2.1 黃花菜及提取液揮發性物質組成

黃花菜及提取液中揮發性物質的GC-MS總離子流圖見圖2～圖6,共檢測出揮發性成分96種,其中醇類9種、醛類14種、酮類18種、酯類9種、烷烴類11種、烯烴類7種、羧酸類9種、酚類3種、其他類16種。檢索出黃花菜及提取液的揮發性物質見表1。

圖2 黃花菜揮發性物質GC-MS總離子流圖Fig.2 GC-MS total ion chromatogram of dried H. citrina volatile components

圖3 黃花菜60 ℃水提取液揮發性物質GC-MS總離子流圖Fig.3 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in H. citrina extract by water extraction at 60 ℃

圖4 黃花菜超聲提取液GC-MS總離子流圖Fig.4 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in H. citrina extract by ultrasonic extraction

圖5 黃花菜高壓靜電場提取液揮發性物質GC-MS總離子流圖Fig.5 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in H. citrina extract by electrostatic field extraction

圖6 黃花菜超聲協同高壓靜電場提取液揮發性物質GC-MS總離子流圖Fig.6 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in H. citrina extract by electrostatic field extraction

由表1可知,黃花菜干粉中有60種揮發性物質(總質量分數99.99%),其中醇類6種(28.06%),醛類6種(11.86%),酮類10種(14.34%),酯類3種(4.85%),烷烴類8種(7.12%),烯烴類6種(7.47%),羧酸類9種(16.00%),酚類3種(2.10%),其他9種(8.19%)。相對含量較高(>1%)的有:3-呋喃甲醇(19.12%)、5-羥甲基糠醛(6.03%)、橙花叔醇(4.86%)、正己酸(4.67%)、3,5-二羥基-5-烯烴-6-甲基吡喃-4-酮(4.60%)、6,10,14-三甲基-2-十五烷酮(4.30%)、乙酸(3.50%)、2-甲基呋喃(3.50%)、呋喃甲醛(3.34%)、2-甲基呋喃(3.37%)、(E)-β-金合歡烯(2.90%)、二氫獼猴桃內酯(2.53%)、正二十烷(2.14%)、3-呋喃甲酸(2.10%)、1-辛烯-3-醇(1.56%)、正十五烷(1.43%)、3-呋喃甲基乙酸酯(1.38%)、辛酸(1.36%)、2-庚烯酸(1.33%)、α-法尼烯(1.31%)、(E)-2,6-二甲基-2,6-十一碳二烯-10-酮(1.13%)、6-甲基-3,5-戊二烯-2-酮(1.12%)、2,6-二叔丁基對甲苯酚(1.07%)、苯乙醇(1.02%)、壬酸(1.01%)。

表1 提取前后黃花菜的揮發性物質組成Table 1 Volatile components in drying H. citrina before and after different extraction methods

續表

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2.2 黃花菜提取液揮發性物質的比較

2.2.1 60 ℃水提取 由表1可知,比較黃花菜及60 ℃水提取液的揮發性物質,黃花菜獨有組分為45種,60 ℃水提取液的獨有組分為18種,相對含量為59.27%,其中醇類2種(1.66%),醛類4種(25.59%),酮類5種(6.39%),酯類3種(6.17%),烷烴類1種(1.69%),其他類3種(17.78%)。

黃花菜中揮發性物質的相對含量醇類(28.06%)>羧酸類(16.00%)>酮類(14.34%)>醛類(11.86%),而提取液中醛類(27.05%)>醇類(20.86%)>其他類(19.21%)>酮類(11.24%);60 ℃水提取液中,醛類、酯類和其他類物質組分明顯增加,醇類、酮類、烷烴類、烯烴類的含量有所下降,羧酸類的含量急劇降低;60 ℃水提取液揮發性物質還保留著主體成分,但是單一組分的種類明顯減少。從單一組分來看,60 ℃水提取液顯著增加的物質有橙花叔醇、2,6-二叔丁基對甲酚等,明顯減少的成分有3-呋喃甲醇;60 ℃水提取液新生成的揮發性物質中含量較高的有(E,E)-2,4-壬二烯醛(13.33%)、3-甲基呋喃(10.72%)、(E,E)-2,4-癸二烯醛(8.29%)等。

黃花菜在60 ℃水后,提取液中的揮發性物質發生了顯著的變化。在60 ℃水的加熱作用下,黃花菜顆粒產生了醇類、醛類、酮類和酯類等化合物。溫度的升高還使得水中氫鍵的締合程度下降[26],部分氫鍵斷裂產生了·H和·OH。黃花菜中的部分成分可能會溶于水,或者接受·H或·OH,發生更為復雜的反應,產生新的物質溶于水中。黃花菜顆粒中溶于水中的物質還有可能在60 ℃的溫度下受熱分解,產生新的揮發性物質?？偟膩碚f,60 ℃水提取后,黃花菜提取液中形成了新的揮發性物質,揮發性物質的組成種類有所減少。

2.2.2 超聲提取 與黃花菜相比,黃花菜中揮發性物質有60種,超聲提取液中僅有44種,揮發性物質的種類數量降低,其中烷烴類、羧酸類的種類大幅減少,醇類、酮類和酚類的種類略有減少,醛類、酯類和其他類的揮發性物質種類有所增加;黃花菜中醇類、羧酸類、酮類和醛類相對含量所占比重為醇類(28.06%)>羧酸類(16.00%)>酮類(14.34%)>醛類(11.86%);超聲提取液中揮發性物質相對含量醛類(20.16%)>醇類(15.88%)>酯類(15.77%)>其他類(15.68%)>酚類(12.64%)>酮類(11.80%)。超聲提取時,超聲的空化效應使黃花菜顆粒溶于水中的不穩定物質降解成小分子物質,并明顯促進酯化反應的進行,與黃花菜相比,超聲提取液中揮發性物質醛類、酯類、酚類相對含量大幅增加,酮類、烯烴類略有降低,醇類、烷烴類、羧酸類相對含量明顯降低。

2.2.3 高壓靜電場提取 與60 ℃水提取和超聲提取相比,高壓靜電場提取液中黃花菜揮發性物質的種類和數量均銳減。從表1中可以看出,與前兩種提取方式相比,高壓靜電場提取后,揮發性物質的相對含量酯類(41.55%)>烷烴類(18.29%)>酮類(16.81%)>醛類(10.19%),酯類占據的比重最大。這種現象的產生與高壓靜電場對反應體系的作用有關。高壓靜電場能夠破壞反應體系中溶脹的黃花菜顆粒分子之間的電子結合力,使顆粒結構變得更加疏松,更容易破碎,增大了固體的比表面積,在高壓靜電場的作用下,帶電荷的粒子定向運動,強化了反應體系中液體的湍動效應,從而增大了傳質系數,強化了傳質過程,促進了黃花菜顆粒中的離子和其他大分子物質流出[27-28];在電場力的作用下,水分子和帶電粒子誘導變形,能級和反應活性較高,能夠反應生成其他化合物。從酯類在揮發性物質中的相對含量較高可以看出,電場對于酯化反應具有顯著的促進作用。

2.2.4 超聲協同高壓靜電場提取 由表1可知,超聲協同高壓靜電場提取液中黃花菜揮發性物質的相對含量醇類(20.24%)>酯類(18.85%)>酮類(18.14%)>酚類(15.65%)。超聲協同高壓靜電場提取與超聲提取相比,揮發性物質中醇類、酯類、烷烴類、酚類的相對含量都有所增加,而醛類、烯烴類的相對含量則顯著降低,這可能跟醛類和烯烴類物質的化學性質比較活潑有關。在超聲協同高壓靜電場提取過程中,各揮發性物質的相對含量發生了顯著的變化,這與超聲和高壓靜電場之間的協同效應有關。超聲波的作用使水分子不斷裂解為·H和·OH[29-30],甚至產生H2O2。反應過程中,黃花菜顆粒中溶出的不穩定的烯烴類物質跟體系中不斷產生的·H等自由基發生反應,因而相對含量降低;高壓靜電場會使水分子和帶電的黃花菜顆粒極化[27],不斷交換方向的高壓脈沖靜電場,使帶電粒子產生往返的定向運動,增大了粒子的碰撞幾率,有利于粒子的反應。同時電場力的作用使空化泡沿場強方向拉伸[28],加劇了空化泡內部的運動,強化了空化效應?？栈脑鰪?給烯烴類物質的加氫反應提供了活化能,從而生成了飽和度較高的烷烴,使烷烴類物質的相對含量增加,與表1中的數據一致。醛類物質的反應活性比較強,R-CHO中的醛基(-CHO)能夠發生氧化或還原反應,轉化成羧基(-COOH)或羥基(-OH),又可以發生酯化反應,這可能是超聲協同高壓靜電場提取與超聲提取相比,提取液中揮發性物質醇類、酯類和酚類的相對含量都有所增加的原因。

2.3 結構觀察

用掃描電子顯微鏡觀察提取后的黃花菜固體殘渣的結構形態。由圖7中黃花菜原料提取前后的掃描電子顯微鏡圖譜可知,提取前黃花菜原料的分子形態(圖7A)呈比較完整的塊狀,沒有明顯的空洞;60 ℃水提取后,黃花菜原料的顆粒表面開始出現一些比較規則的網狀的結構(圖7B)。在60 ℃水的作用下,黃花菜原料的表面部分溶解,水僅僅是侵蝕了原料的表層,并未對其結構造成實質性的破壞。超聲提取后,黃花菜原料的組織形態發生破裂,出現很多比較規則的圓形或橢圓形的空洞狀結構(圖7C)。高壓靜電場提取后,黃花菜的組織被部分破壞,呈現褶皺狀,還有一些比較淺顯的不規則空洞,但是與超聲提取不同的是空洞相對較小,空洞邊緣的厚度比較薄(圖7D);超聲協同高壓靜電場提取后,黃花菜的組織被完全破壞,出現很多半徑較大,褶皺較深的空洞,這些孔洞厚度比較薄,有的空洞之間已經相互連通(圖7E)。不同提取方式對黃花菜原料的破損程度:超聲協同電場提取>超聲提取>電場提取>60 ℃水提取。超聲協同電場提取比超聲提取對黃花菜組織的作用更加強烈,超聲空化作用產生的空化泡的潰裂形成的高速微射流對原料的表面反復沖擊,導致組織破碎,形成空洞,使有效成分大量溶出。靜電場的感應產生的極化現象,強化了體系的湍動效應[31],打薄了黃花菜組織中形成的空洞。超聲場和高壓靜電場的協同效應,相輔相成,大大提高了傳質的效率,可以更大程度地使黃花菜組織中的有效成分溶出。

圖7 黃花菜原料提取揮發性物質前后的掃描電子顯微鏡圖譜Fig.7 SEM images of the residue by different extraction methods注:A:黃花菜原料;B:60 ℃水提取后的殘渣;C:超聲提取后的殘渣;D:高壓靜電場提取后的殘渣;E:超聲協同高壓靜電場提取后的殘渣。

3 結論

黃花菜干粉中有60種揮發性物質(見表1),其中醇類6種(28.06%),醛類6種(11.86%),酮類10種(14.34%),酯類3種(4.85%),烷烴類8種(7.12%),烯烴類6種(7.47%),羧酸類9種(16.00%),酚類3種(2.10%),其他9種(8.19%)。而60 ℃水提取液中揮發性物質相對含量醛類(27.05%)>醇類(20.86%)>其他類(19.21%)>酮類(11.24%);超聲提取液中揮發性物質相對含量醛類(20.16%)>醇類(15.88%)>酯類(15.77%)>其他類(15.68%)>酚類(12.64%)>酮類(11.80%);高壓靜電場提取液中揮發性物質的相對含量酯類(41.55%)>烷烴類(18.29%)>酮類(16.81%)>醛類(10.19%);超聲協同高壓靜電場提取液中揮發性物質的相對含量醇類(20.24%)>酯類(18.85%)>酮類(18.14%)>酚類(15.65%)。綜合來看,超聲協同高壓靜電場提取相比于其他三種提取方法,黃花菜干粉中的主要揮發性物質醇類、醛類、酮類和酚類等能夠更有效地提取出來且含量升高并穩定。用掃描電子顯微鏡觀察提取后的黃花菜固體殘渣,可知不同提取方法對黃花菜原料的破損程度不同:超聲協同高壓靜電場提取>超聲提取>高壓靜電場提取>60 ℃水提取。超聲協同高壓靜電場提取比超聲提取對黃花菜組織的作用更加強烈:超聲空化作用使組織破碎,形成空洞,使有效成分大量溶出;靜電場的極化作用,強化了體系的湍動效應,打薄了黃花菜組織中形成的空洞;超聲場和高壓靜電場的協同效應,提高了傳質的效率,可以促進黃花菜組織中有效成分的溶出。