乙醇熏蒸處理對中華獼猴桃生理代謝及貯藏品質(zhì)的影響

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(1.大連民族大學生命科學學院,生物技術(shù)與資源利用教育部重點實驗室,遼寧大連 116600; 2.大連理工大學生命科學與技術(shù)學院,遼寧大連 116024)

中華獼猴桃(ActinidiachinensisPlanch),別名藤梨、羊桃等,屬于獼猴桃科,獼猴桃屬[1]。中華獼猴桃是一種具有較高經(jīng)濟價值的木質(zhì)藤本植物。獼猴桃果實中含有多種維生素(維生素C等)和豐富的礦物質(zhì)(包括鈣、磷、鐵等),還含有胡蘿卜素、黃酮等物質(zhì),具有較高的營養(yǎng)價值,有“水果之王”、“VC之冠”的美譽。中華獼猴桃作為中國特有的一個品種,其根部具有較高的藥用價值,研究表明中華獼猴桃根部提取出的三萜類化合物具有顯著的抗腫瘤效果[2],其果實對某些癌癥和心血管疾病具有預防的作用[3],具有一定的保健功效。中華獼猴桃不僅口感酸甜,且果肉多汁而鮮嫩,風味極佳,香氣宜人,因此成為廣大消費者最喜愛的水果之一。中華獼猴桃除鮮食之外,還可以進行加工,如制成復合營養(yǎng)飲料及果醋、特色果酒、果脯、果醬、糖類、罐頭等[4-5]。但是由于中華獼猴桃是一種多汁漿果,同時也是典型的呼吸躍變型果實,有明顯的生理后熟過程,采后容易變軟腐爛,因此研究中華獼猴桃果實采后貯藏保鮮技術(shù)極為重要。

乙醇是一種便宜且常見的食品添加劑,已被美國食品和藥物管理局列為通用認可的安全物質(zhì)[6]。乙醇不僅是一種很好的防腐劑,而且還具有延緩植物器官成熟和衰老的功能[7]。相關(guān)研究表明,適當濃度外源乙醇處理能夠減少果蔬病害以及果蔬衰老;采后西蘭花經(jīng)過乙醇蒸汽處理,抑制葉綠素分解代謝的酶的活性和基因表達,使西蘭花延遲變黃[8]。使用乙醇熏蒸處理鮮切茄子,通過減緩茄子呼吸速率、降低酶活性、保持細胞的完整性達到對鮮切茄子的保鮮作用[9]。乙醇還有抑制真菌的作用,將乙醇應(yīng)用到葡萄保鮮中,通過對灰霉病的防控作用,達到對葡萄的保鮮作用[10]。而乙醇熏蒸處理對獼猴桃生理代謝及品質(zhì)的影響尚未有報道。本研究通過使用不同濃度的乙醇熏蒸處理,分析其生理代謝及品質(zhì)的變化,探究最佳的乙醇熏蒸劑量和方法,以期能夠為今后的采后獼猴桃貯藏提供一個安全、操作簡單且成本相對低廉的新型技術(shù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

新鮮的中華獼猴桃 采購于大連開發(fā)區(qū)樂購超市,挑選大小均勻一致、無機械傷害、無病蟲害、單果重量在75～85 g的中華獼猴桃,采購當日即入冷庫,于(0±1) ℃下貯藏;草酸、2,6-二氯酚靛酚、抗壞血酸、丙酮、碳酸鈣、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、過氧化氫、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、鹽酸 均購自天津科密歐化學試劑有限公司。

CR-400型色差計 北京瑞利分析儀器有限公司;TA_XT plus質(zhì)構(gòu)儀 北京瑞利分析儀器有限公司;T-25型勻漿機 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;AL240型電子分析天平 日本島津公司;GC-2010型氣相色譜儀 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;UV-2600型紫外分光光度計 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;BR4i臺式高速冷凍離心機 日本Hitachi;PAL-1 型數(shù)字手持袖珍折射儀 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 尤尼柯上海儀器有限公司;UV-2100 型紫外可見分光光度計 上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理方法 將中華獼猴桃分成四組,每組24個,分別放入含有0、250、500、1000 μL/L乙醇的干燥器(4 L)中,置于(0±1) ℃冷庫中進行熏蒸處理,熏蒸24 h,通風1 h,再分別將四組中華獼猴桃每四個一組裝入密封PE保鮮袋中,(0±1) ℃貯藏。測定獼猴桃第0、14、28、42、 56、70 d中華獼猴桃生理代謝及品質(zhì)指標。

1.2.2 生理指標的測定

1.2.2.1 硬度測定 使用TA_XT plus質(zhì)構(gòu)儀,探頭使用P/5探頭,根據(jù)探頭刺入果實后的最大力來測定它的硬度,即第一次刺入時的最大峰值。每次重復測定至少3個果實。

1.2.2.2 呼吸強度測定 參照司琦等[11]的方法,稍作改動,先將經(jīng)過四種濃度熏蒸處理的中華獼猴桃分別稱取200 g放入密封塑料盒中,在0 ℃冷庫靜置呼吸1 h。然后搖晃塑料盒,使其內(nèi)部氣體分散均勻。接著用GC-2010型氣相色譜儀經(jīng)色譜儀檢測后得到色譜圖,通過峰面積可得到進樣氣體CO2的體積分數(shù)(%),最后推算出呼吸速率。

1.2.2.3 可溶性固形物(TSS)含量測定 使用PAL-1便攜式手持折光儀進行測定,取5 g中華獼猴桃果肉,放入研缽中研磨至磨碎后,經(jīng)離心(4000 r/min,10 min),取汁液測定。

1.2.2.4 葉綠素含量的測定 參照任紅等[12]的方法,稱取1.0 g中華獼猴桃果肉樣品放入研缽中,加少量石英砂和碳酸鈣粉及2～3 mL 80%丙酮溶液,研成勻漿,再加10 mL 80%丙酮溶液繼續(xù)研磨至組織變白,靜置3～5 min提取;然后過濾到50 mL棕色容量瓶中;最后用80%丙酮溶液定容至50 mL,搖勻。注意,各器皿、用具在使用之前必須用80%丙酮溶液潤洗。以80%丙酮溶液為空白參比調(diào)零,用1 cm光徑比色皿在波長663 nm和645 nm處分別比色測定提取液的吸光度值。

葉綠素含量(mg/g)=[(20.29×OD645+8.05×OD663)×6]/(m×1000)

1.2.2.5 果肉顏色飽和度 用CR-400型色差計測定其橫切面的色澤,測定方法參照姜愛麗等[13]的方法,每次至少取三個進行測定,取平均值。

1.2.2.6 PPO、POD、CAT 多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)、過氧化物酶(peroxidase,POD)的測定方法參照Chen等[14]、Marsellés-Fontanet等[15]的方法,稍作改動形成本實驗的測定方法。過氧化氫酶(catalase,CAT)的測定方法參照Cakmak等[16]的方法稍作改動,然后測定其酶活力。分別測定1 min內(nèi)每克果實在398、460、290 nm處吸光度,結(jié)果以U表示,重復3次。

1.2.2.7 總酚、類黃酮含量測定 采用HCl-甲醇法[17],稱取2.0 g中華獼猴桃果肉,加入少許經(jīng)預冷的1% HCl-甲醇溶液,在冰浴條件下研磨,然后轉(zhuǎn)入20 mL刻度試管中。用1% HCl-甲醇溶液漂洗,漂洗后一并轉(zhuǎn)移到試管中,于4 ℃避光條件下提取20 min,收集濾液待用。以1% HCl-甲醇溶液做空白參比調(diào)零,取濾液于280、325 nm測定溶液吸光值。以沒食子酸為標準品,制作標準曲線,回歸方程為y=0.0051x+0.0178(R2=0.995),計算總酚含量。以蘆丁為標準品,制作標準曲線,回歸方程為y=11.105x-0.0021(R2=0.9998),計算類黃酮含量。

1.2.2.8 抗壞血酸 采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[18]。用已標定的2,6-二氯酚靛酚溶液滴定用草酸提取的果實上清液(搖勻后靜置提取10 min,過濾),至出現(xiàn)微紅色、且15 s不褪色為止,記下染料的用量,重復三次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

上述實驗均需進行三次平行實驗,用Excel計算數(shù)據(jù)的平均值與標準偏差,并用Origin 8做圖,SPSS軟件進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度乙醇熏蒸處理對中華獼猴桃果實品質(zhì)的影響

呼吸作用是果蔬采后生命活動的中心,與其品質(zhì)變化、采后生理變化以及貨架期有著較為密切的聯(lián)系[19]。如圖1A所示,對照的呼吸強度呈先上升后下降的趨勢,42 d時達到最高峰。而經(jīng)過乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃的呼吸強度受到明顯的抑制,其中250 μL/L乙醇熏蒸處理對中華獼猴桃呼吸作用的抑制程度優(yōu)于500與1000 μL/L乙醇熏蒸處理,呼吸強度顯著低于這兩組乙醇處理(P<0.05)。采后果蔬在貯藏前期的新鮮度較好,品質(zhì)較優(yōu),呼吸速率低;貯藏中期呼吸速率開始升高,表明采后果蔬正在逐漸衰老變質(zhì);而貯藏后期呼吸速率又下降,表明此時采后果蔬已完全干枯或腐爛,臨近衰老死亡狀態(tài)[20-21]。

圖1 乙醇熏蒸處理中華獼猴桃果實對呼吸強度(A)、果實硬度(B)、葉綠素含量(C)、可溶性固形物含量(D)、果肉顏色飽和度(E)的影響Fig.1 Effects of ethanol fumigation treatment on the respiratory rate(A),fruit firmness(B),chlorophyll content(C),TSS(D)and the saturation of flesh color(E)in Chinese kiwi fruit

果實硬度是衡量果實成熟度和貯藏品質(zhì)的重要指標之一,如圖1B所示,在貯藏期間,四種處理條件下果實硬度均呈逐漸下降的趨勢,250 μL/L乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃硬度顯著高于同期對照(P<0.05)。500 μL/L乙醇處理的中華獼猴桃果實硬度在第42 d時的果實硬度接近于1000 μL/L乙醇處理的中華獼猴桃。在果實成熟、衰老過程中,果實硬度逐漸降低[22]。實驗結(jié)果表明乙醇熏蒸處理有利于保持果實硬度,減緩果實的軟化速率。

葉綠素是植物進行光合作用的重要色素物質(zhì)。在水果、蔬菜中也存在著大量的葉綠素。如圖1C所示,對照的中華獼猴桃中葉綠素含量呈下降趨勢,而經(jīng)乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃中葉綠素的含量是呈緩慢上升后又下降的趨勢,并且250、500與1000 μL/L乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃果實中葉綠素含量分解速率差異不顯著,在第14～28 d內(nèi)高于同期對照。Sukanya等[23]對西蘭花的研究表明,采后初期,由于有脫鎂葉綠素生成,果實中葉綠素值升高,一段時間后,隨著果蔬成熟衰老,葉綠素含量不斷下降。

如圖1D所示,中華獼猴桃果實中可溶性固形物含量在貯藏過程中均呈上升趨勢,在第14～42 d,乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃可溶性固形物含量低于同期對照,且在第70 d時,250與500 μL/L乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃果實的可溶性固形物含量差異不顯著(P>0.05)。隨著貯藏時間的延長,果蔬中的淀粉分解轉(zhuǎn)化為可溶性糖,隨之可溶性固形物含量也將增加[24-25]。

果肉顏色飽和度的變化是中華獼猴桃品質(zhì)變化最直觀的表現(xiàn),隨著貯藏天數(shù)的延長，大多數(shù)果蔬的果肉顏色飽和度都會發(fā)生一個明顯下降的趨勢。如圖1E所示,四種處理條件下果肉顏色飽和度均呈逐漸下降的趨勢,在第42 d,經(jīng)過500 μL/L乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃果肉顏色高于同期對照,在第56、70 d,乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃果肉顏色飽和度差異不顯著(P>0.05),但均高于同期對照。

2.2 不同濃度乙醇熏蒸處理對中華獼猴桃果實酶活性的影響

如圖2A所示,果實大部分的CAT活性呈現(xiàn)先下降,后升高又下降的趨勢。CAT活性高峰總體出現(xiàn)在第56 d,乙醇熏蒸處理后,CAT活性高于同期對照,在第28 d前,250 μL/L乙醇熏蒸處理顯著高于其他處理組(P<0.05),在第42、56 d,1000 μL/L乙醇熏蒸處理效果最佳,第70 d,三種乙醇熏蒸處理差異不顯著(P>0.05),但均高于同期對照。當果蔬中的活性氧積累過多而不能及時清除時,果蔬的衰老速度將加快。CAT能夠催化果蔬體內(nèi)積累的過氧化氫(H2O2),從而減少H2O2對果蔬帶來的氧化損傷[26]。

如圖2B所示,在第56 d時PPO活性最高,在第56 d,500 μL/L乙醇處理的中華獼猴桃活性高峰顯著低于同期對照(P<0.05),前28 d時PPO活性差異不顯著(P>0.05)，乙醇熏蒸處理對PPO活性影響不顯著。多酚氧化酶是一種以銅為輔機的酶,PPO將酚類物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì),醌類化合物進一步聚合形成褐色、棕色和黑色聚合物,果蔬出現(xiàn)的組織褐變與組織中的多酚氧化酶活性密切相關(guān)[27]。Rocha等[28]的研究表明,切割后萵苣和蘋果的PPO酶活性顯著升高,且有明顯的褐變現(xiàn)象。

圖2 乙醇熏蒸處理中華獼猴桃果實對CAT活性(A)、PPO活性(B)、POD(C)活性的影響Fig.2 Effect of ethanol fumigation treatment on the CAT(A),PPO(B),and POD(C)activity of Chinese kiwi fruit

如圖2C所示,在整個實驗過程中,中華獼猴桃POD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。第14 d時，處理組顯著高于同期對照(P<0.05),第70 d時各組果實POD活性沒有太大差異(P>0.05)。由此可見,乙醇熏蒸處理不能夠降低POD活性。POD是果蔬體內(nèi)普遍一種重要的氧化還原酶,它與果蔬的許多生理代謝過程密切相關(guān),具有很強的抗性(抗病、抗氧化、抗逆境脅迫等)。POD在有H2O2存在的條件下,POD能夠使酚類和黃酮類氧化,再聚合,從而形成褐色物質(zhì),導致果蔬褐變[27,29]。Aquino-Bolaos[30]提出PPO和POD有著促進褐變的作用。

2.3 不同濃度乙醇熏蒸處理對中華獼猴桃果實抗氧化物質(zhì)的影響

如圖3A所示,在整個實驗過程中,中華獼猴桃果實中維生素C的含量呈下降趨勢,經(jīng)過乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃果實中維生素C含量顯著高于同期對照(P<0.05)。在第14 d時,250與1000 μL/L乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃果實維生素C含量顯著高于(P<0.05)500 μL/L乙醇熏蒸處理組,在第28 d,三種乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃果實維生素C含量差異不顯著(P>0.05),在第28 d,250 μL/L乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃果實維生素C含量顯著高于(P<0.01)同期對照。中華獼猴桃中含有豐富的維生素C,VC具有很強的抗氧化能力,所以是重要的抗氧化性物質(zhì)之一,其抗氧化性與其含量呈正比例[31]，在果蔬衰老過程中起抗氧化劑的作用。

如圖3B所示,在整個實驗期間,中華獼猴桃果實總酚含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,乙醇處理組第28 d達到峰值,500 μL/L乙醇熏蒸處理的效果最顯著,在第42 d前,乙醇熏蒸處理中華獼猴桃總酚含量明顯高于同期對照。第56 d時乙醇處理的中華獼猴桃總酚含量差異不顯著(P>0.05)。實驗結(jié)果表明,乙醇處理可減緩中華獼猴桃中總酚含量的下降速率。

圖3 乙醇熏蒸處理中華獼猴桃果實對抗壞血酸(A)、總酚含量(B)、類黃酮含量(C)的影響Fig.3 Effect of ethanol fumigation treatment on the vitamin content C(A),phenol compounds(B)and flavonoids content(C)in Chinese kiwi fruit

如圖3C所示,中華獼猴桃果實中的類黃酮含量呈先上升后下降的趨勢,第42 d時達到峰值,乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃果實的類黃酮含量顯著高于同期對照(P<0.05),在第42 d前,500 μL/L乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃類黃酮含量顯著高于同期對照(P<0.05)。第56、70 d的類黃酮含量差異性不顯著(P>0.05)。果蔬組織中大量存在著酚類、類黃酮類和花青素等植物次生代謝產(chǎn)物,它們與果蔬的色澤發(fā)育、品質(zhì)和風味形成、成熟衰老過程、組織褐變、抗逆性和抗病性代謝等作用密切相關(guān),對果蔬的貯藏有重要的影響[32]。

2.4 主成分分析

主成分分析法(PCA)是將多個指標轉(zhuǎn)化為幾個綜合指標的降維統(tǒng)計分析方法[33-34],更利于人們對多個指標進行相關(guān)性分析。如圖4所示,將11個原始指標綜合為三個主成分PC1、PC2和PC3,這三個主成分貢獻率分別占數(shù)據(jù)集總方差的46.343%、22.984%和11.784%(所有數(shù)據(jù)均進行標準化),累計貢獻率達到81.114%。第一主成分與葉綠素含量、果肉顏色飽和度、維生素C含量和果實硬度呈正相關(guān),與可溶性固形物呈負相關(guān);第二主成分與PPO、總酚和黃酮呈正相關(guān);第三主成分與CAT呈正相關(guān)。由這些相關(guān)性可知,當果實硬度下降,其果實品質(zhì)也下降,所含營養(yǎng)物質(zhì)含量下降;PPO活性能夠影響總酚和類黃酮的含量;CAT能夠催化果蔬體內(nèi)積累的過氧化氫(H2O2),降低POD與過氧化氫作用,減少因酚類和黃酮類氧化再聚合而形成的褐色物質(zhì)[35]從而較好地保護了中華獼猴桃果實品質(zhì)。

圖4 主成分分析載荷圖Fig.4 Principal component analysis loading map

3 結(jié)論

本研究使用不同濃度乙醇熏蒸處理獼猴桃果實,通過相關(guān)生理指標的測定與分析,250和500 μL/L乙醇熏蒸處理均能能夠較好的抑制呼吸強度,保持果實硬度,減緩VC下降速率;其中500 μL/L乙醇熏蒸處理能夠較好的降低PPO、POD的酶活性,較好地保持果肉顏色飽和度、總酚和黃酮的含量;而1000 μL/L乙醇熏蒸處理對獼猴桃果實品質(zhì)的保持未顯示出較明顯的作用。綜合考慮認為500 μL/L乙醇熏蒸處理為最佳處理組。

以上結(jié)果表明,使用適當濃度的乙醇熏蒸處理保持果實固有品質(zhì)以及酶活性,從而延長果實的貯藏期,同時保證食用的安全性,因而乙醇熏蒸處理在獼猴桃果實保鮮中具有較好的應(yīng)用前景。但是經(jīng)過乙醇熏蒸處理對獼猴桃衰老代謝的調(diào)控途徑、抗氧化代謝途徑以及相關(guān)代謝基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還不清楚,所以仍需要進一步的研究。