微生物生產威蘭膠的研究進展

,2,2,2,*

(1.廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530004; 2.廣西水牛奶工程技術研究中心,廣西南寧 530004)

多糖(polysaccharide)是一類由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物[1]。其來源廣泛,其中由部分微生物在生長代謝過程中分泌到細胞壁外的水溶性多糖被稱為胞外多糖(exopolysaccharides)。若聚合物與細胞膜以及培養基中釋放的胞外多糖結合緊密,則胞外多糖中還含有莢膜多糖(圖1),這些多糖最后可以分泌到周圍的液體介質中或嵌入到生物膜中[2]。微生物胞外多糖的聚合通常發生在內膜的細胞質表面或周質,之后被輸出到細胞外。除了為微生物提供物理屏障外,它們還可以為細胞提供額外的生物保護[3]。這些微生物具有生產周期短,生產條件不受限制,生產原料廣泛(含碳氮源的廢渣和廢液)的特點,因此利用微生物生產胞外多糖比化學合成法更具經濟效益。

圖1 胞外多糖的組成:釋放于介質的胞外多糖(MRP)與莢膜多糖(CPS)Fig.1 Composition of extracellular polysaccharides:exopolysaccharide(MRP)and capsular polysaccharide(CPS)released from the medium

目前廣泛使用的胞外多糖有鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp.)生產的鞘氨醇(sphingans)[4],黃單胞菌生產的黃原膠(xanthan)[5],小核菌生產的小核菌葡聚糖(Scleroglucan)[6],芽短梗霉菌生產的普魯蘭多糖(pullulan)[7],裂褶菌生產的裂裥多糖(Schizophyllan)[8],鏈球菌生產的透明質酸(hyaluronic acid)[9],根瘤菌生產的琥珀聚糖(succinoglycan)[10]等。其中,由鞘氨醇科菌株合成的生物聚合物具有相似但不相同的結構,被統稱為鞘氨醇[11]。現階段,鞘氨醇有結冷膠(S-60)、威蘭膠、Rhamsan(S-194)、Sanxan、S-88、Diutan(S-657)、S-198等。其中,威蘭膠因其獨特的性質成為研究熱點。

威蘭膠(S-130)是由摩爾比為3.1∶2.3∶4.5∶1.0的D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、L-鼠李糖和L-甘露糖以糖苷鍵連接而成,四糖骨架結構為[→3)-β-D-Glc-(1→4)-β-D-GlcA-(1→4)-β-D-Glc-(1→4)-α-L-Rha(或者Man)-(1→],并且擁有一個連接在葡萄糖單元上的鼠李糖或甘露糖側鏈,其側鏈的鼠李糖與甘露糖單元比例為3∶1[12]。威蘭膠溶液具有在高溫(高達150 ℃)與廣泛酸堿度(pH2～12)中黏性穩定的獨特性質[13];與已廣泛使用的黃原膠相比,威蘭膠的分子量較低[14],但在相同濃度下,威蘭膠溶液呈現出更高的表觀粘度和更高的粘彈性模量(損耗和儲存模量)。因此其在混凝土、石油、生物醫學、藥物、化妝品與食品領域具有很高的應用價值與良好的發展前景,例如日本已將威蘭膠列入合法的食品添加劑[15],其中建筑、石油與廢水處理方面的應用被廣泛研究報道(表1)。然而,目前鞘氨醇單胞菌發酵威蘭膠的糖轉化率較低,一般在30%～40%,而黃原膠在70%～90%[16],這使得威蘭膠成為最昂貴的生物膠之一。因此,提高糖轉化率,降低成本成為了威蘭膠生產發展的關鍵所在。近期研究人員開始探究各種育種方式和優化培養基的方法,以提高生物質能轉化率,降低生產成本。

表1 威蘭膠的應用研究Table 1 The application researches of Welan gum

1 鞘氨醇單胞菌中威蘭膠的代謝途徑解析

微生物胞外多糖生產具有簡單、穩健、可重復的性質,且易于通過生長條件控制(例如碳源的類型和濃度,pH或溫度)。然而,盡管可以生產具有恒定特性(例如組成、純度和均勻性)的胞外多糖,但仍需要更好地理解其合成途徑,以達到最大化生產并獲得經濟可行的過程。目前,在鞘氨醇單胞菌中,其合成威蘭膠的代謝途徑已經闡明,即包括細胞代謝途徑(碳源攝取途徑與中心代謝途徑)和威蘭膠合成途徑(五糖單元的組裝、聚合與分泌)。

1.1 鞘氨醇單胞菌細胞代謝途徑

細菌的碳源攝取包括周質直接氧化途徑和細胞內磷酸化途徑,前者僅存在于某些細菌中,后者在細菌中無處不在。中心代謝途徑包括糖酵解途徑(EMP)、磷酸戊糖途徑(PPP)、2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸途徑(ED)和三羧酸循環(TCA)為細胞的生理活動和產物合成提供能量和還原能力[26]。研究表明Alcaligenessp. CGMCC2428中的中心代謝酶如KDPG醛縮酶和PGD酶的活性均存在,因此,ED和PPP途徑都存在于該生物體中。且鞘氨醇單胞菌為好氧微生物,則一定發生TCA。同時,研究人員測出PFK酶的比活性為零,因此認為在Alcaligenessp. CGMCC2428中沒有EMP途徑。生產胞外多糖的機制包括以下步驟:糖核苷酸前體的合成;重復單元的聚合;聚合重復單元的輸出[27]。

1.2 威蘭膠合成途徑解析

在鞘氨醇單胞菌合成威蘭膠的步驟包括:a. 葡萄糖由葡萄糖激酶磷酸化為葡萄糖-6磷酸或者通過細胞周質,在葡萄糖脫氫酶(GDH)的作用下聯合吡咯喹啉醌作為輔助因子產生葡萄糖酸鹽葡糖酸鹽通透酶的主動轉運系統轉運到細胞中,然后通過ATP依賴性葡糖酸激酶反應將葡萄糖酸鹽磷酸化,并產生6-磷酸葡糖酸鹽;b. 形成的葡萄糖-6-磷酸進一步轉化為果糖-6-磷酸(Fru-6-Ph)和葡萄糖-1-磷酸(Glu-1-Ph),共同參與核苷酸前體的形成和威蘭膠的產生;c. 果糖-6-磷酸轉化為甘露糖-6-磷酸,隨后轉變為甘露糖-1-磷酸,最終成為二磷酸鳥苷-甘露糖(GDP-Man);葡萄糖-1-磷酸則分別轉化為二磷酸尿苷-葡萄糖(UDP-Glc)和鄰苯二甲酸二異十三酯-葡萄糖(dTDP-Glc),二磷酸尿苷葡萄糖最終轉化為二磷酸尿苷-葡萄糖醛酸(dTDP-GlcA)和焦磷酸異戊二烯-葡萄糖(IDP-Glc),鄰苯二甲酸二異十三酯-葡萄糖最終轉化為鄰苯二甲酸二異十三酯-鼠李糖(dTDP-Rha);d. 四種終產物縮合形成威蘭膠[28](圖2)。

圖2 鞘氨醇單胞菌中威蘭膠合成途徑Fig.2 Metabolic pathways for the production of synthetic Welan gum in Sphingomonas sp.注:F-6-P:果糖-6-磷酸,R-5-P:丙炔酸-5-磷酸,GAP:甘油醛-3-磷酸,6-PG:6-磷酸葡萄糖酸鹽,KDPG:2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸鹽,AcCoA:乙酰輔酶A,E-4-P:赤蘚糖-4-磷酸,G-1-P:葡萄糖-1-磷酸,M-6-P:甘露糖-6-磷酸,M-1-P:吡喃糖-1-磷酸,UDP-Glc:UDP-葡萄糖,UDP-GlcA:UDP-葡萄糖醛酸,dTDP-Glc:dTDP-葡萄糖,dTDP-Rha:dTDP-鼠李糖,GDP-man:GDP-甘露糖,IP:類異戊二烯磷酸鹽,IDP:類異戊二烯焦磷酸鹽。

1.3 提高微生物合成威蘭膠的育種策略

1.3.1 威蘭膠合成途徑關鍵酶 核苷酸糖前體的生物合成,是威蘭膠合成的基礎。許多研究已經表明,核苷酸糖前體生物合成途徑中,磷酸葡萄糖苷酶(PGMG)、尿嘧啶二磷酸(UDP)-葡萄糖焦磷酸化酶(UGPG)、UDP-葡萄糖脫氫酶(UGDG)、磷酸甘露糖異構酶(PMI)和dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶(TGP)是關鍵酶[29]。其中TGP酶是dTDP-1-鼠李糖生物合成途徑中的關鍵酶[30];PMI是GDP-甘露糖生物合成中的關鍵酶[31]。

1.3.2 誘變育種技術 誘變育種即通過利用物理、化學等因素誘導動植物的遺傳特性產生變異,再通過不同的篩選方式從變異群體中選擇符合需求的個體,從而得到新品種的育種方法。誘變育種變異頻率高,可大幅度地獲得新品種。a.利用誘變技術得到高產菌株。利用低能氮離子束注入技術對Alcaligenessp.NX-3進行誘變,篩選得到突變菌株比野生菌株威蘭膠生產量高34.4%,并且發現突變菌株中磷酸葡萄糖苷酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-葡萄糖脫氫酶和dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶的比活性均高于野生型菌株[32];b.獲得耐高溫菌株以減少降溫成本。溫度耐受性可歸因于熱休克蛋白和氧化應激蛋白的過度表達[33],通過等離子體誘變獲得耐高溫菌株Sphingomonassp. HT-1,該菌株在37 ℃生產威蘭膠濃度達(26.8±0.34) g/L。

1.3.3 代謝工程技術 代謝工程即利用基因重組技術改造細胞的代謝途徑,從而使細菌生產出特定目的產物的育種方法。2012年鞘氨醇單胞菌ATCC 31555測序工作的完成,為其代謝工程發展奠定了基礎。代謝工程優化代謝途徑,實現威蘭膠的高效合成的方法:a. 通過基因工程技術獲得高產菌株。向Sphingomonassp. HT-1中插入可表達透明顫菌血紅蛋白VHb基因,從而改善發酵過程中的溶氧水平,最終威蘭膠的產量從25.3 g/L增加到34.6 g/L,且威蘭膠溶液的流變性基本保持不變[34]。b. 減少色素帶來的純化成本。將透明顫菌血紅蛋白基因與β-半乳糖苷酶(lacZ)啟動子結合,插入到Alcaligenessp. ATCC31555染色體的八氫番茄紅素合成酶(crtB)基因區域,從而得到不含胡蘿卜素的威蘭膠以減少后期乙醇的使用量,最終工程菌株的威蘭膠產量高于野生菌株為(24±0.4) g/L,且流變性更好[35]。

2 發酵法生產威蘭膠菌株的菌種選育

為實現威蘭膠的工業化應用,作為威蘭膠的生產菌株則應具備能在胞內高效合成并快速轉運威蘭膠至胞外,碳源轉化率高,生長迅速、發酵周期短,產物雜質少、易純化分離等特點。近年來,科研工作者通過自然選育、誘變育種及代謝工程等育種策略實現了高產威蘭膠菌株的選育,為實現其工業化生產奠定了基礎(表2)。

表2 產威蘭膠的不同菌株的培養基及威蘭膠產量Table 2 Culture medium of different strains producing Welan gum and yield of Welan gum

3 提高威蘭膠生產效率的策略

3.1 使用廉價碳源

碳源是微生物胞外多糖生產的關鍵因素,可占總成本約63%[38]。鞘氨醇單胞菌擁有廣泛的底物譜,如最開始用作發酵威蘭膠的碳源是單糖(例如葡萄糖)。但由于碳源轉化率低,使得威蘭膠生產成本高價格昂貴,因此,研究、探索適合生產的廉價碳源:a.利用甘蔗糖蜜作為碳源,采用酸水解法處理糖蜜,發酵液中威蘭膠濃度可達33.5 g/L[36],明顯高于使用相同濃度糖(葡萄糖、果糖和蔗糖)混合物發酵產量,因此認為糖蜜中含氮類化合物和大量有機酸,比起單糖和雙糖更適合該菌生長;b.利用中性蛋白酶、α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶處理廚余,在5 L發酵罐中進行威蘭膠發酵,威蘭膠產量、還原糖和氮源的利用率分別達到5.57 g/L、94.25%和61.96%[39];c.利用制糖工業廢料葡萄糖母液和木糖母液生產威蘭膠,先利用葡萄糖母液供給鞘氨醇單胞菌繁殖,再使用擬指數補料方法加入木糖母液,得到威蘭膠濃度為22.68 g/L,糖轉化率達到0.756 g/g[16]。

3.2 氮源優化

微生物可以利用多種氮源,它們通過酶來運輸這些化合物和酶,并代謝產生氨。氮源調控旨在防止或減少細胞對酶和通透酶形成的不必要的分歧,以便在優選氮時利用作為非谷氨酸和谷氨酰胺來源的化合物作為氮源。微生物細胞能夠靈敏地感應出生長環境中氮源的變化并及時作出代謝調整,利于細胞存活。將六種不同的氮源NaNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4、牛肉膏、大豆蛋白胨和酵母粉用于鞘氨醇單胞菌ATCC31555的發酵,初始氮源濃度為3 g/L,NaNO3和牛肉膏對威蘭膠的合成影響最大,發酵結束時,威蘭膠產量分別達到8.76和12.47 g/L,生物量分別為5.85和7.89 g/L,進一步對這兩種氮源進行研究發現,牛肉膏比起NaNO3更適合細菌生長,NaNO3生產的威蘭膠粘度更大,隨著NaNO3濃度的降低,威蘭膠的分子量和甘露糖的摩爾比降低,但葡萄糖醛酸的摩爾比增加[40];與無機氮相比,有機氮的細菌生物量和威蘭膠產量更高,通過轉錄組分析不同氮源培養鞘氨醇單菌ATCC 31555代謝過程中信號轉導和細菌趨化性變化相關聯的基因的表達水平,這些基因表達變異可能是細菌生物量和威蘭膠生產變化的原因[41]。

3.3 溶氧量調控策略

鞘氨醇單胞菌是一種好氧微生物,在生產威蘭膠這類粘性多糖的過程中,營養物質和氧氣轉移的效率很容易受到發酵過程中流體的高粘度的影響[42],因此,威蘭膠的合成和特性可能受到溶氧量影響。隨著生產時間的增加,產物在細胞外堆積,氧氣傳送速率降低,導致產量的下降。在好氧微生物發酵的過程中,溶氧量成為限制性控制因素,氧氣傳遞速率影響整個細菌生長和生產代謝過程。氧氣量的減少可能導致酶的功能受到影響,從而導致所需產物減少甚至微生物死亡。溶氧因素的優化方式有以下幾種:a通過改變轉速提高溶氧量。在600 r/min時將溶氧濃度增加至20%,可獲得最大威蘭膠濃度和分子量為(9.20±0.11)×105Da和(24.5±0.53) g/L,此時葡萄糖-1-磷酸對威蘭膠的通量增強,增加的通量也可能是分子量和威蘭膠濃度增加的原因[43];使用兩階段轉速控制策略,發酵初期22 h期間,攪拌速度控制在800 r/min以維持速率的細胞生長,然后將攪拌速度逐步降低至600 r/min以保持具有穩定溶解氧水平以獲得高產量,威蘭膠的最大濃度達到(26.3±0.89) g/L,產量為(0.53±0.003) g/g,其與恒定攪拌速度控制的最佳結果相比,產量增加了20.1%[44];b 通過添加氧載體提高溶氧量。與水不混溶且比水具有更高的氧氣增溶能力的有機相,通常稱為氧氣載體[45]。向發酵液加入氧載體正十二烷和正十六烷后,發酵培養基的氧轉移量達到顯著高于對照組,同時威蘭膠濃度和產率分別達到(33.9±0.56) g/L和(0.761±0.010) g/g,且添加正十二烷,菌體濃度達到最大值(7.82±0.18) g/L[37];比較十六烷基三乙基溴化銨、十二烷基硫酸鈉、Triton X-100、Span-20、Span-40、Span-80、吐溫-20、吐溫-40、吐溫-80、DMSO和甘油的添加對產量的優化,發現在吐溫-40的作用下增產最高,威蘭膠濃度為(23.62±0.60) g/L[46]。

綜上所述,選用廉價碳源既減少了發酵成本,且適宜的廉價碳源(如糖蜜)也使得產量提升最為明顯,可將其與其他提產方式及育種方式進行結合,研究出集最佳的菌種、培養基及發酵條件為一體的發酵體系。

4 威蘭膠的分離純化

從發酵液中分離多糖的最常用方法是除去菌體后用異丙醇、乙醇等有機溶劑進行物理萃取,再通過離心處理獲得粗多糖。可在去除菌體前使用超聲波處理或加熱充分溶解威蘭膠膠體,使菌體與威蘭膠分離[47]。粗威蘭膠中含有少量蛋白質,通常使用Sevage法脫去蛋白,之后放入透析袋中透析,以除去小分子的金屬離子及單糖等物質。將透析后的截留液進行真空濃縮、冷凍干燥,可制得精制的威蘭膠(圖3)。離心和過濾可用于從粗膠中除去不溶物質并除去一定比例的高可溶性物質,透析處理可以除去更低摩爾質量的雜質。其他方法例如離子交換色譜、柱層析等方法也可用于多糖的純化,需要進一步開發這些技術用于威蘭膠的純化。

圖3 威蘭膠的分離純化Fig.3 Separation and purification of Welan gum

5 結論與展望

威蘭膠這種在高溫與廣泛酸堿度中粘性穩定的性能特殊原料,仍然集中應用在建筑、石油等重工業領域,在食品行業中僅有少部分國家視其為合法的食品添加劑。與其類似的胞外多糖例如黃原膠、結冷膠等,已經在各個工業領域占據一定的地位。威蘭膠普及率低的原因與其生產成本高有很大的關系,碳轉化率低、分離純化方法復雜等原因限制其經濟性。近年來在合成代謝途徑、生產條件優化與提高經濟性等方面進行了諸多研究,且有實質性進展。但較已工業化的黃原膠與結冷膠還有一定的差距,因此需要進一步找出提高產量與簡易純化的方法。關于威蘭膠生產發展的后期研究應圍繞以下幾個方面:更深入研究其結構與性能,開發更多應用潛力;與其他試劑相溶性與應用;降低生產成本;開發研究其衍生物。威蘭膠生產應用的研究雖然有所進展,但仍然任重而道遠。