大腸桿菌代謝途徑改造策略與應用研究進展

李冉 黃玉清 賈振華

（河北省科學院生物研究所，石家莊 050051）

大腸桿菌的代謝組學已研究的很透徹，與其他微生物相比，其自身的代謝途徑更加穩定且易于改造，因此大腸桿菌作為一種工業微生物被廣泛應用于代謝途徑改造的研究。目前對大腸桿菌改造的研究集中在四條主要代謝途徑，包括丙酮酸、乙酰輔酶A、甲羥戊酸和莽草酸代謝途徑，用于醇類、有機脂肪酸、氨基酸、類異物二烯和芳香族化合物的合成。

大腸桿菌的系統代謝工程在生物燃料和砌塊化合物的合成中均有研究和應用，它將整個生物過程的系統生物學和合成生物學相結合，有助于制定有效的策略改造微生物菌株，以便使目標化學品的生產產量和生產效率最大化，同時使整個上游和下游的工藝成本最小化。常用的技術主要包括自身代謝途徑的基因敲除、過表達以及導入新的代謝途徑。

本文綜述了大腸桿菌系統代謝工程在自身代謝途徑改造策略，在生產生物燃料、砌塊化合物的微生物開發中所使用的工具和策略，以期為研究者以大腸桿菌合成目標化合物的研究提供一個整體的思路和方法。

1 大腸桿菌代謝途徑的改造

1.1 丙酮酸代謝途徑改造

丙酮酸是一種重要的有機中間體，可被用作L-色氨酸、L-酪氨酸和二羥基苯丙氨酸等藥物的合成，也可用于阿托酸、丙酮酸乙酯等農藥中間體的合成［1］。在大腸桿菌中，丙酮酸是糖酵解途徑中重要的代謝中間體，可用于乳酸、丙氨酸、醋酸酯和乙酰輔酶A的合成，也可用于乙二醇、2，3-丁二醇和異丁醇等的合成［2-3］。目前對丙酮酸途徑的改造主要有3種方式，第一，降低丙酮酸脫氫酶復合體（Pyruvate dehydrogenase complex，PDHC）的活性，PDHC由3個亞基組成，包括aceE基因編碼的EI亞基，即丙酮酸脫氫酶（Pyruvate dehydrogenase）；aceF基因編碼的E2亞基，即二氫硫辛酰胺轉乙酰酶（Dihydrohpoamide transacetylase）；IpdA基因編碼的E3亞基，即二氫硫辛酰胺脫氫酶（Dihydrolipoamide dehydrogenase）。宋燦輝等［4］利用 Red重組系統構建了營養缺陷型菌株MG1655，敲除大腸桿菌PDHC中的aceE基因后，阻斷了丙酮酸流向TCA循環，促進丙酮酸的累積。第二，降低α-酮戊二酸脫氫酶復合體（α-ketoglutarate dehydrogenase complex，AKGDH）的活性，AKGDH由3個亞基構成，包括sucA編碼的E1亞基，即α-酮戊二酸脫羧 酶（α-ketoglutaratedecarboxylase，KCBX）；sucB基因編碼的E2亞基，即硫辛酰轉琥珀酰酶（Lipoyl transsuccillylase，LTS）及IpdA基因編碼的E3亞基。Causey等［5-6］通過敲除atpFH、adhE、sucA基因來降低ATP合成、細胞生長和CO2產生的速率，從而加強從葡萄糖到丙酮酸的積累。第三，減少丙酮酸代謝支路，減少丙酮酸的消耗。大腸桿菌YYC202是一種被成功改造的用于丙酮酸積累的營養缺陷型菌株，突變了其中編碼丙酮酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸合酶、丙酮酸甲酸裂解酶和丙酮酸氧化酶的基因，去除了可以消耗丙酮酸的下游代謝［7-8］。從目前的研究可以看出，促進大腸桿菌中丙酮酸的積累主要有兩個策略，首先是提高丙酮酸的合成速度，降低反饋抑制調節；其次是去除丙酮酸的代謝支路，減少丙酮酸消耗。

1.2 乙酰輔酶A代謝途徑改造

乙酰輔酶A是微生物自身代謝中重要的中間體，它既是TCA循環的起始化合物，也是脂肪酸合成的前體。通過丙酮酸鹽，乙酰輔酶A可被轉化為多種化學物質，包括1-丁醇、丁酸酯、S-3-羥基丁酸酯和聚 3-羥基丁酸酯［9-13］。

實現乙酰輔酶A的積累可通過兩種方式，一是調節PDHC的活性，在有氧條件下，PDHC可將丙酮酸轉化為乙酰輔酶A，但是PDHC在缺氧或無氧條件下活性較低，為了解決這個問題，Kim等［14］將編碼PDHC基因中的lpdA基因進行突變（將E354突變成K），使其在缺氧條件下保持活性。Boldt等［15］將肺炎克雷伯桿菌（Klebsiella pneumonia）中的lpdA基因突變（將D354突變成K）后，替換大腸桿菌中的lpdA基因，結果表明基因改造后的大腸桿菌可在氧含量較低的環境中生長，提高了菌體積累乙酰輔酶A的能力。二是代謝途徑中相關基因的過表達。在丙酮酸合成乙酰輔酶A途徑中，過表達PDHC中相關基因（如aceE、aceF、lpdA）已被應用于1-丁醇或脂肪酸的合成［16-17］。Lin等［18］通過過表達乙酰輔酶A合酶acs基因促進了醋酸酯轉化為乙酰輔酶A，并且不影響大腸桿菌的生長。目前用于乙酰輔酶A積累的代謝途徑改造主要是通過提高PDHC活性，促進丙酮酸鹽向乙酰輔酶A的轉化，以及過表達與乙酰輔酶A合成相關的酶，促進碳流流向乙酰輔酶A途徑。

1.3 甲羥戊酸代謝途徑的改造

近年來，甲羥戊酸作為萜類和類胡蘿卜素的前體化合物備受關注，其用于藥物、清潔能源和芳香類化學品具有廣闊的應用前景［19-21］。甲羥戊酸代謝途徑首先以乙酰輔酶A為前體，轉化成甲羥戊酸，再通過三步反應轉化為焦磷酸異戊烯酯（IPP），IPP是合成萜類化合物和類胡蘿卜素的基本結構單元，但是由甲羥戊酸轉化為IPP的代謝途徑不存在于大腸桿菌中，其自身IPP的合成需要以甲基赤蘚糖醇磷酸酯（DXP）作為前體，成為了大腸桿菌合成萜類化合物的主要限制因素。目前對大腸桿菌甲羥戊酸途徑的改造只能通過引入異源代謝途徑，Martin等［19］將黃花蒿（Artemisia annuaLinn）中的紫穗槐二烯合酶ads基因和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的甲羥戊酸代謝途徑關鍵基因進行密碼子優化，在大腸桿菌中構建了一個完整的異源甲羥戊酸代謝途徑，最終生成青蒿素合成的前體物質紫穗槐二烯。Harada等［20］將來自于鏈霉菌的甲羥戊酸途徑克隆到大腸桿菌中，然后轉入a-蛇麻烯合酶基因，檢測到目的產物的生成。Morrone等［21］在大腸桿菌中引入異源的甲羥戊酸代謝途徑，結果表明異源代謝途徑比內源性代謝途徑產生更多的二萜化合物。由于甲羥戊酸是乙酰輔酶A的下游代謝，對大腸桿菌中乙酰輔酶A代謝途徑的改造也可作為提高甲羥戊酸及其衍生物產量的一種策略。

1.4 莽草酸代謝途徑的改造

莽草酸是一種環己烷的羥基化不飽和酸衍生物，具有防止血栓形成、消炎鎮痛等作用，是合成神經氨酸酶抑制劑的關鍵組成部分［22］。大腸桿菌可利用莽草酸產生不同種類芳香族氨基酸，如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等［23］。

對莽草酸途徑的改造方式主要有3種，一是敲除莽草酸激酶基因，莽草酸激酶將莽草酸轉化為3-磷酸莽草酸，敲除該基因可抑制莽草酸向下游代謝的轉化。Draths等［24］通過敲除大腸桿菌中莽草酸激酶基因后，過表達對莽草酸積累有反饋抑制作用的AroF、AroE和AroB基因，避免了莽草酸激酶基因缺失后對菌體生長的影響。二是促進磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和4-磷酸赤蘚糖（E4P）的合成，PEP和E4P是大腸桿菌合成莽草酸的前體，Noda等［25］在大腸桿菌中過表達PEP合成酶ppsA基因和轉酮醇酶tktA基因，提高了PEP和E4P的合成效率。Gosset和Sengupta等［26-27］通過突變pykA和pykf基因，過表達tktA基因，抑制丙酮酸激酶活性和PEP介導的葡萄糖轉運，增加了PEP在大腸桿菌中的可用性，這種方法被用于提高順式-甲基丙烯酸和水楊酸的合成。三是減少副產物，促進反應向莽草酸方向進行，kramer等［22］敲除大腸桿菌中5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因aroA，過表達AroF、AroB和AroL基因，產生的3-磷酸莽草酸有助于推動反應向生成莽草酸的方向進行，同時副產物3-脫氫莽草酸的含量降低。

2 大腸桿菌用于生物燃料的合成

隨著基因工程技術的發展和生物信息資源的日益豐富，微生物可以被改造成所需的工程菌用于多種生物燃料的合成，如1-丙醇、1-丁醇和烴類。1-丙醇是一種重要的化學品，可作為汽油替代品，應用于多種工業產品中［28］。Choi等［29］通過氨基酸生物合成途徑的反饋抑制效應，去除大腸桿菌中的競爭代謝途徑，增強2-酮丁酸酯的合成，隨后引入adhE基因，并刪除一個應激反應基因，改造后的大腸桿菌可分別以葡萄糖和甘油作為碳源合成1-丙醇。Jian等［30］將異源1，2-丙二醇代謝途徑中的關鍵基因，包括丙酮醛合酶mgsA基因、丙二醇脫水酶budC基因、丙酮醛還原酶ydjG基因以及一個ppdABC操縱子，引入大腸桿菌中用于合成1-丙醇。1-丁醇也是一種重要的汽油替代品，傳統的合成方式主要是利用梭狀芽孢桿菌發酵產生［31-33］。大腸桿菌自身合成1-丁醇的能力較弱，Shen等［34］將丙酮丁醇梭菌（Clostri-dium acetobutylicum）的丁酰輔酶A基因和乙酰輔酶A酰基轉移酶基因導入大腸桿菌中，敲除大腸桿菌中復合酸合成相關基因，增強了大腸桿菌合成1-丁醇的能力。烴類也是一種極具潛力的生物燃料。四碳到十二碳的短鏈烴類可作為汽油替代品，十三碳到十七碳的長鏈烴類可作為柴油替代品［35］。將藍藻烷烴生物合成途徑中的酰基載體還原酶AAR基因和醛脫羧酶ADC基因導入大腸桿菌中，可合成十三碳到十七碳的長鏈烴類混合物［36］。

3 大腸桿菌用于砌塊化合物的合成

微生物代謝可產生不同種類的砌塊化合物用于聚合物的合成，如二元羧酸、羥基酸、短鏈二元醇類和二胺類等由微生物的初級代謝產生。已有研究通過基因改造得到合成效率更高的工程菌，但實現商業化生產還需要進一步改進。二元羧酸主要包括琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸、戊二醛、葡萄糖酸、己二酸和3-羧基木糖酸等，其中對琥珀酸合成的研究較多，早期已有研究者將改造后的大腸桿菌應用于有氧、無氧和有氧-無氧3種發酵方式中［37-39］。后續有研究者將有氧條件下合成琥珀酸的代謝系統導入大腸桿菌中，提升了琥珀酸的合成效率。他們將三羧酸循環途徑以及副產物產生途徑改造成乙醛酸循環和三羧酸循環的氧化支路，使得大腸桿菌在能夠保證正常的生長狀態下，有效積累琥珀酸。隨后將谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）中的丙酮酸羧化酶pyc基因在大腸桿菌中過表達，促進草酰乙酸合成并且增強向三羧酸循環氧化支路的離子流，最終提高了大腸桿菌在有氧條件下發酵產生琥珀酸的產量，達到36.1 g/L［40］。

短鏈二醇類是生產聚酯和其他化學品的砌塊化合物，可由微生物自身代謝和改造后的代謝途徑產生多個種類，如1，3-丙二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇和1，3-丁二醇。微生物生產1，4-丁二醇體現了代謝途徑基因改造工程在工業菌株設計上的應用和發展。Boldt等［41］利用代謝途徑識別軟件（SimPheny bioPathway predictor）從一些常用的代謝中間體設計能合成1，4-丁二醇的代謝途徑，再根據代謝途徑的長度、熱力學和產率選擇最佳途徑對大腸桿菌進行改造，隨后又通過生物信息學分析基因組代謝組分和密碼子優化技術，敲除部分基因進一步優化合成途徑，最終1，4-丁二醇的產量可達到18 g/L。本實驗室利用羰基還原酶在大腸桿菌中過表達合成R-1，3-丁二醇，R-1，3-丁二醇的產量為8 g/L。

羥基酸及其手性化合物不僅可用作生產藥物、維生素、抗生素和風味化合物的前體，也可作為生物單體用于合成聚酯。它們包括乳酸、3-羥基丙酸酯、3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯［42-45］。微生物基因工程應用于乳酸的合成較為成功，其中大腸桿菌以葡萄糖或甘油作為碳源過量生產乳酸的研究最具潛力。研究者對大腸桿菌中氧化還原反應的全基因組分析表明，在厭氧條件下，D-乳酸過量產生是由與核苷酸和氨基酸代謝有關的單個脫氫酶基因決定的，如guaB、pyrD和serA。此外，敲除與厭氧轉錄調控有關的guaB、pyrD、serA、fnr、arcA或arcB基因可增強D-乳酸的過量生產［46-48］。

4 總結與展望

本文綜述了大腸桿菌中丙酮酸、乙酰輔酶A、甲羥戊酸、莽草酸4個代謝途徑的改造策略，以及大腸桿菌用于合成生物燃料和砌塊化合物所采用的系統代謝工程策略。已有的研究表明，將系統生物學和合成生物學整合到代謝工程中，在開發能夠高效生產目標化合物的工程菌株方面有巨大的前景。本實驗室利用該策略對大腸桿菌進行改造實現了R-3-奎寧醇的中試生產，該策略也成功用于氨基酸、乳酸、琥珀酸、1，4-丁二醇和1，3-丙二醇的生產。利用改造后的大腸桿菌生產目標化合物仍存在一些需要改進的地方，包括最大限度地提高產物純度、產量和反應效率；在工業化應用時，需要綜合考慮上下游工藝的可操作性和匹配性。系統代謝工程將在減少菌株反應時間、降低反應成本以及生物工藝開發方面發揮越來越重要的作用，最終實現目標化合物的工業化規模生產。