自身免疫性疾病患者檢測PAI-1(4G/5G)，ABCB1(3435T>C)在預防甲強龍治療發生股骨頭壞死風險的應用*

張 瑩，程曉東，胡玉皎，王 昊，周鐵成，郝曉柯

(空軍軍醫大學西京醫院全軍臨床檢驗中心，西安 710032)

糖皮質激素可用于治療多種自身免疫性疾病，但糖皮質激素沖擊治療或長期使用可能導致的股骨頭壞死會給患者帶來更大的痛苦，怎樣合理有效的使用激素沖擊治療顯得尤為重要。隨著基因概念的提出和化學藥物用藥的深入研究，大量的研究表明由于基因存在的多態性導致同一藥物對不同人群及個體所產生的效果和反應不同，而導致部分患者出現嚴重的不良反應。甲強龍的耐藥位點PAI-1(4G/5G) 是纖溶酶原激活物抑制劑的效應分子，PAI-1(4G/5G)的突變與心腦血管疾病的發生有關[1-2]，與深靜脈血栓的形成有關[3]，也有文獻報道，PAI-1(4G/5G)的突變可導致股骨頭壞死的發生[4-5]。甲強龍的耐藥位點ABCB1(3435T>C) 是糖皮質激素的藥物轉運體，ABCB1(3435T>C)的突變會導致藥物轉運及代謝障礙[6]。使用激素甲強龍治療的患者，這兩個耐藥位點基因的突變將會給患者帶來嚴重的后果，有必要在用藥前給患者做相應的化學藥物耐藥位點檢測。

本文使用數字熒光檢測儀和熒光染色原位雜交技術，實現小片段測序和SNP分型，檢測甲強龍耐藥位點PAI-1(4G/5G) 和ABCB1(3435T>C)，根據不同患者的基因型特性進行合理用藥，達到提高藥效、降低毒性和減少不良反應發生的效果，為甲強龍藥物使用的患者提供精準的用藥指導。

1材料與方法

1.1 研究對象 我院2016年8月～2018年1月接受甲強龍耐藥位點PAI-1(4G/5G) 和ABCB1(3435T>C)檢測的患者94例(其中天皰瘡類疾病患者39例，皮肌炎類患者30例，系統性紅斑狼瘡患者25例)，男性37例，女性57例，平均年齡43.69±11.49歲。

1.2 試劑和儀器 試劑：10×NH4Cl預處理液，處理血液樣本時用于裂解紅細胞；耀金保(核酸純化試劑)，用于在進行SNP分析前保存標本；耀金分(測序反應通用試劑盒)，用于數字熒光分子雜交、化學藥物用藥指導時的樣本分析；軟件設定液，用于制備標準曲線；陽性對照監測儀器是否在控。以上試劑均由北京華夏時代基因科技發展有限公司提供。儀器：TL998A熒光檢測儀(西安天隆科技有限公司提供)。

1.3 方法

1.3.1 血液樣本：2～3 ml靜脈全血(不需空腹)，使用一次性真空采血管(EDTA抗凝紫帽管)采集，于4℃低溫保存，保存時間不宜超過24 h。

1.3.2 標本前處理：在1.5 ml離心管中加入1.0 ml 1×NH4Cl預處理液，吸取200 μl混勻的全血，室溫靜置5 min，待紅細胞完全破裂，液體顏色變為澄清的紅色后3 000 r/min離心5 min。將上層透明紅色液體吸取干凈，向管底富集的白細胞團塊中加入30 μl耀金保使白細胞的胞膜破裂。充分混勻，為了更好的使細胞核內的核酸游離出來，室溫靜置30～60 min，等待檢測。

1.3.3 檢測過程：樣本檢測：吸取1.5 μl處理后的白細胞樣本加到相應的試劑中上機檢測。陽性對照：吸取1.5 μl的陽性質控品分別加到對應的軟件設定液中。陰性對照：吸取1.5 μl耀金保保存液，加到試劑中。

1.3.4 質控結果分析：陰性對照用以監測實驗室和前處理過程中是否存在污染，檢出結果應為“重測”；陽性對照用以監測實驗能否正常檢出陽性標本，檢出結果應為陽性質控品的基因型。

1.4 統計學分析 收集、記錄相關數據，錄入SPSS 19.0 統計學軟件對數據進行分析和相關處理，定性資料以百分率(%)表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 甲強龍化學藥物基因位點檢測結果 PAI-1(4G/5G)位點檢測結果為5G5G的患者20人，占總人數的21.28%；檢測結果為4G5G的患者43人，占總人數的45.74%；檢測結果為4G4G的患者31人，占總人數的32.98%。ABCB1(3435T>C) 位點檢測結果為TT的患者17人，占總人數的18.09%；檢測結果為TC的患者44人，占總人數的46.81%；檢測結果為CC的患者33人，占總人數的35.10%。激素甲強龍化學藥物兩個耐藥位點間檢測結果對于評估股骨頭壞死的風險度差異無統計學意義(χ2=6.855，P=0.142)。

2.2 激素甲強龍化學藥物各個基因位點檢測結果風險度分布情況 對于PAI-1(4G/5G)基因，激素甲強龍沖擊治療引起股骨頭壞死高風險的基因型是4G5G/4G4G，占78.72%(74/94)，5G5G基因型為低風險基因占21.28%(20/94)；對于ABCB1(3435T>C)基因，CC基因型為高風險基因，占35.10%(33/94)，TT/TC基因型為低風險基因，占64.90%(61/94)。

PAI-1(4G/5G)和ABCB1(3435T>C)基因均為高風險基因型時，患者進行激素甲強龍沖擊治療時引起股骨頭壞死的風險為高風險；PAI-1(4G/5G)和ABCB1(3435T>C)基因有一個為高風險基因型時，患者進行激素甲強龍沖擊治療時引起股骨頭壞死的風險為中等風險；PAI-1(4G/5G)和ABCB1(3435T>C)基因均為低風險基因型時，患者進行激素甲強龍沖擊治療時引起股骨頭壞死的風險為低風險。

故激素甲強龍的用藥情況，12.77%(12/94)的患者進行激素甲強龍沖擊治療時引起股骨頭壞死的風險為低風險；60.63%(57/94)的患者進行激素甲強龍沖擊治療時引起股骨頭壞死的風險為中等風險，在進行治療時需要關注骨骼反應；但是還有26.60%(25/94)的患者進行激素甲強龍沖擊治療時引起股骨頭壞死的風險是高風險，需高度關注骨骼反應，同時配伍用雙膦酸鹽，降低激素劑量并換用其他藥物，也可使用阿司匹林等藥物進行治療降低風險。

3討論糖皮質激素沖擊治療可用于治療系統性紅斑狼瘡、全身性皮肌炎(多發性肌炎)、天皰瘡、嚴重的多形紅(Stevens-Johnson綜合征)、剝脫性皮炎、大皰疹性皮炎、嚴重的脂溢性皮炎、嚴重的銀屑病、蕈樣真菌病、蕁麻疹等皮膚病。但是激素沖擊治療或長期使用可能導致的股骨頭壞死會給患者帶來更大的痛苦，合理有效的使用激素治療顯得尤為重要。隨著精準醫療概念的提出，化學藥物用藥的深入研究，發現基因多態性的存在，導致同一藥物對不同人群及個體所產生的效果和反應不同，導致部分患者出現嚴重的不良反應。

甲強龍的耐藥基因PAI-1(4G/5G) 是纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor，PAI)-1的效應分子，PAI-1是血漿纖溶系統中主要的一種抑制物，可以控制和降低纖溶系統的活性，通過PAI-1的調節作用，維持纖溶系統的動態平衡，才能保持血漿纖溶活性。因此，血液循環中PAI-1水平異常，就容易誘發血栓形成[7-8]。股骨頭本身血液供應有限，如并發血栓風險則會大大提升壞死風險。PAI-1(4G/5G) 基因突變，血漿纖溶活性降低，血栓形成，股骨頭血液供應減少，股骨頭壞死風險提高[9-10]。

甲強龍的另一個耐藥基因ABCB1(3435T>C) 是多耐藥基因1的3435位點，是糖皮質激素藥物轉運體。ABCB1位于第7號染色體長臂上，含29個外顯子，位于26號外顯子C3435T位置的許多個單核苷酸多態性SNP位點最被廣泛研究。內源性及外源性的糖皮質激素均是P-gp的轉運底物，CROWE等[11]研究顯示，在Caco-2細胞株中，激素向細胞內的滲透受P-gp的限制，ABCB1基因的敲除或表達降低，均使組織或細胞內激素的濃度降低。GONG等[12-13]對ABCB1(3435T>C)基因多態性與糖皮質激素性股骨頭壞死的研究進行了分析，結果顯示C等位基因增加了糖皮質激素誘導股骨頭壞死的相關性，我國學者也做了類似的研究。

本文研究結果顯示，根據激素甲強龍PAI-1(4G/5G) 和ABCB1(3435T>C) 2個耐藥位點對患者進行糖皮質激素沖擊治療時風險的評估是一致的。根據2個耐藥位點對風限度的評估，12.77%的患者進行激素甲強龍沖擊治療時引起股骨頭壞死的風險為低風險，60.63%的患者進行激素甲強龍沖擊治療時引起股骨頭壞死的風險為中度風險，在進行治療時需要關注骨骼反應，一旦有不良反應征象，即配伍用雙膦酸鹽，而26.60%的患者進行激素甲強龍沖擊治療時引起股骨頭壞死的風險為高風險，這些患者進行激素甲強龍沖擊治療時需高度關注骨骼反應，同時配伍用雙膦酸鹽，降低激素劑量并換用其他藥物，也可使用阿司匹林等藥物進行治療降低風險。實驗數據顯示在進行激素甲強龍沖擊治療前給患者作甲強龍化學藥物基因檢測，根據檢測結果合理精準用藥，可以使26.60%的患者避免股骨頭壞死風險的出現，為患者提供安全的用藥指導。