CHI3L1通過激活TGF-β信號通路促進肝細胞肝癌進展及分子機制

李曉文　王后紅　黃海　劉殿雷

[摘要] 目的 觀察CHI3L1對肝細胞肝癌Huh7增殖、遷移、侵襲的影響及其分子機制。 方法 通過脂質體轉染，觀察CHI3L1對Huh7增殖、遷移、侵襲的影響。通過染色質免疫共沉淀、Western blot觀察CHI3L1對TGF-β信號通路的作用機制。 結果 轉染CHI3L1后，Huh7細胞增殖率顯著高于空載組及空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。轉染CHI3L1后，遷移、侵襲至下層細胞數均顯著多于空載組、空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。轉染CHI3L1后，TGF-β刺激后形成的Smad2/3/4復合物增加，CHI3L1促進TGF-β誘導下Smads復合物的形成。轉染CHI3L1后的Huh7細胞對TGF-β刺激上調p53非依賴的細胞周期抑制因子p21、p15，下調c-myc，抑制Rb磷酸化，上調NOX4;TGF-β抑制劑LY364947可抑制此誘導效應。 結論 CHI3L1可促進肝細胞肝癌增殖、遷移、侵襲，這種作用可能通過激活TGF-β信號通路實現。

[關鍵詞] CHI3L1;TGF-β;增殖;遷移;侵襲

[中圖分類號] R735.7? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）34-0031-04

Study on CHI3L1 promoting the progression of hepatocellular carcinoma by activating TGF-β signaling pathway and the molecular mechanisms

LI Xiaowen1? ?WANG Houhong2? ?HUANG Hai1? ?LIU Dianlei1

1.Department of First Surgery， Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou? ?310006， China; 2.Department of General Surgery， the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University， School of Medicine， Hangzhou 310006， China

[Abstract] Objective To observe the effect of CHI3L1 on the proliferation， migration and invasion of hepatocellular carcinoma Huh7 and its molecular mechanism. Methods The effect of CHI3L1 on the proliferation， migration and invasion of Huh7 were observed by lipofection. The mechanism of CHI3L1 on TGF-β signaling pathway was observed by chromatin immunoprecipitation and Western blot. Results After transfection of CHI3L1， the proliferation rate of Huh7 cells was significantly higher than that of the empty vector group and the blank control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. After transfection of CHI3L1， the number of migration and invasion to the lower layer was significantly higher than that of the empty vector group and the blank control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. After transfection of CHI3L1， the Smad2/3/4 complex formed by TGF-β stimulation increased， and CHI3L1 promoted the formation of Smads complex induced by TGF-β. Huh7 cells transfected with CHI3L1 up-regulated TGF-β-induced p53-independent cell cycle inhibitors p21 and p15， down-regulated c-myc， inhibited Rb phosphorylation， up-regulated NOX4， and TGF-β inhibitor LY364947 inhibited this induction effect. Conclusion CHI3L1 can promote the proliferation， migration and invasion of hepatocellular carcinoma， which may be achieved by activating the TGF-β signaling pathway.

[Key words] CHI3L1; TGF-β; Proliferation; Migration; Invasion

CHI3L1即殼多糖酶-3樣蛋白1，又稱YKL-40，為最初在人骨肉瘤細胞系體外培養中發現的蛋白，定位于人1號染色體q32[1];CHI3L1屬糖基水解酶18家族，為結締組織細胞重要的生長因子，在血管內皮細胞的遷徙移動中具有重要作用，參與細胞增殖、分化、組織重塑[2]。CHI3L1最初認為與炎癥性疾病存在密切關系，在炎癥性腸病、支氣管哮喘中均具有一定的生物學作用[3，4]。近年來研究發現[5，6]，CHI3L1在腫瘤中呈高表達，為人類多種惡性腫瘤的不良預后因素。Zhou Y等[7]報道CHI3L1在肝細胞肝癌中存在表達，但CHI3L1在肝細胞肝癌的發生、發展中的具體機制研究尚少。本研究通過構建CHI3L1表達載體，觀察CHI3L1對肝細胞肝癌（HCC）細胞增殖、遷移、侵襲的影響，并探討其分子機制，為臨床分子靶向治療提供新的理論指導，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞標本

肝細胞肝癌細胞Huh7購自上海中科院細胞庫。以10%胎牛血清，100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養液，于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，細胞生長融合至80%～90%時傳代。

1.2 主要試劑與儀器

Trizol試劑（Thermo Fisher公司），Titan One Tube RT-PCR Kit試劑盒（sigma-aldrich公司），PowerUpTM SYBRTM Green試劑盒（Thermo Fisher公司），ECL試劑盒（Biovision公司），PVDF膜（Millipore公司），HRP-羊抗兔IgG（Abcam公司，ab6721），兔抗人CHI3L1多克隆抗體（Abcam公司，ab77528），兔抗人TGF-β1多克隆抗體（Abcam公司，ab64715），兔抗β-actin多克隆抗體（Abcam公司，ab151526），TGF-β1受體抑制劑LY364947（MedCemExpress公司）;熒光定量PCR儀（Bio-Rad CFX96 PCR System），凝膠電泳圖像掃描分析儀（GE Image scanner Ⅲ），化學發光分析儀（美國Thermo Luminoskan Ascent），酶標儀（美國Thermo Multiskan FC）。

1.3 研究方法

1.3.1 Western-blot? 離心管柱及接收套管置于冰上預冷，將預冷的PBS加入培養板，清洗貼壁細胞，吸去上清。6孔板每孔加入200 μL單混有蛋白酶抑制劑的去污劑裂解液裂解組織，置于冰上操作。裂解30 min后，將裂解液轉移至1.5 mL EP管中，4℃ 12000 rpm/min離心5 min，取上清分裝于0.5 mL離心管，-20℃保存。以BCA法檢測蛋白濃度。將蛋白樣品加10×上樣緩沖液，水浴煮沸5 min。以每孔30 μg蛋白的上樣量行聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒壓80 V，溴酚藍進入分離膠后調整電壓為120 V繼續電泳，至溴酚藍遷移至分離膠底部，終止電泳。以4℃，300 mA恒流，70 min，將蛋白轉移至PVDF轉膜上，麗春紅染色觀察轉膜效果。5%BSA封閉PVDF膜2 h，洗滌后，滴加兔抗XBP-1溶液，4℃過夜孵育。第2天加入TBST洗滌去除多余一抗，與HRP標記的二抗室溫孵育2 h。TBST清洗后，加入ECL化學發光底物，在化學發光儀上顯影，拍照保存。

1.3.2 CHI3L1對Huh7細胞增殖的影響? ?pcDNA3.1-CHI3L1質粒構建參考文獻[8]。將處于對數生長期的人肝細胞肝癌細胞Huh7，以胰酶消化后，用RPMI-1640培養基調整細胞濃度至1×105個/mL，每孔100 μL接種至96孔板。將細胞分為3組，pcDNA3.1空載組、pcDNA3.1-CHI3L1組、未加質粒的空白對照組。每組在培養的0 、24 、48 h加入CCK8溶液，每孔20 μL，4 h后終止培養。以酶標儀在450 nm處檢測各孔吸光度值。

1.3.3 Transwell試驗檢測遷移、侵襲能力? 遷移試驗：以0.2%BSA的無血清RPMI-1640培養基重懸制備單細胞懸液，細胞數為5×105個/mL，取200 μL鋪于8 μm Transwell小室上層，加500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基于24孔板底部，培養24 h后取走Transwell板，計數穿孔細胞數。侵襲試驗：將300 μL無血清RPMI-1640培養基加入8 μm Transwell小室上層，室溫下水化基質膠20 min，棄去剩余液體。以0.2%BSA的無血清RPMI-1640培養基配制濃度5×105個/mL的單細胞懸液，其余步驟同遷移試驗。

1.3.4 染色質免疫共沉淀? 取1×107細胞，棄去培養基，以PBS洗滌3次。加入預冷的RIPA裂解液1 mL，4℃裂解30 min。細胞刮子收集裂解產物，轉入1.5 mL EP管中。14000 g離心15 min，收集上清。BCA法進行蛋白定量。取500 μg蛋白，加共沉淀抗體，4℃過夜。孵育后在蛋白中加入30 μL proteinA/G，4℃搖床孵育4 h。1000 g離心5 min，棄去上清。取800 μL預冷的RIPA裂解液洗滌瓊脂糖珠復合物，1000 g離心5 min，重復3次。以40 μL，2×蛋白上樣緩沖液重懸珠子，沸水浴5 min。后續步驟同Western blot。

1.4 統計學方法

統計學分析采用SPSS22.0統計學軟件，計量資料以均數±標準差（x±s）描述，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CHI3L1對Huh7細胞增殖的影響

轉染CHI3L1 24 h后，pcDNA3.1-CHI3L1組Huh7細胞增殖率顯著高于空載組及空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 CHI3L1對Huh7細胞遷移、侵襲的影響

轉染CHI3L1后，pcDNA3.1-CHI3L1組遷移、侵襲至下層細胞數均顯著多于空載組、空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 CHI3L1促進TGF-β誘導下Smads復合物的形成

轉染CHI3L1后，TGF-β刺激后形成的Smad2/3/4復合物增加，提示CHI3L1促進TGF-β誘導下Smads復合物的形成。見圖1。

2.4 CHI3L1激活TGF-β信號通路的分子機制

轉染CHI3L1后的Huh7細胞對TGF-β刺激上調p53非依賴的細胞周期抑制因子p21、p15，下調c-myc，抑制Rb的磷酸化，上調NOX4;TGF-β抑制劑LY364947可抑制此誘導效應。見圖2。

3討論

原發性肝細胞肝癌為惡性程度較高的腫瘤之一，患者早期臨床癥狀不明顯，臨床檢查發現時，多數患者已失去徹底根治的機會[9]。肝癌患者術后高復發率、高病灶轉移率為影響肝癌患者預后的主要因素，使肝癌的總體療效仍不理想，成為嚴重危害人類健康的重要疾病之一[10]。探討肝癌復發、轉移潛在的分子機制成為肝癌治療的關鍵所在。

CHI3L1即殼多糖酶-3樣蛋白1，為哺乳動物殼多糖酶家族中的成員，在血管內皮細胞的遷徙移動中發揮重要的作用[11]。由于腫瘤細胞的無限增殖為腫瘤生長、遷移、侵襲的前提條件，腫瘤轉移至遠處器官后，最終可導致多器官受累，加速患者死亡[12]。研究顯示[13]CHI3L1在腫瘤的轉移復發中起重要作用;Chen Y等[14]研究發現巨噬細胞通過分泌CHI3L1促進胃癌、乳腺癌的轉移;Ngernyuang N等[5]研究發現CHI3L1可促進宮頸癌新生血管的形成，靶向CHI3L1可能是一種降低宮頸癌轉移率的新型治療手段[15]。由此猜想CHI3L1在肝癌細胞中也有類似作用，本研究通過脂質體法構建過表達CHI3L1的Huh7細胞，發現CHI3L1可促進Huh7細胞增殖、遷移、侵襲，與預期一致。

在肝細胞肝癌發生、發展中，多種信號通路的激活、異常表達具有重要的作用，這些信號通路包括：VEGFR、TGF-β、MAPK、EGFR等[16，17]。TGF-β為誘導EMT轉化的生長因子，在肝細胞肝癌中可通過上調結締組織生長因子表達水平，促進SMMC-7721細胞的遷移及侵襲[18]。在肝癌中TGF-β通路的功能較復雜，在高分化、侵襲力低的肝癌細胞中TGF-β通路激活早期應答基因，表現出抑癌效應。在低分化、侵襲力強的肝癌細胞中TGF-β激活晚期應答基因，表現出促癌效應，且由于TGF-β誘導的促癌行為主要通過TGF-β調控的非Smad通路激活引起，在TGF-β刺激下，CHI3L1可促進Smads復合物形成及TGF-β信號通路激活。本研究對過表達CHI3L1的Huh7細胞給予TGF-β刺激后，發現Smads復合物合成增加，提示CHI3L1可促進TGF-β誘導下Smads復合物的形成，從而促進Huh7細胞增殖、遷移和侵襲。p21、p15是常見的抑癌基因，其編碼蛋白可與周期素依賴性蛋白激酶4結合，抑制Rb磷酸化，從而抑制細胞DNA的合成，最終下調細胞增殖活性;c-myc是永生性細胞的原癌基因，石永英等[19]研究表明TGF-β可抑制c-myc活化，并促進Smads復合物的形成，啟動p21、p15的轉錄，抑制細胞增殖。NOX4是體內產生氧自由基的主要酶類，Ma Y等[20]研究顯示TGF-β可能介導NOX4參與人臍靜脈內皮細胞凋亡過程。本研究對過表達CHI3L1的Huh7細胞給予TGF-β刺激，發現p21、p15及NOX4表達顯著上調，c-myc、抑制Rb磷酸化顯著下調，且添加TGF-β阻斷劑LY364947后可抑制上述誘導效應，提示CHI3L1可激活TGF-β信號通路，并影響下游分子表達，從而促進Huh7細胞增殖，并抑制Huh7細胞的凋亡。

綜上所述，CHI3L1可促進肝細胞肝癌增殖、遷移、侵襲，具體分子途徑為：①促進Smads復合物的形成，促進Huh7細胞增殖、遷移和侵襲;②激活TGF-β下游通路，促進Huh7細胞增殖、抑制其凋亡。后期還可繼續應用動物模型深入研究。

[參考文獻]

[1] Rathcke CN，Holmkvist J，Husmoen L LN，et al. Association of polymorphisms of the CHI3L1 gene with asthma and atopy：A populations-based study of 6514 Danish adults[J]. Plos One，2009， 4（7）：e6106.

[2] Dai QH，Gong DK. Association of the polymorphisms and plasma level of CHI3L1 with Alzheimer's disease in the Chinese Han population：A case-control study[J]. Neuropsychobiology，2019，77（1）：29-37.

[3] Buisson A，Vazeille E，Minetquinard R，et al. Faecal chitinase 3-like 1 is a reliable marker as accurate as faecal calprotectin in detecting endoscopic activity in adult patients with inflammatory bowel diseases[J]. Aliment Pharmacol Ther，2016，43（10）：1069-1079.

[4] 李琎，曲書強. CHI3 L1基因與哮喘及其嚴重程度的關系[J]. 國際遺傳學雜志，2016，39（5）：282-285.

[5] Ngernyuang N，Shao R，Suwannarurk K，et al. Chitinase 3 like 1（CHI3L1） promotes vasculogenic mimicry formation in cervical cancer[J]. Pathology，2018，50（3）：293-297.

[6] 謝而付，蔣理，凌蕓，等. 血清CEA、CA19-9和CHI3L1在胰腺癌患者中的診斷價值比較[J]. 實用醫學雜志， 2018，34（2）：309-311.

[7] Zhou Y，He CH，Yang DS，et al. Galectin-3 interacts with the CHI3L1 axis and contributes to hermansky-pudlak syndrome lung disease[J]. J Immunol，2018，200（6）：2140-2153.

[8] Libreros S，Garcia-Areas R，Iragavarapu-Charyulu V. CHI3L1 plays a role in cancer through enhanced production of pro-inflammatory/pro-tumorigenic and angiogenic factors[J]. Immunologic Research，2013，57（1-3）：99-105.

[9] Dezman K，Korosec P，Rupnik H，et al. SPINK5 is associated with early-onset and CHI3L1 with late-onset atopic dermatitis[J]. Int J Immunogenet，2017，44（5）：212-218.

[10] Jingjing Z，Nan Z，Wei W，et al. MicroRNA-24 Modulates Staphylococcus aureus-Induced Macrophage Polarization by Suppressing CHI3L1[J]. Inflammation，2017， 40（3）：995-1005.

[11] Luo D，Chen H，Lu P，et al. CHI3L1 overexpression is associated with metastasis and is an indicator of poor prognosis in papillary thyroid carcinoma[J]. Cancer Biomark，2017，18（3）：273-284.

[12] Usemann J，Frey U，Mack I，et al. CHI3L1 polymorphisms，cord blood YKL-40 levels and later asthma development[J]. BMC Pulm Med，2016，16（1）：81-90.

[13] Libreros S，Garciaareas R，Shibata Y，et al. Induction of proinflammatory mediators by CHI3L1 is reduced by chitin treatment：Decreased tumor metastasis in a breast cancer model[J]. International Journal of Cancer，2012， 131（2）：377-386.

[14] Chen Y，Zhang S，Wang Q，et al. Tumor-recruited M2 macrophages promote gastric and breast cancer metastasis via M2 macrophage-secreted CHI3L1 protein[J]. Journal of Hematology & Oncology，2017，10（1）：36-48.

[15] 竇嫻靜.宮頸癌組織中CHI3L1蛋白表達及其臨床意義[J].四川解剖雜志，2018，26（2）：33-35.

[16] Szychlinska MA，Trovato FM，Di Rosa M，et al. Co-expression and Co-localization of cartilage glycoproteins CHI3L1 and lubricin? in osteoarthritic cartilage： Morphological，immunohistochemical and gene expression profiles[J]. Int J Mol Sci，2016，17（3）：359-387.

[17] Abd EA，Sadik NA，Shaker OG，et al. Are SMAD7 rs4939827 and CHI3L1 rs4950928 polymorphisms associated with colorectal cancer in Egyptian patients？[J]. Tumour Biol，2016，37（7）：9387-9397.

[18] Kainulainen H. CHI3L1-a novel myokine[J]. Acta Physiol（Oxf），2016，216（3）：260-261.

[19] 石永英，盧俊江，陳廣原，等. p15與c-Myc在TGF-β1誘導的大鼠心肌細胞肥大中的表達及與TGF/Smad信號通路的關系[J]. 中國動脈硬化雜志，2018，26（3）：245-252.

[20] Ma Y，Li W，Yin Y，et al. AST IV inhibits H2O2-induced human umbilical vein endothelial cell apoptosis by suppressing Nox4 expression through the TGF-β1/Smad2 pathway[J].International Journal of Molecular Medicine，2015，35（6）：1667-1674.

（收稿日期：2019-03-18）