不同倍性虹鱒紅細胞規格及血液學指標的比較?

陳落落， 溫海深， 李吉方， 張美昭， 車德釗， 辛苑茹

(海水養殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)，山東 青島 266003)

生物體一般為二倍體，在自然或人工誘導條件下，染色體組會成倍地增加產生多倍體，魚類多倍體現象比較普遍，有相當數量的三倍體、四倍體等天然多倍體魚類的存在。多數三倍體魚類不育，可將能量全部用于體細胞生長，從而提高餌料轉化率，表現出較好的生長勢能。虹鱒(Onchorynchusmykiss)屬于鮭形目(Salmoniformes)鮭科(Salmonidae)大馬哈魚屬(Onchorynchus)[1]。因其性成熟個體體側有一條寬而鮮艷的彩虹帶而得名，英文名為rainbow trout，原產于北美地區，為典型的冷水性魚類，是世界性重要經濟養殖魚類之一和水產遺傳育種領域的重要研究對象[2]。我國于1959年引進虹鱒，由于長期的近親繁殖以及缺乏系統的選育，導致養殖個體出現了性早熟、個體小型化、病害頻發等問題，不能滿足消費者對大規格虹鱒的需求，已成為虹鱒養殖業的瓶頸。因此，進行虹鱒三倍化的誘導成為了解決虹鱒養殖規格問題的關鍵。

三倍體虹鱒相比于普通二倍體，細胞核內多了一套染色體組，有相關研究表明，三倍體虹鱒紅細胞各項數值都高于二倍體[3]。在山女鱒(Oncorhynchusmasou)中也發現了類似的結果，三倍體山女鱒紅細胞的長度和寬度分別較二倍體細胞大24%和19%[4]。在團頭魴(Megalobramaamblycephala)中，三倍體紅細胞和核體積分別是二倍體的1.40和1.51倍[5]。三倍體虹鱒紅細胞由于染色體組的增加，相應地紅細胞體積較二倍體大。由此通過觀察測量虹鱒紅細胞大小可以作為鑒定虹鱒倍性的一種簡便、快速、經濟的方法。

許多研究表明，魚類的不同倍性對其各個組織都具有一定的影響。在湖鱒(Salmotruttalacustris)的研究中發現，三倍體湖鱒的腎、鰓、腸、脾等組織結構出現了顯著的變化[6]。對其血液學指標也有顯著影響，在黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[7]、鯽(Carassiusauratus)[8]的研究中發現，由于魚類倍性的增加，血液中紅細胞數目、紅細胞壓積也隨之降低，以保證血紅蛋白含量維持在一定的水平。魚類的血液指標始終處于動態平衡中，直接反映了魚類的內分泌水平和代謝情況[9]。影響魚類血液生理生化指標的因素大致可以分為內源因子和外部環境因子兩類。內源因子與魚類的遺傳生理狀況相關，決定了魚類的血液生理生化特性，并控制著魚類正常血液生理生化指標的范圍[10]。魚類的多倍性改變了其染色體組成，可能作為一種內源因子改變血液生理生化的指標。本實驗采用靜水壓法誘導虹鱒受精卵獲得三倍體，通過流式細胞儀進行倍性鑒定，并對二倍體和三倍體虹鱒的紅細胞及其核的大小、部分血液學指標進行測定，比較其差異性，以豐富多倍體魚類生理學研究內容，并為血液學方法鑒定魚類多倍體提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用二倍體虹鱒采用常規人工繁殖方法獲得，三倍體虹鱒于2016年采用靜水壓法獲得，二、三倍體虹鱒魚均來源于同一批卵。二、三倍體虹鱒分別飼養于山東省濰坊市臨朐玉福淡水漁業合作社，養殖水溫為(14±1)℃，pH=7.8。每天早晚各投喂冷水魚專用配合飼料一次，取樣前停食24 h。隨機選取15尾健康無傷、1.5齡未知倍性的實驗組虹鱒和3尾二倍體虹鱒作對照，通過流式細胞儀測定其相對DNA含量的方法對其進行倍性檢測，經鑒定15尾實驗組魚中有2尾為二倍體，其余為三倍體。選取實驗組中的2尾二倍體和對照組的3尾共計5尾普通二倍體虹鱒，平均體長(37.3±3.1) cm,平均體重(0.97±0.20) kg，隨機挑選5尾三倍體虹鱒，平均體長(34.7±4.8) cm,平均體重(0.84±0.29) kg，抽取血液進行生理生化指標檢測。

1.2 實驗方法

1.2.1 血樣采集 用內壁涂有抗凝劑的注射器從虹鱒尾動脈(或靜脈)取血，每尾魚取1 mL的抗凝血，抗凝劑為15 g/L的EDTA-Na2，抗凝劑與血液的體積比為1∶10，取完血后輕輕搖勻，4 ℃保存，用于血液生理相關指標測定。

不加抗凝劑的血樣直接放入普通1.5 mL EP管中，每尾魚取血3 mL，0～4 ℃靜置4～6 h，高速離心機12 000 r/min離心10～15 min后，取上清液，液氮冷凍，置于-80 ℃冰箱凍存，用以測定血液生化指標。

1.2.2 相對DNA含量的檢測 采用流式細胞儀(Beckman Coulter FC500M)于波長488 nm下測定實驗組和對照組個體的DNA含量。具體方法如下：

①單細胞懸液的制備：將每尾魚的抗凝血搖勻，使用移液槍分別吸取10 μL血液，加入到1 mL 0.01 mol/L的PBS緩沖溶液中(pH為7.2～7.4)，搖勻，3 000 r/min，離心10 s，洗滌血細胞，倒掉PBS，再加入1mL的PBS，混勻。

②單細胞懸液的固定：使用一次性塑料吸管吸取單細胞懸液，緩慢滴加到3mL預冷的無水乙醇中，4 ℃過夜保存(至少固定3h)。

③染色：將收集到的細胞懸液2 000 r/min離心10 min，棄上清液，PBS洗滌2次,顯微鏡下將細胞濃度調至1×106個/mL，加入20 μL，50 μg/mL的RNA酶，30 min后再加入20～50 μL，1 g/L的PI染液，置于4 ℃冰箱中染色30 min，使用300目篩絹過濾。

④上機檢測，每個樣本檢測的細胞數目>104個，測量所得的數據和結果由計算機進行處理。

1.2.3 紅細胞胞體及紅細胞核大小的測量

①將血液樣本混勻，吸取10 μL血液置于載玻片上，制作血細胞涂片，自然干燥。

②滴加瑞氏-吉姆薩染液2～3滴覆蓋整個標準涂片，染色1～2 min。滴加等量的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH為6.4～6.8)，輕輕晃動玻片，與瑞氏-吉姆薩染液充分混勻，染色3～5 min。

③水洗、吸干、鏡檢。染色后胞漿和胞核的染色清晰分明，細胞核著色呈深淺不同的紫紅色，胞漿呈淺紅色，胞漿中顆粒區分明顯。

④在顯微鏡下拍照，分別測量紅細胞胞體與細胞核的長軸和短軸，每個樣本測量10個紅細胞，取平均值，根據公式：體積V=a2b/1.91；表面積S=πab/4，式中，a為胞核長軸，b為胞核短軸，計算得到紅細胞胞體及其核的體積與表面積。

1.2.4 血液生理指標的測定 血液生理指標白細胞、紅細胞及血紅蛋白等采用BC-1800全自動血液細胞分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)測定。其原理是用電阻抗法對血細胞進行計數。

1.2.5 血液生化指標的測定 血液生化指標采用BS-1800全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)測定，不同指標使用不同的試劑盒測定(邁瑞公司生產)。

1.2.6 血清滲透壓的檢測 血清滲透壓采用蒸汽壓滲透壓計(Vapro5520)測定，隨機選取二倍體和三倍體虹鱒各5尾進行血清滲透壓的測定，每尾魚測定2次，每次使用血清的量為10 μL。

1.3 數據處理

實驗數據用平均值±標準差表示，采用SPSS13.0軟件進行統計，運用單因素方差分析，先進行方差齊性檢驗，不滿足方差齊性時，對數據進行自然對數或平方根轉換，然后采用Duncan 多重比較檢驗數據差異的顯著性，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 相對DNA含量的檢測

使用流式細胞儀測定實驗組15尾和對照組3尾虹鱒紅細胞的DNA含量，對照組熒光值為310±5(見圖1)，三倍體虹鱒為437±13(見圖2)，二者比值為1.4，與理論值1.5相近，15尾中有2尾為二倍體。

圖1 二倍體虹鱒流式細胞儀檢測結果

圖2 三倍體虹鱒流式細胞儀檢測結果

2.2 二倍體和三倍體虹鱒紅細胞大小的比較

如表1所示，三倍體虹鱒紅細胞長軸為二倍體的1.25倍，極顯著地大于二倍體(P<0.01)，紅細胞短軸略大于二倍體，為二倍體的1.20倍，二者差異極顯著(P<0.01)，但三倍體虹鱒紅細胞長軸與二倍體的比率要大于短軸，所以三倍體紅細胞形狀與二倍體紅細胞存在較為明顯的差異，所以在顯微鏡下觀察到的三倍體紅細胞更大、更長(見圖3)，與三倍體紅細胞相比，二倍體紅細胞呈現出小而圓的橢球形(見圖4)。三倍體虹鱒紅細胞體積極顯著地大于二倍體(P<0.01)，為二倍體的1.84倍，紅細胞面積極顯著大于二倍體(P<0.01)，為二倍體的1.49倍。三倍體虹鱒紅細胞核明顯大于二倍體，三倍體虹鱒紅細胞核的長軸、短軸、面積、體積等各項數值分別為二倍體虹鱒的1.42、1.20、1.70、2.39倍，差異極顯著(P<0.01)。

表1 二倍體和三倍體虹鱒紅細胞及其細胞核大小比較

注：**表示差異極顯著(P<0.01)；*表示差異顯著(P<0.05),下同。

Note:**denotes extremely significant difference at 0.01 level,*denotes significant difference at 0.05 level，the same below.

①Items；②Triploid；③Diploid；④Long axis of RBC；⑤Short axis of RBC；⑥RBC area；⑦MCV；⑧Long axis of RBC nucleus；⑨Short axis of RBC nucleus；⑩RBC nucleus area；RBC nucleus volume

圖3 三倍體虹鱒紅細胞(40×10)

圖4 二倍體虹鱒紅細胞(40×10)

2.3 二倍體和三倍體虹鱒血液生理指標的比較

如表2所示，三倍體虹鱒血液中紅細胞數目極顯著地少于二倍體(P<0.01)，為二倍體的0.26倍，同樣，三倍體虹鱒血液紅細胞壓積極顯著地低于二倍體(P<0.01)，為二倍體的0.28倍。三倍體虹鱒血液中白細胞數目顯著地高于二倍體(P<0.05)，為二倍體的1.16倍。而血小板和血紅蛋白含量差異不顯著(P>0.05)。

表2 二倍體和三倍體虹鱒血液指標

2.4 二倍體和三倍體虹鱒血液生化指標的比較

如表3所示，三倍體血清中堿性磷酸酶、葡萄糖濃度顯著低于二倍體(P<0.05)，與二倍體的比值分別為0.61和0.53，三倍體血清中谷氨酸氨基轉移酶含量也低于二倍體，但是差異不顯著(P>0.05)，白蛋白、總膽固醇、甘油三酯、乳酸脫氫酶、總蛋白含量與二倍體差異不顯著(P>0.05)。

表3 二倍體和三倍體虹鱒血液生化指標

2.5 二倍體和三倍體虹鱒血清滲透壓的比較

隨機選取二倍體和三倍體虹鱒各5尾進行血清滲透壓的測定。如圖5所示，二倍體虹鱒血清滲透壓為(433±9) mOsm/kg，三倍體虹鱒血清滲透壓為(433±11) mOsm/kg，二倍體和三倍體虹鱒血清滲透壓無顯著性差異(P>0.05)。

圖5 二倍體和三倍體虹鱒血清滲透壓的比較。

3 討論

3.1 流式細胞術鑒定魚類的倍性

鑒定多倍體魚類的方法包括間接法(如核體積測量、蛋白質電泳、生化分析以及形態學檢查等)和直接法(如染色體計數以及DNA含量測定等)[11]。流式細胞計數法是一種準確測定細胞核內DNA含量的方法。流式細胞技術作為一種快速高通量的樣品分析平臺，輔以各種先進檢測模塊可以衍生出各種新型檢測設備，服務于不同領域的需求，其自動化、高通量、多維度等優勢越來越受到研究者的重視[12]。流式細胞儀具有快速、準確、用血量少的優點，但對樣本的制備具有較高的要求，需要獲得分散良好、細胞完整、并且適宜濃度的單細胞懸液。在魚類的倍性鑒定中，通過鰓、血液、鰭、肝、脾等組織皆可獲得單細胞懸液，但血液最為方便且效果最好。對于血細胞樣品的制備，紅細胞的濃度對結果影響顯著，這與流式細胞儀測定原理有關，紅細胞用熒光染料染色，這些熒光物質能與細胞核內的DNA進行特異性結合，在激光或紫外光的照射下發射出一定波長的熒光，再用流式細胞儀測出熒光值，因此，熒光值與紅細胞和PI染料的比例存在一定的關系，在該實驗PI濃度條件下，用來檢測倍性的虹鱒血量應當控制在2～10 μL的范圍內，濃度過小，測不出熒光值，濃度太大，測得的熒光值偏小，波峰不完整，影響對倍性的準確判斷。有研究表明，紅細胞甲醛固定法優于紅細胞乙醇固定法[13]。本實驗研究，兩種固定方法都能得到結果，但酒精固定法最佳。魚類的種群，魚體大小等因素也有可能影響熒光值。流式細胞儀檢測的是細胞核內DNA的相對含量，所以對各個樣品的處理條件應當保持一致。該方法的缺點是對樣本的質量要求較高，并且樣本處理過程繁瑣，需要特定的儀器，成本較高。

3.2 二倍體和三倍體虹鱒紅細胞大小的比較

一般認為，真核細胞核大小與染色體數目成正比例增加，同時，細胞核與細胞質在細胞中總是維持較穩定的核質比[14]。三倍體虹鱒細胞核內較二倍體多了一套染色體組，因此細胞核較普通二倍體核大，并且細胞本身需要維持一定的核質比例，所以紅細胞的體積也較普通二倍體大。已有研究表明，普通二倍體虹鱒紅細胞長徑平均值約16 μm，短徑平均值約9.5 μm[15]，本實驗測得的結果為長徑16 μm，與記載的數據無明顯差異，短徑平均值為10.49 μm，略大于有關的報道,可能與不同的虹鱒種群有關。韓英等研究發現三倍體虹鱒紅細胞體積與二倍體比值為1.51∶1，細胞核大小與二倍體比值為1.49∶1，與理論值(1.5∶1)比較均無顯著差異[16]。本實驗研究發現三倍體紅細胞與二倍體的比值以及紅細胞核與二倍體的比值皆大于理論值1.5，一方面可能是魚類種群的不同，各指標存在一定的差異，另一方面是年齡的差異，隨著魚體的長大，紅細胞也會隨之變大，本實驗以1.5齡的三倍體、二倍體虹鱒為研究對象，而韓英等所選用的實驗魚為0.5齡，所以本實驗所測得的紅細胞長軸、短軸、面積、體積及核的各項指標均明顯大于其研究結果。本實驗通過對有關三倍體虹鱒和二倍體虹鱒紅細胞和紅細胞核的大小進行比較，發現各項指標均存在顯著性差異，并且在相同倍鏡下觀察到的三倍體與二倍體紅細胞在形態和大小上均存在明顯的差別，普通二倍體虹鱒紅細胞呈小而圓的橢球形，而三倍體紅細胞則更大更長，主要是因為三倍體紅細胞和細胞核的長軸與二倍體之比分別為1.25、1.42，都分別大于相應的短軸之比，所以在顯微鏡下感覺像是三倍體紅細胞被拉長了。有研究表明，三倍體虹鱒紅細胞核的形態存在異常現象，在外周血液中存在19%的具有雙核或啞鈴型核的紅細胞[16]。所以，通過對虹鱒紅細胞大小的測量和形態上的觀察可以作為一種鑒定虹鱒三倍體與二倍體的方法，該方法具有操作簡單、成本較低的優點。不過，也有學者認為這個方法不能準確地反映染色體的倍性。有鑒于此，在使用這個方法之前最好結合流式細胞儀測定方法加以驗證。另外，在缺乏其他證據的情況下，這個方法潛在的不準確性使得難以鑒定多倍體與二倍體嵌合體[11]。

3.3 二倍體和三倍體虹鱒血液生理指標比較

影響魚類血液紅細胞數量的因素包括季節變化、健康狀況、水溫、溶解氧、運動強度、性腺發育的成熟度及餌料質量等，三倍體虹鱒由于紅細胞體積的增大，導致紅細胞中血紅蛋白的增加，從而使得血液中紅細胞的數目大為減少，本實驗研究對比發現，三倍體虹鱒血液紅細胞數目為二倍體的0.26倍，二者差異極顯著，紅細胞大小和數目兩者對血紅蛋白的綜合影響的結果為三倍體虹鱒血紅蛋白含量是二倍體的0.88倍，略低于二倍體，但二者差異不顯著，使得血液中的血紅蛋白含量維持在一定的水平。Danilo等認為，運動較快的魚類的紅細胞數量、紅細胞壓積和血紅蛋白含量較運動遲緩的種類高[17]。紅細胞數量和血紅蛋白含量可以反映出生物體對氧氣的攝取、運輸以及消耗能力，并通過氧氣與二氧化碳的交換滿足機體生理活動和運動的需要。Holland等的研究表明，體積較小的紅細胞具有較大的相對表面積和較短的擴散距離，可加速血紅蛋白對氧的吸收和釋放，從而具有耐低氧的特性[18]。

白細胞(WBC)作為魚類機體免疫和體液免疫的重要成分，主要作用是保護機體抵御外部和內部的傷害[19]。本研究中WBC的濃度在三倍體虹鱒中顯著高于二倍體，這與三倍體黃顙魚的白細胞數極顯著高于二倍體的結果類似[7]，表明三倍體虹鱒在免疫力、抗病力等方面較二倍體更強，更不易患病。魚類的抗病力主要依賴于它的免疫功能——特異性免疫和非特異性免疫，吞噬細胞的吞噬作用在這2種免疫中舉足輕重[20]。

3.4 二倍體和三倍體虹鱒血液生化指標比較

血漿中的血糖、血脂和血蛋白是指示魚體新陳代謝的重要指標。血清葡萄糖(GLU)作為直接能源物質可以為機體直接提供能量,GLU的增加既是能量代謝加快的需要也是機體對外界刺激的響應[21]。血糖含量的高低可以直接反映機體的營養狀況，三倍體虹鱒血清葡萄糖含量顯著低于二倍體，顯示三倍體虹鱒體內能量代謝水平低于二倍體，這可能與三倍體虹鱒紅細胞體積的增大以及紅細胞數目的減少有關，這種變化綜合形成的結果為三倍體虹鱒血紅蛋白水平較二倍體低，但這種差異并不顯著。甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)水平受體內蛋白質和脂質代謝的共同影響，不良的外界環境能引起魚體增加體內的糖原、脂類和蛋白質的分解來維持體內血糖、血脂及血蛋白的濃度，當三倍體虹鱒處于正常生理代謝狀態時，其血清TC和TG與二倍體虹鱒相比并無顯著性變化，有利于維持其最基本的代謝水平。

堿性磷酸酶(ALP)是一種在生物界中分布廣泛的磷酸酯酶，是生物體的一種重要的代謝調控酶，可以直接參與生物機體磷酸基團的轉移、調節機體磷的代謝、維持體內鈣磷比例等作用，為ADP磷酸化形成ATP提供所需的無機磷酸[22]。研究發現，三倍體虹鱒血清中堿性磷酸酶的含量顯著低于二倍體，堿性磷酸酶活性的降低有利于組織細胞生理活動維持于較低的水平以適應由于紅細胞數目的減少帶來的攜帶和輸送氧氣功能降低的影響。堿性磷酸酶是血細胞溶酶體的特征酶，在血細胞進行吞噬和包裹異物的反應中，伴隨著堿性磷酸酶的釋放，對異物產生水解破壞作用。魚類血液中保持有較高活性的堿性磷酸酶對防御外界微生物的入侵具有積極作用[23]。該研究結果顯示，三倍體虹鱒血清中堿性磷酸酶含量顯著低于二倍體，顯示了三倍體虹鱒在非特異性免疫方面的能力可能較二倍體低。總蛋白(TP)具有維持血液正常膠體滲透壓，維持pH值恒定的作用，參與脂肪酸、固醇等物質運輸并與免疫功能相關；血清白蛋白(ALB)是機體重要的免疫蛋白，與魚體的抗病及環境適應能力有著密切的關系[21]。三倍體虹鱒血清總蛋白和白蛋白含量與二倍體虹鱒并沒有顯著性差異，這是維持血液正常滲透壓的需要，同時保證機體處于一個相對穩定的內環境狀態。血清中谷氨酸氨基轉移酶(ALT)活性的相對增加可反映肝功能障礙, 是判斷肝細胞壞死的最具特異性的應用指標[24]。經比較發現，三倍體和二倍體虹鱒血清中谷氨酸氨基轉移酶(ALT)無顯著性差異(P>0.05)。

3.5 二倍體和三倍體虹鱒血清滲透壓的比較

血清滲透壓代表著硬骨魚類內部滲透壓情況，在外界鹽度變化時，起初血清滲透壓會隨之迅速升高或降低，然后逐漸向初始狀態恢復，整個生理過程受滲透壓調節機制的影響[25]。本研究的實驗魚養殖在同一淡水水體，沒有在三倍體、二倍體之間發現血清滲透壓顯著差異，表明三倍體虹鱒與二倍體一樣具有高效的滲透壓、離子調控機制，以維持體內水分及液體的動態平衡。

4 結語

本實驗通過流式細胞儀對虹鱒倍性進行了鑒定，在紅細胞濃度的選擇、紅細胞單細胞懸液的固定等方面進行了優化，在此基礎上通過比對二倍體和三倍體虹鱒紅細胞的大小，發現其紅細胞與核體積的比值均要顯著大于理論值1.5，這與其他學者的有關研究存在一定差異。通過血液生理指標的測定，三倍體紅細胞通過減少數量來降低其體積的增大帶來的單個紅細胞中血紅蛋白含量的增加的影響，這對于其維持機體平衡，保證氣體正常運輸具有重要意義，但有關三倍體虹鱒在耐低氧方面的能力和機制有待進一步研究。三倍體虹鱒白細胞數量顯著高于二倍體，但有關三倍體虹鱒在免疫組織和器官、免疫受體、免疫因子、免疫細胞等方面的應答反應有待進一步研究。