冬瓜實時熒光定量PCR內參基因的篩選與評價

葉新如 朱海生 林 琿 劉建汀 王 彬 陳敏氡 溫慶放

(福建省農業科學院作物研究所/福建省農業科學院蔬菜研究中心/福建省蔬菜工程技術研究中心,福建 福州 350013)

冬瓜(Benincasa hispida Cogn.)屬葫蘆科冬瓜屬一年生蔓生或架生草本植物[1]。冬瓜的花、葉、果皮、果肉、種子等可用于治療咳嗽、哮喘等疾病,均具有很好的藥食兼用價值[2-3]。同時,冬瓜富含氨基酸、維生素C、酚類等活性物質,對預防慢性疾病作用顯著,且其不含脂肪,富含丙醇二酸,能有效抑制糖類物質轉化為脂肪[4-5]。目前對冬瓜的研究主要集中在栽培技術[6-7]、藥用開發[8-11]、營養價值[12-13]、遺傳育種[14-16]等方面,而關于冬瓜功能基因的克隆表達及基因組學的相關研究尚鮮見報道。隨著生物技術的迅猛發展,利用分子生物學技術闡明冬瓜功能成分和調控機理相關基因表達已成為研究重點。對冬瓜相關基因功能研究是開發利用這些基因的前提,而基因表達量的檢測是體現其功能的一個重要指標。內參基因作為檢測基因表達量變化的參照,對其篩選研究具有重要意義。

實時熒光定量 PCR ( real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)是一種能夠對目標基因的表達量進行準確定量分析的試驗技術,常用于各種目標基因定量分析和基因表達量的研究[17]。該技術利用熒光信號的變化實時檢測整個PCR 反應中每個循環擴增產物量的變化,能夠對起始模板準確定量,與傳統的基因表達檢測方法相比,該技術具有適用性廣、靈敏度高等優點。目前,基因表達量的檢測較多涉及到應用RT-qPCR 技術,但RT-qPCR 相對定量表達結果的準確性通常受RNA 產量、引物特異性、內參基因等因素影響[18]。內參基因是指在基因研究中作為內部參照的基因,通常為管家基因,其在各細胞和組織中表達相對穩定,在檢測目標基因表達水平變化中需要利用內參基因進行校正,其穩定性對RT-qPCR 結果的準確性具有決定性影響[19-20]。常用的內參基因有甘油醛-3-磷酸-脫氫酶基因(GAPDH)、微蛋白基因(TUB)等[21]。大量研究表明,內參基因在不同試驗條件下表達存在差異,不存在恒定不變的內參基因[22-23],選擇表達穩定的內參基因來校正和標準化目標基因的表達是有效應用RT-qPCR 技術的基礎[24-25],因此篩選冬瓜不同組織和不同脅迫條件下穩定的內參基因對研究其基因定量表達具有重要意義。

截至目前,國內外關于冬瓜內參基因篩選的研究報道僅有張金平等[26]研究發現節瓜經鐮刀菌酸(fusaric acid,FA)脅迫后Actin 和F-box 表達穩定,在節瓜不同組織中F-box 基因表達穩定性最高,而在非生物脅迫和不同組織中冬瓜適合的內參基因尚未見報道。本研究以黑皮冬瓜不同脅迫條件(低溫、高溫、干旱)下的葉片和不同組織(根、莖、葉、花)為材料,利用GeNorm、NormFinder 和BestKeeper 對7 個候選內參基因的表達穩定性進行分析評價,篩選合適的內參基因,以期為冬瓜后續相關基因表達研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料黑皮冬瓜統一播種于福建省農業科學院作物研究所福清市東張鎮蔬菜科研基地。穴盤育苗,待幼苗長至三葉一心時分別放入培養箱進行處理。

試驗處理共分為4 組,第1 組為4℃分別處理0、1、6、12、24 h,取1～2 片真葉；第2 組為42℃分別處理0、1、6、12、24 h,取1 ～2 片真葉；第3 組為26℃,光照16 h,分別斷水0、1、2、3、4 d 進行干旱處理,使土壤含水率 分 別 為 92.50%、 79.61%、 68.19%、 56.20%、46.84%,取1 ～2 片真葉；第4 組為正常栽培條件,取根、莖、葉、花4 個部分。以上處理均設3 次生物學重復。采樣后立即用液氮速凍,-80℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 根據福建省農農業科學院作物研究所蔬菜中心課題組前期對冬瓜轉錄組測序所得試驗結果,篩選出28SrRNA、UBQ、RP Ⅱ、GAPDH、EF-1α、UBC21、TUA 7 個候選內參基因,根據引物設計原則,利用Primer Premier 5.0 設計引物(表1)。

表1 候選內參基因引物序列Table 1 The primer sequence of candidate reference gene

1.2.2 總RNA 的提取和cDNA 的合成 利用通用植物總RNA 提取試劑盒[BioTeke(北京)公司]提取RNA,通過1%的瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000 分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司)檢測總RNA 完整性和濃度。cDNA 合成按照PrimeScriptTMⅡ1stStrand cDNA Synthesis Kit 試劑盒[TaKaRa(日本)公司]操作說明書進行。

1.2.3 內參熒光定量PCR 擴增 采用SYBR Green染料法,RT-qPCR 按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒[TaKaRa(日本)公司]操作說明書進行,在7500 Real Time System 儀[ABI(美國)公司]上完成,樣品設3 次重復。反應體系10 μL,包括2×SYBR Premix EX TaqTM5 μL、Primer F (10 μmol·L-1) 0.4 μL、Primer R(10 μmol · L-1) 0.4 μL、 ROX Reference Dye(10 μmol·L-1)0.2 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 2 μL。PCR擴增反應程序：95℃預變性30 s；95℃變性5 s,60℃退火34 s,40 個循環。擴增完成后進行溶解曲線分析,溶解曲線程序：95℃15 s,60℃1 min,95℃15 s。

普通PCR 操作在GeneAmp PCR System 9000 儀[ABI(美國)公司]上完成,反應體系20 μL,包括10×PCR buffer(含Mg2+) 2 μL、Primer F (10 μmol·L-1)1 μL、 Primer R (10 μmol·L-1) 1 μL、 dNTP (10 mmol·L-1) 1 μL、Taq (5U) 0.2 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 12.8 μL。反應程序：94℃預變性3 min；94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸30 s,35 個循環；72℃延伸7 min。

1.3 數據分析

利用GeNorm、NormFinder 和BestKeeper 軟件分析7 個候選內參基因穩定性。將RT-qPCR 獲得數據導出至Microsoft Excel 2010 中,并根據軟件要求對循環閾值(cycle threshold,CT)進行轉換。每個軟件產生候選內參基因穩定性的度量值,可用于對內參基因穩定性排序。GeNorm 軟件根據內參基因平均表達穩定值(average expression stability value,M)確定穩定性,M值越小越穩定,同時依據ⅤN/ⅤN+1確定最適內參基因數量。NormFinder 軟件通過基因表達穩定值(stability,S)對候選內參基因排序,S 值最小的基因穩定性最好[27]。BestKeeper 軟件主要比較標準方差(standard deviation, SD) 和皮爾遜相關系數(pearsonproduct-momentcorrelationcoefficient,R),SD 值小于1,R 值越接近1,內參基因越穩定[28]。

2 結果與分析

2.1 總RNA 檢測

利用1%的瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計分別檢測總RNA 完整性和濃度。總RNA 濃度范圍在245.3～535.7 ng·μL-1之間,OD260/OD280 值為1.8 ～2.0,表明提取的總RNA 適合于做進一步的研究。

2.2 內參基因PCR 檢測

利用普通PCR 對內參基因特異性進行檢測,結果表明,7 個內參基因擴增產物條帶單一,大小與目標片段相同,說明引物能特異性擴增,不存在引物二聚體,適用于RT-qPCR 研究(圖1)。

圖1 冬瓜7 個候選內參基因的RT-PCR 擴增結果Fig.1 Specificity of 7 candidate reference genes for RT-PCR amplification

2.3 冬瓜內參基因RT-qPCR 分析

2.3.1 溶解曲線分析 以冬瓜cDNA 為模板,經RTqPCR 擴增,對候選內參基因的引物溶解曲線分析,結果表明,7 個候選內參基因引物特異性好,均為單峰,樣品間擴增曲線重復性強(圖2)。

2.3.2 表達豐度分析 7 個候選內參基因平均CT 值介于22.26～24.40 之間(圖3)。根據CT 值計算候選內參基因表達水平,候選內參基因在不同組織和不同脅迫條件下基因表達水平存在差異。GAPDH 在低溫和高溫脅迫條件下CT 值整體處于最低(圖4-A、B),表達量高,而RP ⅡCT 值整體處于最高,表達量最低；干旱處理2 h 時,7 個內參基因CT 值高于其他4 個處理,說明基因表達量最低(圖4-C)；在不同組織中,花中28SrRNA、UBQ、RP Ⅱ、EF-1α 的CT 值顯著低于其他組織中的CT 值(圖4-D),說明這4 個內參基因在花中表達量相對較高。

2.4 冬瓜內參基因的篩選

根據GeNorm 軟件得到的默認變異系數(VN/VN+1)確認最適內參基因數目。0.15 為程序默認的閾值,VN/VN+1＜0.15 時,則認為最佳的內參基因數為N個。在低溫和高溫處理下,樣品VN/VN+1值均大于0.15,無法確定最適的樣品數,這可能與樣品生理狀況、內參基因穩定性等因素有關。因此,低溫和高溫處理下選擇VN/VN+1最小值作為最適內參數[15]；在干旱和不同組織條件下,V2/V3均小于0.15(表2)。因此,本試驗最適的內參基因均為2 個。

表2 GeNorm 軟件分析不同脅迫處理和不同組織的VN/VN+1Table 2 Analysis of VN/VN+1 in different stress treatments and tissues by GeNorm software

2.4.1 冬瓜不同脅迫條件處理內參基因表達的穩定性 利用GeNorm 軟件計算7 個候選內參基因表達穩定值,由表3 可知,冬瓜低溫脅迫處理不同時段M 值排序為RP Ⅱ= EF-1α ＜UBC21 ＜UBQ ＜TUA ＜28SrRNA ＜GAPDH；高溫處理不同時段M 值排序為TUA= UBQ ＜UBC21 ＜EF-1α ＜GAPDH ＜RP Ⅱ＜28SrRNA；干旱處理不同時段M 值排序為TUA=UBQ ＜UBC21＜EF-1α＜28SrRNA＜GAPDH＜RP Ⅱ。在低溫處理下RP Ⅱ和EF-1α 的穩定性最好,而28SrRNA 和GAPDH 的穩定性差；在高溫處理和干旱處理下TUA和UBQ 的穩定性均較好,適合作為內參基因。

表3 GeNorm 軟件分析7 個候選內參基因在不同脅迫條件下表達穩定性Table 3 GeNorm ranking of the 7 candidate reference genes with respect to their expression stability under different stress conditions

圖2 7 個候選內參基因RT-qPCR 溶解曲線Fig.2 Melting curves of 7 candidate reference genes for RT-qPCR amplification

圖3 7 個候選內參基因平均CT 值分布Fig.3 Average CT value distribution of seven candidate internal reference genes

圖4 各候選基因在不同脅迫和不同組織中CT 值分布Fig.4 Distribution of CT values of candidate genes under different stress conditions and different tissue

根據NormFinder 軟件分析結果可知,在低溫處理條件下7 個候選內參基因表達穩定值S 排序為EF-1α＜RP Ⅱ＜TUA＜28SrRNA＜UBC21＜UBQ＜GAPDH；高溫處理條件下7 個候選內參基因表達穩定值S 排序為TUA=UBQ＜GAPDH＜UBC21＜EF-1α＜RP Ⅱ＜28SrRNA；干旱處理條件下內參基因表達穩定值S 排序為TUA=UBQ＜UBC21＜EF-1α＜GAPDH＜28SrRN＜RP Ⅱ(表4)。低溫處理下EF-1α 的S 值最低,穩定性最好,其次是RP Ⅱ；高溫和干旱處理下TUA 和UBQ 的S 值最低,穩定性最好,這與GeNorm 軟件分析結果一致。

BestKeeper 軟件直接利用CT 值進行數據處理分析。由表5 可知,在低溫處理下EF-1α 和RP Ⅱ的R值最趨近于1,相關性好,且SD 值均小于1,GAPDH 的SD 值最高。說明在低溫脅迫處理下RP Ⅱ和EF-1α適合作為內參基因,而GAPDH 穩定性差,不適合作為內參基因,這與之前穩定性分析結果一致。高溫處理下,UBQ 的SD 值最小,穩定性最好,28SrRNA 的SD 值大于1,說明其穩定性最差,與GeNorm 和NormFinder的結果一致。干旱處理下,UBQ 和TUA 的SD 值小于1,且R 值最接近于1,說明其穩定性較好。

綜合3 個軟件分析結果,在低溫脅迫處理下EF-1α表達穩定性最好；在高溫和干旱脅迫處理下UBQ 和TUA 表達穩定性最好。

2.4.2 冬瓜不同組織內參基因表達的穩定性 7 個內參基因在冬瓜不同組織中表達量不同,GeNorm 軟件分析結果表明,在冬瓜不同組織中7 個內參基因M 值排序為UBQ=EF-1α＜RP Ⅱ＜UBC21＜28SrRNA＜TUA＜GAPDH。NormFinder 軟件分析結果表明,候選內參基因表達穩定值S 排序為EF-1α ＜RP Ⅱ＜UBQ ＜UBC21＜TUA＜28SrRNA＜GAPDH。BestKeeper 軟件分析結果表明,EF-1α 和RP Ⅱ的SD 值均小于1,且R 值接近于1,說明二者穩定性較好；TUA 和GAPDH 的SD值均小于1,但TUA 相關性差,GAPDH 相關性最差,為負值,不適合作為內參基因。綜上,EF-1α 為最適內參基因(表6)。

表4 NormFinder 軟件分析7 個候選內參基因在不同脅迫條件下表達穩定性Table 4 NormFinder ranking of the 7 candidate reference genes with respect to their expression stability under different stress conditions

3 討論

目前已有關于植物不同組織和非生物脅迫下內參基因篩選的研究報道。如Wang 等[29]研究表明RP 和EF-1α 適合作為低溫脅迫處理下胡楊(Populus euphratica)的內參基因；Hong 等[30]認為EF-1α 是短柄草(Brachypodium distachyum)在低溫脅迫處理下最穩定的內參基因；Lovdal 等[31]研究表明,不同脅迫處理下番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)的最適內參基因不同,其中低溫脅迫處理下EF-1α 和RPLA 表達最穩定,GAPDH 最不穩定。本研究結果表明,冬瓜在低溫脅迫處理下最適合的內參基因是EF-1α,而GAPDH穩定性最差,不適合作為內參基因,這與前人研究結果一致。高溫脅迫處理下,本研究最適的內參基因為UBQ 和TUA,與陳楊楊等[32]和史興青[33]研究結果相似；杜輝輝[34]根據梭梭(Haloxylon ammodendron)轉錄組測序結果對8 個候選內參基因穩定性進行分析,最終認為干旱脅迫條件下最適內參基因有Ha18SrRNA、HaTUA5 和 HaUBQ10； 周 曉 慧 等[35]篩 選 喀 西 茄(Solanum aculeatissimum)中穩定內參基因發現TUA 和EF-1α 不同脅迫條件及不同組織中的表達穩定性最高。本研究結果表明,干旱脅迫下UBQ 和TUA 是冬瓜最適內參基因,這與前人研究結果一致。

研究內參基因穩定性時,通常需要對不同組織基因表達情況進行檢測,如Jain 等[36]對水稻(Oryza sativa)內參基因穩定性評價,認為EF-1α 和UBQ5 在不同組織器官中穩定性最好；張崗等[37]篩選鐵皮石斛(Dendrobium officinale)不同組織最適內參基因,結果確定EF-1α 和18SrRNA 為最佳內參基因。蘇曉娟等[38]認為毛果楊(Populus trichocarpa)不同組織均可使用EF - 1α 作 為 內 參 基 因。此 外, 在 菠 蘿 蜜(Artocarpus heterophyllus)[39]和葡萄(Vitis vinifera L.)[40]不同組織中GAPDH 表達也較穩定。本研究結果表明,冬瓜不同組織中EF-1α 穩定性最好,GAPDH穩定性最差,這可能是由于試驗樣品、方法、時間和內參基因范圍不同,造成篩選出的最適內參基因不同。

大量研究表明,不同試驗條件下最適候選內參基因存在差異,因此,內參基因穩定性的篩選與分析,是得到可靠基因表達分析結果的重要前提。GeNorm、NormFinder 和BestKeeper 是常用的3 個內參基因分析軟件。蔣婷婷等[41]對石蒜屬(Lycoris)不同組織、不同花發育期和不同雜交種的幼鱗莖進行最適內參基因選擇,發現GeNorm 和NormFinder 軟件分析結果較為一致,而BestKeeper 軟件分析結果差異明顯,這可能是由于BestKeeper 軟件不需要將CT 值進行轉換,是對原始數據最直接的表達,與GeNorm 和NormFinder 軟件相比,在內參基因穩定性分析上有效性較差,因此,BestKeeper 軟件分析適用于初篩。肖翠等[42]分析柑橘( Citrus) 內參基因穩定性發現, GeNorm 和NormFinder 軟件在整體分析、潰瘍病等分析中有著高度的一致性,但在干旱、低溫脅迫分析中存在差異,其原因可能是GeNorm 和NormFinder 軟件算法不同,NormFinder 軟件能在綜合考量其他內參基因基礎上再選擇最適內參基因,而GeNorm 軟件不行,這就導致當內參基因在組間樣品間差異較少時,2 個軟件分析結果差異大。本研究中,不存在樣品分組和目的基因分析,且3 個軟件分析的最適內參基因結果大致相同,因此選擇在3 個軟件中分析結果均顯示比較穩定的EF-1α 基因作為冬瓜的內參基因。

4 結論

本研究共選取7 個候選內參基因,研究其在冬瓜不同組織和不同非生物脅迫條件下的表達情況,分析了各候選內參基因的穩定性。結果表明,7 個候選內參基因在不同組織和不同脅迫處理下均有表達,但表達量存在差異,其中EF-1α 在低溫脅迫處理下表達穩定性最好；UBQ 和TUA 在高溫和干旱脅迫處理下表達穩定性最好；EF-1α 在不同組織中表達穩定性最好。本研究結果為冬瓜實時熒光定量PCR 內參基因的選擇提供了一定的理論參考,為今后冬瓜基因的表達分析奠定了理論基礎。