紫外光與脈沖強光照射麥角甾醇轉化VD2研究

楊 開 李 珅 孫培龍

(浙江工業大學食品科學與工程系,浙江 杭州 310000)

維生素D(vitamin D,VD)作為人體生長發育必需的一種類固醇激素[1],能夠調節人體內鈣和磷的代謝,并影響細胞增殖分化[2]。VD 族中主要活性形式為VD2和VD3,其中VD3主要通過存在于動物表皮和真皮內的7-脫氫膽固醇經紫外照射發生結構轉化而生成,是人體能夠自身合成的一類激素；VD2則主要通過存在于食用菌、動物肝臟、酵母菌中的麥角甾醇經紫外線照射發生結構轉化而生成[3-4]。以往研究側重于嬰幼兒缺乏VD 導致的佝僂病及高齡人群的軟骨病和骨質疏松癥[5-6],但近年來隨著研究的不斷深入,逐步發現VD 缺乏也是罹患癌癥、自發性免疫疾病、傳染病、心血管疾病和精神疾病等多種常見疾患的關鍵誘因[7-8]。據不完全統計,全球性VD 不足的發生率為30%～50%[9-10],全球數十億人存在VD 不足或缺乏狀態,且呈逐年上升趨勢,VD 的缺乏已成為全球性公共健康問題之一。由于不同地區光照時間的長短不同,導致部分常年缺少光照地區的人群普遍出現內源性VD3合成不足,因此,對于如何快速有效提高人體外源性VD2的攝入顯得越發重要。而食用菌中富含的VD2源-麥角甾醇,是良好的VD2來源之一。

野生或栽培的食用菌中均含有豐富的麥角甾醇,經紫外光照射后可轉化為VD2,是很好的VD2來源之一。紫外按波段可分為UVA(320 ～400 nm)、UVB(290～320 nm)和UVC(200～275 nm)。經長時間的光照,麥角甾醇會生成光甾醇、速甾醇等副產物。Phillips 等[11]研究發現照射環境對食用菌中麥角甾醇轉化VD2過程有重要影響；Wittig 等[12]發現不同UV波段對食用菌麥角甾醇轉化VD2過程有不同影響；胡彬彬等[13]、孫夢姣等[14]以UV 燈分別輻照不同時期、不同部位的食用菌,發現食用菌不同部位的麥角甾醇含量不同,轉化效果也不同。上述關于麥角甾醇轉化VD2的研究均以UV 燈作為光源對食用菌麥角甾醇進行照射處理,生成VD2的得率在3.21%～4.42%之間,同時伴隨光甾醇、速甾醇等副產物的生成[15-16],增加了后期提純的難度。

脈沖強光(intense pulsed light,IPL)殺菌技術是近年出現的一種利用瞬間放電的脈沖工程技術和特殊的惰性氣體,對食品表面、包裝材料及器械進行快速滅菌的非熱物理殺菌新技術[17]。它利用惰性氣體燈發出與太陽光譜相近、波譜范圍由紫外線至紅外線區域的強烈脈沖閃光殺滅固體表面、氣體和透明液體中的微生物[18],具有高能量、高穿透性的特點[19]。

本試驗采用UVC 和IPL 兩種光照處理手段對麥角甾醇標準液和食用菌麥角甾醇提取液進行麥角甾醇轉化VD2研究,觀察照射能量與后期反應對VD2轉化效率及副產物的影響,以期為食用菌麥角甾醇轉化VD2研究及相關產品的開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢 菇(Agaricus bisporus)、 猴 頭 菇(Hericium erinaceus)、香菇(Lentinus edodes)、灰樹花(Grifola frondosa),4 種食用菌均為干品子實體,由浙江省慶元縣濛州有機食用菌產品有限公司提供。

麥角甾醇標準品、VD2標準品,上海阿拉丁試劑有限公司；色譜純甲醇和二氯甲烷,天津四友化學試劑有限公司；無水乙醇、氫氧化鉀等其余試劑均為分析純,上海凌峰試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

Waters1525 型高效液相色譜分析儀,美國Waters有限公司；Cosmosil C18高效液相色譜柱(250 mm×4.6 mm),北京英萊克科技發展有限公司；26 W 短波段紫外燈管(波長253.7 nm),雪萊特光電科技股份有限公司；YE-01 IPL 照射箱(26 W),常州蘭諾有限公司；ME204E 電子天平,梅特勒-托利多精密儀器制造公司；RE-2000A 旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器廠；DKS24 型電熱恒溫水浴鍋,上海森信實驗儀器有限公司；UV-Int150 紫外能量計,深圳致佳儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的制作 精確稱取麥角甾醇、VD2兩種標準品各100 mg 溶于無水乙醇,配制成1.0 mg·mL-1的標準母液,然后將兩種標準母液分別稀釋成0、25、50、100、200、400 μg·mL-1系列標準液,并繪制標準曲線。

1.3.2 食用菌中麥角甾醇的提取 參照楊安倫等[20]、張萱等[21]的方法并略作改進。以雙孢菇麥角甾醇提取率為響應值,提取溶劑(乙醇)的濃度、料液比、提取時間和提取溫度為考察因素,采用單因素試驗結合響應面分析方法,優化食用菌麥角甾醇提取工藝條件,并采用此優化提取工藝分別對猴頭菇、香菇、灰樹花3 種食用菌中的麥角甾醇進行提取和樣品制備。

1.3.2.1 提取溶劑對食用菌中麥角甾醇提取效果的影響 精確稱取雙孢菇干粉0.2 g,依次精密加入40%、60%、80%、100%的乙醇溶液各4.0 mL,置于80℃水浴提取60 min,待冷卻后過濾,濾液用無水乙醇定容至10 mL,然后進行麥角甾醇的含量測定及提取量分析。按照公式計算麥角甾醇的提取量：

1.3.2.2 提取溫度對食用菌中麥角甾醇提取效果的影響 精確稱取雙孢菇干粉0.2 g,準確加入4.0 mL無水乙醇,分別在20、40、60、80℃水浴中提取60 min,待冷卻后過濾,濾液用無水乙醇定容至10 mL,測定提取液中麥角甾醇的含量。

1.3.2.3 提取時間對食用菌中麥角甾醇提取效果的影響 精確稱取雙孢菇干粉0.2 g,準確加入4.0 mL無水乙醇,在80℃水浴鍋中分別提取30、60、90、120 min,冷卻后過濾,濾液用無水乙醇定容至10 mL,測定提取液中麥角甾醇的含量。

1.3.2.4 料液比對食用菌中麥角甾醇提取效果的影響 精確稱取雙孢菇干粉0.2 g,以料液比1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40 分別加入相應體積的無水乙醇,置于80℃水浴提取60 min,待冷卻后過濾,濾液用無水乙醇定容至10 mL,測定提取液中麥角甾醇的含量。

1.3.2.5 響應面試驗設計 在單因素試驗結果的基礎上,以提取時間(A)、料液比(B)、提取溫度(C)、乙醇濃度(D)作為4 個考察因素,雙孢菇麥角甾醇提取量(Y)為指標,應用Design-Expert 8.0.6 軟件進行響應面試驗設計,響應面試驗設計與因素見表1。

1.3.2.6 皂化劑堿濃度對食用菌中麥角甾醇提取效果的影響 精確稱取雙孢菇干粉0.2 g 各4 份于具塞試管中,每管內均加入4.0 mL 無水乙醇和1.0 mL 皂化液(4 種不同濃度的皂化液依次為2、3、4、5 mol·L-1KOH 溶液,每個具塞試管中添加的皂化液濃度不同),于80℃處理60 min 后,用95%乙醇充分洗滌并收集濾液。濾液經濃縮干燥后加入10 mL 萃取劑(5 mL 正己烷和5 mL 水),充分振蕩后靜置提取20 min,用移液管吸取正己烷層2.0 mL,無水乙醇溶解并定容至10 mL,然后測定定容后溶液中的麥角甾醇含量。

表1 響應面試驗設計與因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.2.7 醇堿對食用菌中麥角甾醇提取效果的影響 精確稱取雙孢菇干粉0.2 g 各4 份于具塞試管,分別 加 入2.0、 1.3、 1.0、 0.8 mL 的 KOH 溶 液(4 mol·L-1)和4.0 mL 無水乙醇,于80℃處理60 min 后,用95%乙醇充分洗滌并收集濾液。濾液經濃縮干燥后加入10 mL 萃取劑(5.0 mL 正己烷和5.0 mL 水),充分振蕩后靜置提取20 min,用移液管吸取正己烷層2.0 mL,無水乙醇溶解并定容至10 mL,然后測定容后溶液中的麥角甾醇含量。

根據優化后的雙孢菇麥角甾醇提取條件,分別對香菇、灰樹花、猴頭菇3 種食用菌中的麥角甾醇進行提取,提取液保留備用。

1.3.3 光轉化VD2的效果分析

1.3.3.1 UVC 照射處理 分別取麥角甾醇標準液(1.0 mg·mL-1)及上述食用菌麥角甾醇提取液各20 mL 于50 mL 燒杯中,用UVC 依次進行5、10、30、60 min 的照射處理,應用紫外能量計測得照射能量分別為0.033、0.069、0.226、0.656 J·cm-2。

1.3.3.2 IPL 照射處理 分別稱取麥角甾醇標準液(1.0 mg·mL-1)及上述食用菌麥角甾醇提取液各20 mL 于50 mL 燒杯中,用IPL 依次進行5、10、30、60 min的照射處理,應用紫外能量計測得照射能量分別為0.098、0.208、0.600、1.108 J·cm-2。

1.3.3.3 麥角甾醇提取液的熱反應處理 將照射后的麥角甾醇提取液的杯口覆蓋保鮮膜,避光條件下80℃水浴30 min,冷卻至室溫后用無水乙醇定容至10 mL,進行麥角甾醇和VD2含量的分析測定。

1.3.3.4 熱處理的避光貯藏 將上述熱處理的樣品液避光條件下放置24 h,用無水乙醇定容至10 mL,進行麥角甾醇和VD2含量的分析測定。

1.3.4 麥角甾醇、VD2含量的檢測 參考Guan 等[22]的方法。分別將未經照射的麥角甾醇標準液(空白液)、UVC、IPL 照射處理后的麥角甾醇提取液用0.45 μm 濾膜過濾后進行HPLC 分析。測定條件：流動相A(甲醇∶水=80 ∶20,v/v)和流動相B(甲醇∶二氯甲烷=75 ∶25,v/v),梯度洗脫過程：0 ～5 min,50%～80%B；5 ～15 min,80%～100% B；15 ～20 min,50% B；流速0.8 mL·min-1, 進 樣 體 積10 μL, 檢 測 波 長254 nm。

根據樣品測定的色譜峰面積,在相應標準曲線查出對應的含量, 按照公式計算VD2得率：

1.3.5 數據處理 試驗結果以平均值±標準差表示。采用Origin 8.0 軟件進行數據圖像處理；SPSS 16.0 和Design-Expert 8.0.6 軟件進行統計和差異顯著性分析,P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 麥角甾醇與VD2 的標準曲線

由圖1 可知,VD2標準品的保留時間為15.486 min,麥角甾醇標準品的保留時間為17.178 min。以進樣濃度(X,mg·mL-1)為橫坐標,相應的峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸分析,麥角甾醇、VD2含量的回歸方程分別為：Y1=139 95X1-359 25,R2=0.999 61；Y2=183 91X2-857 30, R2=0.999 86。

2.2 食用菌中麥角甾醇的提取

2.2.1 提取工藝條件的優化 食用菌中的麥角甾醇易溶于醇類溶劑,如楊安倫等[20]、張萱等[21]及馬元等[23]對靈芝和金蟬花中麥角甾醇進行提取時發現,甲醇作為提取劑的提取效果優于乙醇,但甲醇有一定毒性[24],故選用乙醇作為提取溶劑。單因素試驗結果表明,提取時間為60 min 時,雙孢菇中的麥角甾醇提取量最大,而后逐漸下降,說明長時間加熱會導致麥角甾醇提取量減少,因而選用60 min 作為最佳提取時間(圖2-A)；當料液比為1 ∶20 時,雙孢菇中麥角甾醇提取量最大,料液比超過1 ∶20 后麥角甾醇的提取量趨于平穩,考慮到溶劑和后處理成本,選用料液比為1 ∶20(圖2-B)；隨著提取溫度的升高,雙孢菇中麥角甾醇的提取量也隨之增加,當提取溫度為60℃時,麥角甾醇的提取量達到最大,隨后有所逐漸下降,故選用60℃作為優化提取溫度(圖2-C)；隨著乙醇濃度的增加,雙孢菇干粉中的麥角甾醇提取量也隨之增多,因而選擇無水乙醇作為提取溶劑(圖2-D)。

圖1 VD2 與麥角甾醇標準品的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of VD2and ergosterol standard substances

2.2.2 響應面試驗分析 根據Box-Benhnken 中心組合試驗設計原理,綜合分析單因素,選取對食用菌麥角甾醇提取率影響較大的提取時間(A)、料液比(B)、提取溫度(C)、乙醇濃度(D)作為考察因素,雙孢菇麥角甾醇提取率(Y)為指標,設計四因素三水平的響應面分析試驗,結果見表2。

圖2 單因素對雙孢蘑菇麥角甾醇提取效果的影響Fig.2 Effect of single factor on the extraction of ergosterol from Agaricus bisporus

對表2 進行二次回歸響應面分析,建立多元二次響應面回歸模型：

由表3 可知,方程一次項中C、D 為顯著因素；方程二次項中B2和C2為極顯著因素,A2為顯著因素；A與B 之間交互作用顯著。由方差分析可知,模型P＜0.000 1,響應面回歸模型達到高度顯著性水平。決定系數R2=0.973 2,修正相關系數平方為0.973 2,說明該模型能反映97.3%響應值的變化,失擬項為0.359 1,不顯著,說明模型擬合程度較好,試驗誤差小,可以很好地描述各因素與響應值的真實關系。影響食用菌麥角甾醇提取率的各因素按影響大小排序依次為C(提取溫度)＞D(乙醇濃度)＞A(提取時間)＞B(料液比)。

圖3 分別顯示了提取時間(A)、提取料液比(B)、提取溫度(C)及乙醇濃度(D)對雙孢菇麥角甾醇提取率(Y)的影響及四因素之間的交互作用。在響應面優化試驗中,響應面曲面越陡、等高線越密集,各因素交互作用對響應值的影響越顯著。結果表明,在雙孢菇麥角甾醇常規提取工藝過程中,提取時間(A)、料液比(B)、提取溫度(C)及乙醇濃度(D)之間的交互作用均不顯著。

表2 響應面試驗設計方案與結果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.2.3 提取參數優化及模型驗證 在單因素試驗的基礎上,采用響應面法優化所得的雙孢菇麥角甾醇的提取工藝條件為：提取時間60 min、乙醇濃度100%、料液比1 ∶19.73 g·mL-1、提取溫度80.16℃,此條件下雙孢菇中麥角甾醇理論提取率為3.64 mg·g-1。為方便實際操作采用提取時間60 min、乙醇濃度100%、料液比1 ∶20 g·mL-1、提取溫度80℃的提取工藝條件提取3次,麥角甾醇提取率為3.59 mg·g-1。

2.2.4 食用菌中麥角甾醇提取液的皂化處理 由圖4 可知,當V(乙醇) ∶V(KOH)= 4 ∶1、KOH 濃度為4 mol·L-1時,雙孢菇的麥角甾醇提取液的皂化效果較好,提取率為3.19 mg·g-1,低于未皂化處理提取液中的提取率(3.59 mg·g-1),可能是由于皂化反應對游離的麥角甾醇產生了消耗,因此在后續對其他食用菌麥角甾醇進行提取時采用無皂化提取方式。

2.3 麥角甾醇標準液的轉化反應

2.3.1 麥角甾醇標準液的光、熱轉化處理 由圖5-A-1、B-1 可知,經60 min 的UVC、IPL 光照轉化處理,標準液中的麥角甾醇含量均減少,同時出現了微量的VD2及其前體,說明麥角甾醇在外部能量的照射作用下,產生了轉化反應。UVC 處理組中VD2含量為0.007 4 mg·mL-1,得率為0.74%；IPL 處理組中VD2含量為0.019 mg·mL-1,得率為1.90%。

經兩組光照處理后的麥角甾醇標準液,再經30 min、80℃熱處理,其VD2含量明顯提高,且雜質峰含量減小,說明加熱處理有效促進了VD2各種前體形式向VD2的轉化,此時,UVC 處理組中的VD2含量為0.023 3 mg·mL-1,VD2得率為2.33%；IPL 處理組中的VD2含量為0.021 mg·mL-1,得率2.19%(圖5-A-2、B-2)。

為進一步驗證VD2前體能否自發轉化為VD2,將經光照、加熱處理后的麥角甾醇標準液在避光室溫條件下放置24 h,發現標準液中雜質峰逐漸減少,此時,UVC 處理組中的VD2含量為0.064 mg·mL-1,得率為9.68%,但在8.971 min 出現明顯的雜質峰；IPL 處理組中的VD2含量為0.041 mg·mL-1,得率為7.34%；IPL 處理組中VD2含量較UVC 處理組低,但其雜質峰少。將標準液置于避光處繼續保存24 h,發現溶液中VD2含量未發生明顯變化,表明光、熱處理再經避光放置24 h 后的麥角甾醇向VD2的轉化基本完成。

2.3.2 光照時間對麥角甾醇標準液VD2得率的影響 由圖6 可知,隨著光反應、熱反應的進行,麥角甾醇迅速向VD2轉化。光照前期,IPL 處理組中麥角甾醇的轉化效率優于UVC 處理組,但隨著光照時間的延長,UVC 處理組中的VD2轉化率逐漸增大,當光照時間為60 min 時,其VD2得率達到9.68%,明顯高于IPL 處理組(VD2得率為7.34%)。

2.3.3 加熱時間對麥角甾醇標準液VD2得率的影響 麥角甾醇在經過光照處理后,進一步形成VD2前體[25],該前體經熱效應重排進一步生成VD2,此過程可自發進行,但所需時間較長[26]。由圖7 可知,80℃水浴加熱處理光照后的麥角甾醇標準液,加熱30 min 內標準液中VD2得率快速上升,繼續延長加熱時間,VD2得率逐漸開始下降,說明長時間處于高溫條件下,VD2前體可能會發生歧化反應,使得VD2得率降低。

2.4 食用菌麥角甾醇提取液的光、熱轉化處理

依據上述食用菌麥角甾醇優化提取工藝條件和麥角甾醇轉化為VD2的光、熱轉化條件,分別對猴頭菇、灰樹花、香菇、雙孢菇4 種食用菌的麥角甾醇提取液進行VD2轉化。由表4 可知,4 種食用菌提取液中的麥角甾醇含量差距較大,提取量依次為猴頭菇＞雙孢菇＞香菇＞灰樹花,灰樹花的麥角甾醇提取量最低,為2.13 mg·g-1,猴頭菇的麥角甾醇提取量最高,為4.41 mg·g-1。光照處理后,各食用菌麥角甾醇提取液轉化生成的VD2含量也明顯不同,UVC 處理組的VD2得率明顯高于IPL 處理組,但2 種光照處理食用菌麥角甾醇提取液的VD2得率均低于同樣處理條件下的麥角甾醇標準液,可能是因為食用菌麥角甾醇提取液的成分較為復雜,非麥角甾醇類物質對光照也有一定的屏蔽作用。

正常的VD 推薦日攝入量(RDI)為400 IU,即10 μg[27]。以4 種食用菌子實體的VD2得率計算,則采用UVC 方式需要的食用菌干品量分別為猴頭菇27.0 mg、雙孢菇38.4 mg、香菇62.5 mg、灰樹花71.4 mg,滿足日常所需VD；而IPL 處理方式需要的食用菌干品量為猴頭菇34.4 mg、雙孢菇41.6 mg、香菇83.3 mg、灰樹花90.9 mg。

圖3 各因素及相互作用對麥角甾醇提取量的響應面圖及等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots of various factors and their mutual interactions on the yield of extracted ergosterol

圖4 雙孢菇麥角甾醇皂化處理Fig.4 Saponification treatment on ergosterol in Agaricus bisporus

表3 回歸方程各項的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

圖5 不同處理條件對麥角甾醇標準液轉化VD2 的影響Fig.5 Effect of different treatment conditions on the conversion of ergosterol standard solution to VD2

圖6 光照時間對麥角甾醇標準液轉化VD2 的影響Fig.6 Effect of irradiation time on the conversion of ergosterol standard solution to VD2

圖7 加熱時間對麥角甾醇標準液轉化VD2 的影響Fig.7 Effect of heating time on the conversion of ergosterol standard solution to VD2

表4 光照、熱處理對食用菌麥角甾醇提取液轉化VD2 的影響Table 4 Effect of light and heating treatment on the transformation of VD2 by edible ergosterol extract

3 討論

食用菌麥角甾醇包括游離麥角甾醇和細胞膜中的結合麥角甾醇[28]。本研究結果表明,皂化后的提取液中麥角甾醇含量少于未皂化處理,這可能是由于麥角甾醇高溫下與醇堿發生氧化反應,進而導致麥角甾醇提取率降低,故本試驗采用非皂化處理方式,獲得猴頭菇、雙孢菇、香菇、灰樹花中麥角甾醇提取量為分別4.41、3.55、2.42、2.13 mg·g-1,這與Phillips 等[11]的試驗結果接近。

本研究采用UVC、IPL 對麥角甾醇標準液進行光照處理,發現經UVC 處理的麥角甾醇標準液在8.803 min 出現大的雜質峰,而經IPL 處理的標準液中副產物較少,說明IPL 處理能夠有效減少麥角甾醇轉化過程中副產物的生成,有利于VD2產品的研發。本試驗結果表明,麥角甾醇經短時間光照處理后,大部分轉化為VD2前體,同時少量VD2前體會進一步轉化為VD2,再經避光條件下熱處理,VD2前體可迅速轉化生成VD2。在參考白晨等[29]對香菇麥角甾醇提取液進行UV 照射處理條件的基礎上,本研究對后期熱處理時間條件進行了分析,發現80℃加熱30 min 可獲得較多的VD2。

本研究中,猴頭菇、雙孢菇、香菇、灰樹花4 種食用菌麥角甾醇提取液經光照、加熱和24 h 貯藏處理,UVC 處理組的VD2得率分別為8.40%、7.35%、6.72%、7.62%； IPL 處 理 組 的 VD2得 率 分 別 為6.62%、6.79%、5.26%、5.43%。與UVC 處理組相比,IPL 處理組的VD2得率較低,但IPL 處理能針對性地促使麥角甾醇向VD2轉化,副產物生成量較少,降低了后期VD2分離純化及其產品研發的難度。此外,與麥角甾醇標準液VD2得率相比,食用菌提取液VD2得率均較低,這可能是因為提取液中存在的多酚、核苷酸等物質會吸收或屏蔽部分光照能量,從而使得VD2轉化效率較低[30-31]。經光照、加熱處理后,食用菌麥角甾醇提取液于室溫避光條件下放置24 h,發現放置期間VD2生成量逐漸增加,說明麥角甾醇經過光照、加熱處理轉化生成的VD2前體,后續進一步自發向VD2轉化,但速率較為緩慢,且在放置24 h 后,提取液中VD2含量趨于穩定,表明轉化反應基本結束。本研究涉及的處理樣品均為液體,但VD2遇光、熱、氧等易降解,具有不穩定性[32-33],故對于VD2及其產品開發研究仍需進一步探討溫度、氧氣、水分、日光等因素對VD2穩定性的影響。

4 結論

IPL 與傳統UVC 光照處理均能有效促使麥角甾醇轉化成VD2,IPL 光照處理能夠在短時間內促使大量麥角甾醇向VD2轉化,同時降低麥角甾醇轉化VD2過程中副產物的生成。IPL 照射處理可作為在以食用菌麥角甾醇作為原料工廠化生產VD2的過程中的光處理源。食用菌麥角甾醇提取液中VD2得率低于同等處理條件下麥角甾醇標準液中的VD2得率,這可能是因為相對標準品,提取液中成分較為復雜,其他非麥角甾醇類物質對光照有一定的屏蔽作用。