組蛋白去乙酰化酶抑制劑SAHA對間歇性低氧引起的小鼠心肌損傷的保護作用

沈 帆，程文慧，范一菲，沈 兵，鐘明奎

阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea, OSA)產生原因是睡眠時上氣道塌陷阻塞，從而導致呼吸暫停與通氣不足，進而引起打鼾、睡眠結構紊亂、血氧飽和度下降頻發(fā)和白天嗜睡等一些癥狀，是多種心血管疾病的獨立危險因素，是造成患者致殘和死亡的主要原因。OSA可產生多種危害，如間歇性低氧(intermittent hypoxia，IH)、高碳酸血癥、胸內負壓劇烈波動、睡眠中斷和結構紊亂，其中IH是OSA的主要病理生理學特點和損傷機制，被認為是引起心血管疾病的最為重要的因素[1]。組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDAC)將乙酰基團從組蛋白或者非組蛋白上的ε-N-乙酰賴氨酸中去除掉，進而調節(jié)蛋白質活性水平的一類酶家族。HDAC是表觀遺傳調控子，調控了組蛋白乙酰化及去乙酰化的水平高低、核染色質的構象變化、組蛋白和DNA之間相互作用、轉錄和轉錄后修飾等。研究[2]表明HDAC在心血管疾病的發(fā)展中發(fā)揮著重要的調控作用，保護心血管的重要途徑之一便是抑制HDAC，所以抑制HDAC可能對心血管疾病的診斷以及治療是一種全新的方案[3]。該研究將探討間歇性低氧引起的小鼠心肌損傷是否可以通過HDAC抑制劑SAHA予以保護及其作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1動物清潔級雄性昆明小鼠，18～23 g，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。動物分籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，通風良好，室溫 18～25 ℃。

1.2儀器和試劑測氧儀(CYS-1 型，南京新飛分析儀器制造有限公司)；醫(yī)用壓縮氧氣(濃度>99.9%)、壓縮氮氣(濃度>99.99%)由合肥眾益化工產品有限公司充裝；Vorinostat(suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA)購自美國Selleck公司，用溶媒將SAHA配制成5 mg/ml，配置好后立即使用，溶媒的配比方案為ddH2O+30% PEG300+5% Tween 80+2% DMSO；Dihydroethidium(DHE)(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.3方法

1.3.1間歇性低氧模型的制備和分組 小鼠在適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗，隨機分成正常氧組(Sham組)、間歇性低氧組(IH組)、正常氧SAHA干預組(Sham+SAHA組)及間歇性低氧SAHA干預組(IH+SAHA組)，每組7只。根據本實驗室之前研究出的方案，使用氮氣不斷充入間歇性低氧箱內，稀釋低氧箱內氧氣[4]，將IH組以及IH+SAHA組小鼠放進低氧倉內，進行每天8 h的間歇性低氧處理，處理時間一共連續(xù)4周。Sham組和Sham+SAHA組除不充入氮氣和氧氣外，其余均與IH 組相同處理。在間歇性低氧處理2周之后，Sham+SAHA組以及IH+SAHA組連續(xù)2周每天使用SAHA 50 mg/(kg·d)給予腹腔注射，而Sham組和IH組腹腔則注射相同體積溶媒。實驗第4周末，處死小鼠，計算小鼠心臟指數，HE染色和VG染色觀察心臟病理形態(tài)學改變，DHE染色觀察小鼠心肌中活性氧物(reactive oxygen species,ROS)含量。

1.3.2心臟重量指標測定 實驗模型制備完成后首先給小鼠測量體重。再使用10%水合氯醛用腹腔注射的方法麻醉小鼠，注射劑量是0.05 ml/10 g，再使用眼球摘除取血的方法，獲取各組小鼠的血液。取血之后，在迅速使用粗剪刀剖開小鼠的胸腔，剪下小鼠心臟與胸主動脈。心臟剪下之后，去除附著的結締組織，并且將粘在心臟上的細小脂肪以及殘留的血液在生理鹽水中輕輕擺動去除，并將心臟用濾紙完全吸干之后再稱量重量，并且用直尺測得小鼠的脛骨長度，計算得出心臟重量/體質量(mg/g)以及心臟重量/脛骨長度(mg/cm)的比值。

1.3.3心臟組織學觀察 小鼠的心臟被洗凈吸干水后，首先使用10%多聚甲醛對其進行灌流，之后放在多聚甲醛溶液中固定，在經脫水機脫水之后，用石蠟包埋機包埋成蠟塊。使用石蠟切片機將心臟蠟塊標本切成4 μm薄片，用毛筆蘸到溫水中展開，之后使用載玻片撈出，之后將其用90 ℃烤20 min進行脫蠟，再分別使用HE和VG膠原染色，最后使用樹脂封片，并用顯微鏡進行觀察和拍攝。拍攝所得圖像使用Image J軟件計算心肌細胞的橫截面積。

1.3.4心臟中ROS的測定 將新鮮心臟取出，OTC包埋液氮冷凍后置-80 ℃冰箱保存。用冰凍切片機(Leica，德國)將冷凍后的標本切成5 μm的切片，用 PBS 洗滌，將配好的ROS探針DHE(5 μmol/L)在37 ℃烘箱內與標本在避光濕盒內反應30 min。DHE 在超氧化物生成處被氧化成為溴化乙錠，與 DNA 相結合之后，激發(fā)出紅色的熒光，可以通過觀察熒光的強度檢測ROS含量。

2 結果

2.1SAHA對間歇性低氧小鼠心臟肥大的影響使用小鼠的心臟重量/體質量、心臟重量/脛骨長度的比值和心肌細胞橫截面積對心肌肥大進行評價。四組小鼠心臟重量/體質量比值[F(3，24) =58.52，P<0.001]、心臟重量/脛骨長度比值[F(3，24) =14.35，P<0.001]存在明顯差異。和Sham組相比，IH組小鼠心臟重量/體質量比值與心臟重量/脛骨長度比值顯著增加(P<0.001)，出現了心臟肥大。使用SAHA處理1周后，和IH組相比，IH+SAHA組的小鼠心臟重量/體質量比值與心臟重量/脛骨長度比值下降明顯(P<0.01)，提示IH小鼠心肌肥大可被SAHA抑制；SAHA對Sham組小鼠心臟重量/體質量和心臟重量/脛骨長度比值沒有影響(圖1)。

圖1 SAHA對間歇性低氧小鼠心臟重量的影響

A：心臟重量/體質量比值；B：心臟重量/脛骨長度比值；與Sham組比較：***P<0.001；與IH組比較：##P<0.01

HE染色結果顯示，四組小鼠心肌橫截面積存在明顯差異[F(3，186)=55.58，P<0.001]。與Sham組相比，IH組小鼠心臟的心肌細胞橫截面積顯著增加(P<0.001)；SAHA可降低間歇性低氧引起心肌細胞橫截面積的增加(P<0.01)，但Sham組小鼠沒有影響(圖2)。

圖2 SAHA對間歇性低氧小鼠心肌細胞橫截面積的影響 ×400

A:Sham組；B：Sham+SAHA組；C：IH組；D：IH+SAHA組；E：心肌橫截面積半定量分析的結果統(tǒng)計圖；與Sham組比較：***P<0.001；與IH組比較：##P<0.01

2.2SAHA對間歇性低氧實小鼠心肌纖維化的影響VG染色結果顯示：與Sham組相比，IH組小鼠心肌膠原纖維明顯增多(棕黃色細胞)，SAHA治療顯著改善了IH組小鼠心臟纖維化；Sham小鼠無論是否應用SAHA，心肌均未出現纖維化(圖3)。

2.3SAHA間歇性低氧小鼠心肌中ROS的影響DHE熒光染色結果顯示：與Sham組相比，IH組小鼠心肌中活性氧明顯增加，SAHA治療可顯著抑制IH小鼠ROS水平；SAHA對Sham組小鼠心肌ROS水平沒有影響(圖4)。

3 討論

本研究顯示間歇性低氧4周后，小鼠心臟重量/體質量和心臟重量/脛骨長度比值、心肌細胞橫截面積、心肌膠原纖維沉積及心肌ROS顯著增加，提示間歇性低氧可引起心肌重構及氧化應激；應用組蛋白去乙酰化酶抑制劑SAHA干預可明顯改善間歇性低氧引起的心肌損傷及ROS增加。本研究結果表明組蛋白去乙酰化酶抑制劑SAHA可以改善間歇性低氧小鼠的心肌損傷狀況，其可能機制是抑制了細胞內的氧化應激反應。

圖3 SAHA對間歇性低氧小鼠心肌細胞纖維化的影響×400

A:Sham組；B：Sham+SAHA組；C：IH組；D：IH+SAHA組

圖4 SAHA對間歇性低氧小鼠心肌細胞ROS的影響 ×400

A:Sham組；B：Sham+SAHA組；C：IH組；D：IH+SAHA組

心臟重構是心臟對各種心血管疾病中出現的有害刺激的適應性反應，但長期重塑常導致慢性心力衰竭或心源性猝死。 因此，控制心肌重構的進程十分重要。許多研究發(fā)現染色質重塑，特別是HDAC在心臟基因表達調控中起著重要作用。目前已有18種進化保守的哺乳動物HDAC被鑒別出來，并且可分成四類(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)，依據是系統(tǒng)發(fā)育的保守性。此外，已發(fā)現多達1 750個HDAC的非組蛋白靶蛋白，一些很重要的細胞生理過程則通過此類非組蛋白的乙酰化和去乙酰化進行調節(jié)，比如細胞周期、細胞骨架重組、內吞作用與囊泡運輸[5]。由于HDAC活性在生理和病理過程中至關重要，HDAC抑制劑已被開發(fā)為多種疾病的治療選擇，如癌癥、情感障礙和艾滋病等[6]。HDAC抑制劑按結構可分為四類：短鏈脂肪酸(丁酸鹽、丁酸苯酯和丙戊酸)、異羥肟酸鹽(SAHA和TSA)、氨基苯甲酰胺(FK-228)和環(huán)肽。SAHA是光譜HDAC抑制劑，可抑制I類和II類HDAC活性，是首個被美國FDA批準作為HDAC抑制劑的臨床用藥，用于治療皮膚T細胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤[6]。近些年有研究報道， SAHA、TSA以及丙戊酸等等一類HDAC抑制劑可以防止由幾類不同因素導致的心臟肥大[7-9]，有希望成為治療心臟肥厚和與之有關疾病的新藥物方案。

反復間歇性低氧可能導致氧化應激反應加劇與活性氧物質增加，與OSA導致的并發(fā)癥緊密有關[10]，在心肌重構的過程中ROS依賴性途徑有很重要的影響[11]。ROS引起生物作用主要是通過導致DNA、蛋白質、脂質非特異性的氧化損傷或者影響特定的細胞信號傳導通路來實現。ROS細胞內主要來自線粒體電子傳遞鏈與氧化酶，與ROS代謝相關的酶主要包含NAD(P)H氧化酶、黃嘌呤氧化酶與一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)以及過氧化氫酶(CAT)等，其中NADPH氧化酶在心臟重構病理過程中起到相當關鍵的作用[11]。此次研究使用SAHA抑制了間歇性低氧小鼠心臟ROS的增加與心肌重構，其原因是否與NADPH氧化酶相關需要下一步的研究。