低氧損傷下調大鼠腦血管內皮細胞中硫化氫及其介導的RhoA-ROCK通路激活

王良芳，陳志武

缺血性損傷腦血管疾病是全球性的重大公共衛生問題，研究腦缺血損傷的機制一直是臨床和基礎研究較為關注的課題之一。內皮源性硫化氫(hydrogen sulfide, H2S)和一氧化氮(nitric oxide, NO)均可由腦血管內皮細胞產生和釋放并參與缺血性腦損傷過程[1-3]。有研究[4-5]表明缺血性腦損傷可激活RhoA-ROCK(Ras homolog gene family, member A/Rho associated coiled coil-forming kinase)通路，并且內皮源性NO可抑制RhoA-ROCK通路的活性，但迄今尚不清楚缺血性腦損傷中，內皮源性H2S、NO及RhoA-ROCK通路三者中，孰是最先改變的原發因素以及內皮源性H2S是否也可抑制RhoA-ROCK通路的活性。因此，該文觀察了大鼠腦血管內皮細胞中內皮源性H2S、NO及RhoA-ROCK通路三者在低氧性損傷中的動態變化，并探討了內皮源性H2S對RhoA-ROCK通路活性的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑DMEM培養基、內皮細胞生長添加劑、膠原酶Ⅱ購自美國Sigma公司； CCK-8試劑盒、NO檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RhoA活性測定試劑盒購自美國骨架細胞公司；胎牛血清、RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司；小鼠抗β-actin多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Anti-Von Willebrand Factor antibody、兔抗ROCK1和ROCK2抗體、eNOS抗體、CSE抗體購自美國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1大鼠腦血管內皮細胞原代培養實驗動物 SD大鼠，雌雄各半，200～300 g，飼養溫度在(22±2)℃，通風良好，可自由攝水進食。取大鼠5只，10%水合氯醛麻醉后置75%乙醇浸泡3 min。將大鼠置無菌操作臺上，心臟灌流無菌PBS，直至肝臟和舌頭發白。無菌狀態下迅速斷頭取腦，顯微鏡下小心剝離腦血管后轉移至超凈臺中預先加有膠原酶Ⅱ(工作濃度為2 mg/ml)的EP管中，用眼科鑷將腦血管反復剪碎后37 ℃水浴消化30 min，之后離心棄上清液，加入含內皮細胞生長添加劑和20%新生牛血清的DMEM培養液重懸后接種于培養皿，CO2恒溫恒濕孵育箱內培養，24 h后換液去除未貼壁和壞死細胞，之后視細胞生長狀態換液；待80%細胞融合時，選取生長狀態良好的細胞進行傳代，之后按要求分組實驗。

1.2.2免疫熒光染色檢測培養細胞vWF表達 倒置顯微鏡下進行細胞形態學觀察；vWF免疫熒光標記染色：取第二代狀態良好的內皮細胞，胰酶消化后接種于放有載玻片的培養皿中；待細胞爬滿載玻片 80%時，吸棄細胞培養液；用預冷PBS清洗3次，加入預冷的4%多聚甲醛4 ℃固定30 min；PBS 清洗3次，0.1% Triton-100室溫處理10 min; PBS清洗3次，加入封閉液室溫孵育1 h; 加入羊抗大鼠vWF多克隆抗體(1 ∶100) 4 ℃過夜；次日PBS清洗后，加入熒光二抗室溫孵育 1 h；PBS 清洗3次，加入DAPI染色5 min，熒光封片劑封片后激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞染色情況并拍照。

1.2.3低氧模型制備 低氧24 h前培養基換成厭氧培養基，將細胞置于37 ℃、N295%、CO25%的可控厭氧室中。

1.2.4CCK-8法檢測細胞活力 培養瓶中細胞長滿后，經胰酶消化離心重懸后制成單細胞懸液，10% FBS培養液調節細胞濃度為8×104/ml，每孔100 μl接種于5塊96孔板，每板設置空白對照，每組設5個復孔培養，待細胞80%融合，吸棄培養液，PBS清洗2次，加無血清培養液培養24 h后放入N295%、CO25%厭氧培養箱，分別在1、2、4、8、24 h各取出1塊，并取出相應的空白對照板；向每孔加入10 μl CCK-8溶液，震蕩混勻后室溫下孵育1～3 h，酶標儀于450 nm波長處讀取吸光度(optical density，OD)值。細胞活力(%)=(加藥細胞OD-空白OD)/(對照細胞OD-空白OD)×100%。

1.2.5亞硝酸還原法檢測NO含量 細胞培養液中NO代謝產物NO3在硝酸還原酶的作用下生成NO2，NO2酸性條件下與α-萘胺及對-氨基苯磺酸生成紅色偶氮化合物。按說明書要求將試劑和待測樣品分別加入各管后靜置10 min，雙蒸水調零，酶標儀于波長550 nm處測各管OD值。

1.2.6亞甲基藍分光光度法測定H2S含量 醋酸鋅可以吸收硫化氫生成硫化鋅沉淀，酸性條件下硫離子可與三氯化鐵 (FeCl3)和N,N-二甲基-對苯二胺硫酸鹽(NDPA)反應，室溫下生成穩定的亞甲基藍，在波長670 nm處測其OD，根據標準曲線計算出H2S的濃度。

1.2.7G-LISA檢測RhoA活性 按實驗要求分組，待大鼠腦血管內皮細胞長滿約80%后，置于冰上加冰冷裂解液提取蛋白；用蛋白質測定試劑測定蛋白質濃度，平衡各樣本濃度；蛋白質提取物轉移到Rho-GTP-結合蛋白預包被的平板上；400 r/min的振蕩器上4 ℃孵育30 min，洗滌液常溫洗2次，每次甩干；加RhoA一抗，400 r/min的振蕩器上室溫孵育45 min，洗滌液常溫洗2次，每次甩干；加二抗振蕩器400 r/min室溫孵育45 min，洗滌液常溫洗2次，每次甩干；每孔加HRP AB液室溫下15 min后，加入HRP終止緩沖液；酶標儀在波長490 nm處讀取OD值。

1.2.8Western blot檢測不同低氧時間胱硫醚γ-裂解酶(CSE)、內皮型一氧化氮合成酶(eNOS)、Rho激酶ROCK1和ROCK2蛋白含量變化 分別于規定的低氧時間收集相應細胞，加入含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取蛋白。用BCA試劑盒測定總蛋白含量，各組取30 μg等量蛋白煮沸變性，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，封閉后加入兔抗鼠ROCK、eNOS、CSE多克隆抗體一抗(1 ∶1 000)孵育；4 ℃過夜，次日洗膜后加入二抗室溫孵育1 h，洗膜后加入顯色液顯影曝光內皮細胞L顯色，Image J定量分析灰度值。

1.3統計學處理采用SPSS 16.0軟件進行分析。兩組之間獨立樣本進行t檢驗，多組之間單因素方差分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1原代培養內皮細胞鑒定光鏡下原代培養的內皮細胞為梭形或多邊形，旋渦狀生長，呈聚集狀，貼壁牢固(圖1A)。免疫熒光染色顯示：細胞核DAPI染色為藍色熒光，超過90%的細胞胞質存在紅色熒光，說明內皮細胞純度達90%(圖1B)。

圖1 原代培養的大鼠腦血管內皮細胞和免疫熒光鑒定

2.2不同低氧時間對大鼠腦血管內皮細胞活力的影響與control組比較，低氧時間延長細胞活力明顯下降。低氧8 h細胞活力下降了(39.3±4.3)%，低氧24 h后細胞活力下降(60.9±6.1)%，差異均有統計學意義，表明低氧可致大鼠腦血管內皮細胞活力下降。見圖2。

2.3大鼠腦血管內皮細胞低氧后NO、H2S含量及RhoA活性的動態變化大鼠腦血管內皮細胞低氧1、2、4、8、24 h后分別檢測H2S、NO含量及RhoA活性變化，與control組比較，低氧1 h后H2S含量顯著下降(F=4.23，P<0.01)；NO含量在低氧4 h后才開始顯著下降(F=3.19，P<0.05)；RhoA活性低氧8 h后顯著增加(F=7.31，P<0.01)。上述三者變化差距隨時間延長而顯著加大。見圖3。因此定量結果表明在大鼠腦血管內皮細胞低氧中，H2S降低最早，NO次之，RhoA活性增加再次之。

圖2 不同低氧時間對大鼠腦血管細胞活力的影響

與control組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.4低氧不同時間對大鼠腦血管內皮細胞CSE、eNOS、ROCK1和ROCK2蛋白表達的影響Western blot結果顯示：CSE和eNOS蛋白隨低氧時間延長呈持續下降趨勢，低氧4 h時CSE蛋白表達較正常組有了顯著下降；低氧8 h后eNOS蛋白才開始明顯降低；相反ROCK1、ROCK2蛋白表達隨低氧時間延長呈上升趨勢，低氧8 h時ROCK1、ROCK2蛋白表達顯著增加。見圖4。上述各蛋白的變化隨低氧時間延長而顯著加大。

2.5H2S對大鼠腦血管內皮細胞中RhoA活性的影響

2.5.1內源性H2S對RhoA活性的影響 與control組比較，RhoA特異性抑制劑C3轉移酶(C3 Transferase,C3 TF)(25 μg/ ml，8 h)可顯著抑制RhoA活性，差異有統計學意義(P<0.05)，但CSE抑制劑DL-炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine,PPG)(10 mmol/L，4 h)可顯著加RhoA活性，差異有統計學意義(P<0.05)，提示內源性H2S可抑制RhoA的激活。見圖5。

2.5.2內源性和外源性H2S對C3轉移酶誘導的RhoA活性降低的影響 與C3TF組比較，PPG組(10 mmol/L，4 h)可顯著抑制C3TF誘導的RhoA活性降低，差異有統計學意義(P<0.05)，提示內源性H2S均可增強C3TF誘導的RhoA活性降低。H2S供體NaHS(50 μmol/L、30 min)可直接增強C3TF誘導的RhoA活性降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

圖3 大鼠腦血管內皮細胞低氧H2S、NO的含量和RhoA活性的動態變化(n=3)

A：H2S含量動態變化；B：NO含量動態變化；C：RhoA活性動態變化；與 control組比較：*P<0.05,**P<0.01

2.5.3外源性H2S對RhoA活性的影響 外源性H2S供體硫氫化鈉(sodium hydrosulfide,NaHS)10、50和100 μmol/L處理30 min，與control組比較差異有統計學意義,可明顯并呈一定的濃度依賴性地降低RhoA活性，提示外源性H2S也可抑制RhoA的激活。見圖6。

圖4低氧不同時間誘導大鼠腦血管內皮細胞損傷后CSE、eNOS、ROCK1、ROCK2蛋白表達的影響(n=3)

A：CSE表達水平；B：eNOS表達水平；C：ROCK1/2表達水平；與control組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖5 PPG對大鼠腦血管內皮細胞中RhoA活性的影響(n=3)

與control組比較：*P<0.05；與C3 TF組比較：#P<0.05

圖6 NaHS對大鼠腦血管內皮細胞中RhoA活性的影響(n=3)

與control組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

小G蛋白的Rho家族包括RhoA、Rac1和Cdc42[6-7]，其中RhoA是最具特色的蛋白質，它作為分子開關在無活性的GDP結合和活性GTP結構之間循環，與下游靶點相互作用以引發各種細胞反應。研究[8]表明，RhoA-ROCK通路與心血管疾病發病機制有關，如冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、高血壓、心力衰竭等，其抑制劑法舒地爾(fasudil)可以治療許多心血管疾病。

缺血性腦損傷是一嚴重危害人類健康的腦血管疾病，腦血管內皮與缺血性腦損傷的發生密切相關。內皮源性NO和H2S是調節腦血管內皮舒張功能的兩種重要的血管內皮舒張因子，其改變參與了腦缺血損傷過程。在急性腦缺血動物模型中，有研究[9]顯示腦缺血可激活ROCK，而ROCK抑制劑fasudi或Y-27632可抑制ROCK的激活，并減少腦梗死面積。因此，RhoA-ROCK通路的激活也是腦缺血損傷過程中的一個因素。本研究表明在大鼠腦血管內皮細胞低氧損傷過程中，內皮源性H2S和內皮源性NO分別在低氧1 h和4 h時發生了明顯降低，而RhoA-ROCK通路活性在8 h時才有明顯增加。并且Western blot檢測結果也表明內皮源性H2S合成酶CSE和內皮源性合酶eNOS蛋白表達的降低及ROCK蛋白表達的增高分別發生在大鼠腦血管內皮細胞低氧的4 h、8 h和8 h時，也支持著內皮源性H2S降低發生最早。上述的實驗結果還表明內皮源性H2S在低氧1 h時就明顯降低了，但其合成酶CSE蛋白表達在4 h時才顯著降低，提示在大鼠腦血管內皮細胞低氧過程中，H2S合成酶CSE的活性也有顯著降低，并且早于其蛋白表達的下降。因此，本研究結果表明在大鼠腦血管內皮細胞低氧損傷過程中，內皮源性H2S降低發生最早，其次為NO，而RhoA-ROCK通路的激活遲于前二者。

在低氧損傷過程中，大鼠腦血管內皮中RhoA-ROCK通路改變遲于NO和H2S的降低，但前者的改變是否由NO和H2S降低引起的呢？有研究[10]表明NO可阻止RhoA從細胞質轉位到細胞膜上，從而抑制RhoA的活化。本研究表明內源性H2S和外源性H2S均可抑制RhoA的激活。并且內源性和外源性H2S均可增強C3 TF誘導的RhoA活性降低，也支持著H2S可抑制RhoA的激活。因此，結合前述的內皮源性H2S降低發生在前，RhoA-ROCK通路激活發生在后，可以認為在低氧損傷過程中，大鼠腦血管內皮細胞中RhoA-ROCK通路的激活可能是繼發于H2S的降低。至于內皮源性H2S與NO的相互作用已有大量文獻報道，此處不再贅述了。

綜上所述，在大鼠腦血管內皮細胞低氧損傷過程中，內皮源性H2S降低發生最早，其次為NO，而RhoA-ROCK通路激活發生在后，可能是繼發于H2S的降低。