Omentin-1基因沉默后對結腸癌細胞增殖和凋亡的影響

李雪婷，萬麗娟，張群慧，陳明衛，夏同佳，許 敏，唐松濤

肥胖與結腸癌[也稱為結直腸癌(colorectal cancer，CRC)]之間的關系目前已有很多相關報道，肥胖患者CRC發生率較非肥胖人群明顯增高[1]。近年來有許多關于脂肪因子(如瘦素、脂聯素、內脂素等)與CRC之間的研究，網膜素(Omentin)是一種可增加胰島素敏感性的脂肪因子，在血循環中Omentin-1是Omentin的主要表現形式，但目前關于Omentin與CRC之間的關系的研究較少。有研究[2]顯示CRC患者中血清Omentin-1水平高于正常對照人群，而且這種改變與肥胖無關，提示CRC患者血清中高水平的Omentin-1與肥胖人群脂肪組織的分泌作用關系不大。課題組的前期研究[3]表明不同濃度的外源性Omentin-1分別干預SW480結腸癌細胞24 h、48 h，Omentin-1可促進SW480結腸癌細胞增殖、抑制其凋亡，效應呈濃度和時間依賴關系。 該研究通過體外實驗RNA干擾沉默Omentin-1基因，進一步探索Omentin-1基因沉默后SW480結腸癌細胞增殖和凋亡的變化。

1 材料與方法

1.1材料人SW480結腸癌細胞株購自中科院上海細胞庫；siRNA購自上海吉碼制藥技術有限公司；RNAiMAX、TRIzol購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購自美國Thermo公司；PCR擴增試劑盒購自日本TaKaRa公司；MTT、DMSO購自德國Sigma公司； Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒購自上海貝博生物公司；胎牛血清購自杭州四季青生物科技公司；RPMI-1640培養基購自美國HyClone公司；引物購自上海生物工程有限責任公司；Opti-ME購自美國Gibco公司。

1.2人SW480結腸癌細胞培養人SW480結腸癌細胞培養用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基常規置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，1 ～ 2 d換培養液，細胞生長至85%融合時傳代。細胞在進行轉染前1 d更換成無抗生素的RPMI-1640培養基。

1.3人SW480結腸癌細胞的Omentin-1基因轉染將生長至對數生長期的SW480結腸癌細胞消化后收集細胞，以每孔2×105個細胞均勻鋪在24孔板中，每孔500 μl無雙抗的RPMI-1640培養基，24 h后，當細胞生長至匯合度為60% ～ 80%時進行轉染。FAM-siRNA上游引物序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游引物序列：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。設置FAM-siRNA轉染終濃度為10、30、50、80、100 mmol/L 5組，分別取相應體積的FAM-siRNA稀釋于25 μl Opti-MEM培養基中，另每組各取1.5 μl轉染試劑RNAiMAX稀釋于25 μl Opti-MEM培養基中，分別混勻后室溫靜置5 min，然后將兩種稀釋液混合后室溫靜置10 min，將混合液逐滴加入到24孔板中，輕輕搖晃24孔板使混合液與細胞充分接觸，培養箱中避光孵育24 h后在熒光顯微鏡下觀察轉染情況。整個轉染過程避光操作，使用無酶移液槍頭和離心管。

1.4RT-PCR鑒定轉染后Omentin-1基因沉默變化針對人Omentin-1基因的siRNA(human Omentin-1-siRNA)上游引物序列：5′-GCACUGAGAAUGGUGUUAUTT-3′，下游引物序列：5′-AUAACACCAUUCUCAGUGCTT-3′，陰性對照序列SiRNA：上游引物序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游引物序列：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′，將生長至對數生長期的SW480結腸癌細胞消化后收集細胞，以每孔5×105個細胞均勻鋪在6孔板中，每孔加入2 ml無雙抗的RPMI-1640培養基，實驗分為轉染組(轉染目的基因siRNA)、陰性組(轉染無關序列siRNA)、正常對照組(未轉染組)、MAX組(只含轉染試劑)。按照siRNA轉染終濃度50 nmol/L(前一步已驗證細胞在siRNA終濃度為50 nmol/L時轉染效率最高)轉染含有Omentin-1基因的siRNA，溫箱中孵育24 h后，分別收集每組細胞，按照TRIzol一步法提取RNA，測定每組RNA濃度和純度，然后根據逆轉錄試劑盒的步驟合成cDNA。human Omentin-1上游引物序列：5′-AGGAAAGTGCAGCTGAGACT-3′，下游引物序列：5′-GGAGACG AAGAACAGGTCCA-3′，擴增片段長度138 bp；GAPDH上游引物序列：5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，下游引物序列：5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′，擴增片段長度138 bp；擴增體系25 μl，分別為上下游引物各1 μl，cDNA 2 μl，DEPC水8.5 μl，SYBR Premix 12.5 μl。擴增程序：95 ℃、 30 s預變性，95 ℃、 5 s，60 ℃、 30 s，40個循環。讀取每個反應的Ct值，2-ΔΔCt表示基因相對表達量。

1.5增殖實驗將生長至對數生長期的SW480結腸癌細胞消化后收集細胞，以每孔6×104個細胞均勻鋪在96孔板中，每孔加入100 μl無雙抗的RPMI-1640培養基，24 h后進行轉染，轉染后24 h，棄去培養基，每孔加入180 μl不含血清和抗生素的RPMI-1640培養基和20 μl MTT(濃度為5 mg/ml)，避光孵育4 h，去掉上清液，每孔加入150 μl DMSO，立即在酶標儀490 nm波長下檢測吸光度(optical density, OD)值。實驗重復3次，每次設4個復孔。

1.6凋亡實驗將生長至對數生長期的SW480結腸癌細胞消化后收集細胞，以每孔5×105個細胞均勻鋪在6孔板中，每孔加入2 ml無雙抗的RPMI-1640培養基，24 h后進行轉染，轉染后24 h，用不含EDTA的胰酶消化收集細胞，預冷的PBS洗細胞2次，加入400 μl結合液重懸細胞，再加入5 μl Annexin V-FITC，混勻后，4 ℃避光孵育15 min，加入10 μl PI液，混勻后4 ℃避光孵育5 min，立即在流式細胞儀上檢測各組細胞凋亡率，實驗重復3次。采用Flowjo V7軟件分析結果。

2 結果

2.1轉染效率鑒定使用FAM-siRNA轉染細胞24 h后在熒光顯微鏡下觀察，鏡下可見視野內帶熒光的細胞。細胞在siRNA終濃度為50 nmol/L 時轉染效率最高。見圖1。

圖1 熒光顯微鏡下觀察細胞轉染情況 ×40

2.2PCR鑒定基因沉默結果與正常對照組比較，陰性組和MAX組Omentin-1 mRNA相對表達量下降，差異無統計學意義(P>0.05)；分別與正常對照組、陰性組和MAX組比較，轉染組Omentin-1 mRNA相對表達量下降，差異均有統計學意義(F=8.044，P<0.05)。見圖2。

2.3細胞增殖實驗結果與正常對照組比較，陰性對照組和MAX組OD值沒有明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)；分別與正常對照組、陰性組、MAX組比較，轉染組OD值下降，差異均有統計學意義(F=8.499，P<0.05)。見圖3。

2.4細胞凋亡結果與正常對照組比較，陰性對照組和MAX組凋亡率沒有明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)；分別與正常對照組、陰性組、MAX組比較，轉染組凋亡率升高，差異均有統計學意義(F=29.366，P<0.05)。見圖4。

圖2 Omentin-1基因mRNA沉默效果鑒定

與正常對照組比較：*P<0.05；與陰性組比較：△P<0.05；與MAX組比較：#P<0.05

圖3 細胞增殖實驗結果

與正常對照組比較：*P<0.05；與陰性組比較：△P<0.05；與MAX組比較：#P<0.05

3 討論

CRC是導致全球癌癥患者死亡的第三大常見的癌癥，研究[4]表明肥胖(特別是腹型肥胖)是CRC發生的高風險因素，研究[5-6]顯示隨著身體質量指數和腰圍的增加，CRC患病的風險也將提高。目前有關肥胖與CRC的研究[7]表明，肥胖導致CRC風險增加可能與肥胖導致的慢性低度炎癥狀態，或與體內一些激素水平異常有關，如胰島素、胰島素樣生長因子等。

近年來人們逐漸認識到脂肪組織分泌的脂肪因子可能在CRC的發病過程中發揮關鍵作用。網膜素是一種內臟脂肪表達的可增加胰島素敏感性的脂肪因子，有兩個結構基因：Omentin-1和Omentin-2，在血循環中，Omentin-1是主要的表現形式。臨床研究[8]表明，肥胖人群中血清網膜素水平及網膜組織網膜素的基因表達水平均降低，且網膜素表達水平與身體質量指數及腰圍等肥胖指標呈負相關。盡管肥胖患者Omentin-1水平明顯降低，但是目前臨床研究未能證實Omentin-1是肥胖患者發生CRC的獨立危險因素，因此，在體外實驗中，通過敲除CRC細胞株Omentin-1基因，從而降低Omentin-1水平，將有助于更清晰地闡明Omentin-1在CRC發生過程中的作用。

本研究結果顯示，SW480細胞中Omentin-1基因被沉默后，Omentin-1表達明顯降低，轉染組凋亡率明顯上升、增殖率明顯下降，提示Omentin-1促進CRC細胞增殖、抑制其凋亡。Aleksandrova et al[9]的前瞻性群組研究表明，Omentin-1水平與CRC之間有密切的關系，高水平的Omentin-1更容易發生CRC，網膜素-1可以作為預測CRC風險的新型標志物，Szydo et al[10]研究顯示Omentin-1蛋白在CRC中表達增加及Omentin-1基因在間皮瘤中表達增加，且Fazeli et al[2]研究也顯示CRC患者Omentin-1水平明顯高于健康對照者，與本研究結果一致。

但是，也有研究[11]顯示，無糖尿病的Ⅲ期CRC患者進行手術和奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶等化學藥物治療后，Omentin-1水平明顯升高。與此同時，Kimet al[12]研究表明intelectin-1水平的升高可以作為Ⅳ期癌癥預后較好的標志。Maeda et al[13]通過對TMEM207(一種不典型的跨膜蛋白)研究表明Omentin-1水平的下調可能會導致進展期CRC患者預后不良。然而這與本課題組及Aleksandrova et al[9]、Fazeli et al[2]的研究結果相反。

圖4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

有研究[13]表明脂肪因子在促進腫瘤細胞增殖或凋亡效應上可能取決于不同癌細胞類型；Somasundar et al[14]研究顯示瘦素可促進乳腺癌、前列腺癌細胞的增殖，但促進腺癌Mia-PaCa和PANC-1細胞凋亡；Zhang et al[15]研究結果顯示Omentin-1可通過調節沉默信號調控因子(Sirt1)依賴的p53去酰化作用，促進肝癌細胞的凋亡；因此，Omentin-1對其他CRC細胞系(如CaCo-2、HCT116)在增殖凋亡方面可能也會產生不同的效應。關于Omentin-1對CRC細胞的作用有爭議，還有一種解釋是可能與Omentin-1在不同類型致癌過程中體現的“Janus-faced”病理生理學特性有關。因此Omentin-1與CRC細胞以及CRC之間的關系還需進一步的研究。